文章信息
文章題目：Longitudinal single cell transcriptional and epigenetic mapping of effector, memory, and exhausted CD8 T cells reveals shared biological circuits across distinct cell fates
期刊：bioRxiv
鏈接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.27.485974v1
摘要
初始CD8 T細胞經(jīng)受抗原刺激后可以增殖分化為效應（Teff）箱锐、記憶（Tmem）或耗竭（Tex）CD8 T細胞风响。這些不同的分化發(fā)育途徑通常伴隨著各自特異的轉錄和表觀遺傳特征的改變，從而賦予不同CD8 T細胞亞群特異的功能特性和免疫治療潛能谒亦。目前倔叼，人們對CD8 T細胞的不同分化發(fā)育軌跡的潛在分子機制和Teff汗唱、Tmem和Tex細胞亞群的異質性特征仍知之甚少宫莱。在本文中丈攒，我們基于淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）的急性和慢性感染模型，使用單細胞scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)的整合分析來解決這些問題。我們的分析結果揭示了新的細胞亞群子集巡验，包括一個耗竭Tex細胞子群际插，它高表達NK細胞相關基因，以及在急性和慢性感染中鑒定到多個不同的TCF1+ 干/祖細胞樣細胞亞群显设。這些數(shù)據(jù)還揭示了PD1 通路阻斷對Tex細胞子集重塑的見解框弛，并確定了細胞應激調節(jié)因子 Btg1 在 Tex 細胞分化中的關鍵作用。最后捕捂，我們的結果還強調了具有不同染色質景觀的CD8 T細胞在不同分化發(fā)育途徑中可以使用共享的生物學特征瑟枫，如細胞毒性或干細胞/祖細胞性。因此指攒，本研究的單細胞轉錄組和染色質可及性圖譜闡明了CD8 T細胞發(fā)育生物學和調控 Teff慷妙、Tmem 和 Tex 細胞亞群分化的潛在分子機制。
背景
初始CD8 T細胞（Tnai）經(jīng)受抗原刺激后允悦，在急性感染或疫苗接種過程中可以增殖分化為效應（Teff）和記憶（Tmem）CD8 T細胞膝擂，而在慢性感染、癌癥或自身免疫疾病發(fā)展過程中會分化為功能失調的耗竭（Tex）CD8 T細胞隙弛。近些年來架馋，人們發(fā)現(xiàn)CD8 T細胞在不同分化發(fā)育途徑中通常伴隨著不同的轉錄和表觀遺傳特征的改變。然而全闷，目前人們對不同CD8 T細胞亞群的異質性特征叉寂，以及細胞命運分化決定的潛在分子機制仍知之甚少。
在急性感染或疫苗接種的過程中总珠，激活的CD8 T細胞會增殖分化為效應Teff細胞從而清除病原體以控制感染办绝，并在清除病原后進一步分化為記憶Tmem細胞以維持長期的免疫保護。在CD8 T細胞的分化過程中姚淆，根據(jù)細胞表面蛋白標記孕蝉、功能特性和分化潛能，人們已經(jīng)鑒定出了不同的T細胞亞群腌逢。例如降淮，根據(jù)KLRG1、CD127搏讶、CX3CR1或其他分子的表達佳鳖，人們鑒定出了不同的Teff和Tmem細胞亞群，它們具有不同的效應活性和增殖分化潛能媒惕。然而系吩，這些不同細胞亞群分化發(fā)育的潛在轉錄和表觀遺傳特征仍缺少詳細的研究。
在慢性感染妒蔚、癌癥和自身免疫疾病的發(fā)展過程中穿挨，持續(xù)的抗原刺激會誘導CD8 T細胞向耗竭Tex細胞分化月弛。類似于Teff和Tmem細胞，Tex細胞亞群也存在較大的異質性科盛。目前帽衙，人們對Tex細胞亞群的功能和分化發(fā)育機制有著較大的研究興趣，因為Tex細胞亞群中的特定子集可以響應免疫治療贞绵，包括抗PD-1和過繼T細胞療法厉萝。盡管人們已經(jīng)定義了多個不同的Tex細胞亞群，但大多數(shù)研究主要定義了以下幾種細胞亞群：Tex祖細胞（或干細胞樣榨崩、前體細胞）谴垫，中間過渡態(tài)Tex細胞和終末分化的Tex細胞。作為一種特殊的T細胞亞群母蛛，Tex細胞與Teff和Tmem細胞相比有著自己獨特的表觀遺傳特征弹渔，并且受到轉錄因子TOX的轉錄調控。盡管存在著較大的差異溯祸，Tex細胞與Teff和Tmem細胞仍然共享著一些共有的特征肢专。如，Teff和Tex細胞都存在著細胞毒性焦辅，盡管Tex細胞的細胞毒性更小一些博杖，Tmem和Tex細胞亞群的一些特定子集都可以進行長期的維持，盡管他們依賴不同的信號途徑進行穩(wěn)態(tài)維持筷登。
目前剃根，人們對于Teff、Tmem和Tex細胞的分化發(fā)育途徑和異質性程度前方，以及潛在的轉錄和表觀遺傳調控機制仍知之甚少狈醉。部分原因是因為人們沒有對不同分化發(fā)育途徑中的CD8 T細胞進行配套的轉錄組和表觀染色質可及性研究。因此惠险，依賴少數(shù)表面蛋白的流式細胞術定義不同的Teff苗傅、Tmem和Tex細胞亞群是否真的能反應CD8 T細胞亞群的異質性仍有待確定。例如班巩，具有相同染色質可及性特征的細胞可能具有不同的細胞激活狀態(tài)以及表型異質性渣慕。甚至，一些Teff和Tmem細胞亞群與Tex細胞亞群具有相同的蛋白表達特征抱慌，如前體細胞相關的轉錄因子TCF1逊桦。因此，TCF1表達的細胞是否具有相同的潛在發(fā)育程序抑进，以及不同發(fā)育途徑中的CD8 T細胞是否依賴于TCF1轉錄回路仍有待研究强经。
為了解決這些問題，本研究基于LCMV病毒的急性和慢性感染模型寺渗，使用單細胞scRNA-seq和scATAC-seq測序技術縱向探究不同分化時間點的Teff匿情，Tmem和Tex細胞兰迫。我們的數(shù)據(jù)解析了不同CD8 T細胞亞群的異質性特征，鑒定了主要CD8 T細胞分化發(fā)育途徑的基因表達和染色質可及性模式码秉。通過scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)具有不同轉錄狀態(tài)的CD8 T細胞存在著相同的染色質可及性特征鸡号。我們的研究還發(fā)現(xiàn)了新的Teff转砖、Tmem和Tex細胞亞群的子集，包括一群表達NK細胞相關基因的Tex細胞鲸伴，它們具有免疫治療響應的特征府蔗。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了多群具有不同表觀染色質可及性特征的TCF1表達細胞汞窗。同時姓赤，我們還發(fā)現(xiàn)慢性感染早期出現(xiàn)的Tex前體細胞和晚期的Tex前體細胞存在較大的差異，并且它們與急性感染中表達TCF1的Tmem前體細胞和成熟的Tmem細胞之間明顯不同仲吏。最后不铆，我們還確定了細胞應激調節(jié)因子 Btg1是Tex細胞分化的新型調控基因」簦總之誓斥，我們的研究構建了不同CD8 T細胞亞群的單細胞轉錄組和表觀染色質可及性圖譜，為探究Teff许帐、Tmem和Tex細胞亞群分化發(fā)育的潛在分子調控機制提供了研究基礎劳坑。
研究結果
不同分化狀態(tài)的CD8 T細胞的轉錄組和表觀組圖譜
為了構建CD8 T細胞在不同分化發(fā)育途徑中的轉錄組和表觀組圖譜，我們使用LCMV病毒急性感染模型（LCMV Armstrong成畦，Arm）產(chǎn)生病毒特異性的Teff和Tmem細胞距芬，使用LCMV病毒慢性感染模型（LCMV clone 13，C13）產(chǎn)生Tex細胞循帐。我們將P14（TCR transgenic gp33-specific） CD8 T細胞過繼轉移到同源受體小鼠中框仔，然后分別使用LCMV Arm和C13病毒進行急性和慢性感染，收集感染后第8拄养，15和30天的P14細胞進行單細胞scRNA-seq和scATAC-seq測序分析存和。經(jīng)數(shù)據(jù)預處理、質控過濾和降維聚類分群后衷旅，得到了CD8 T細胞在不同分化時間點的單細胞轉錄組和表觀組圖譜捐腿。可以看到柿顶，CD8 T細胞在急性感染（Arm）和慢性感染（C13）中不同時間點的細胞明顯的區(qū)分開來茄袖，并且scATAC-seq數(shù)據(jù)區(qū)分不同時間點的細胞更清晰。除去初始CD8 T細胞（Tnai）嘁锯，我們將scRNA-seq數(shù)據(jù)聚類分群了18個cluster宪祥，將scATAC-seq數(shù)據(jù)聚類分群了16個cluster聂薪。其中，大多數(shù)cluster只包含了一種感染模式的特定時間點的細胞蝗羊，少數(shù)cluster含有混雜時間的細胞藏澳。
接下來，我們想探究CD8 T細胞在不同分化發(fā)育途徑的染色質可及性變化特征耀找。我們查看了CD8 T細胞分化的3個關鍵基因：Tox翔悠，Pdcd1和Tcf7。其中野芒，Tox是Tex細胞分化的一個關鍵轉錄因子蓄愁，在慢性感染C13樣本的不同時間點中它的表達水平都很高，同時scATAC-seq數(shù)據(jù)顯示Tox基因位點的染色質可及性也在逐步增高狞悲。Pdcd1基因編碼抑制性受體PD-1撮抓，在慢性感染C13樣本中高表達并且有著特殊的染色質可及性特征，包括一個已報道的為Pdcd1基因TSS上游~23.8kb處的增強子元件摇锋。Tcf7在初始CD8 T細胞中高表達丹拯，并在隨后的時間點中表達水平降低，該基因位點的染色質可及性在Tnai細胞中最高荸恕，在不同感染的其他時間點中它的染色質可及性有著復雜的特征咽笼。因此，我們可以鑒定出Teff戚炫、Tmem和Tex細胞亞群中關鍵基因的不同染色質可及性特征剑刑。
Figure 1. Single cell transcriptional and accessible chromatin landscape of memory and exhausted CD8 T development
急性感染過程中CD8 T細胞基于細胞毒性潛力分化為兩種主要的細胞類型
為了探究急性感染過程中Teff和Tmem細胞的分化發(fā)育軌跡，我們首先基于scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定了特定的細胞亞群双肤。在d8樣本中施掏，我們鑒定到了3個細胞cluster：記憶前體細胞（MP）、效應T細胞（Eff）和細胞毒性T細胞（CTL）茅糜，CTL細胞高表達Klrg1七芭，Cx3cr1和細胞毒性基因，它們可能是KLRG1+CD127-的短壽效應T細胞（SLEC）的一個亞群蔑赘。在d15樣本中狸驳，我們也鑒定到了3個細胞cluster，分別命名為過度T細胞：Trans I缩赛，Trans II和Trans CTL耙箍。在d30樣本中，主要鑒定了一個記憶T細胞亞群（Mem）酥馍。同樣的辩昆，我們基于scATAC-seq數(shù)據(jù)進行細胞亞群的鑒定，我們使用基因的染色質可及性表示基因活性旨袒，根據(jù)不同的基因活性鑒定特定的細胞亞群汁针。我們發(fā)現(xiàn)scATAC-seq數(shù)據(jù)鑒定到的細胞亞群和scRNA-seq鑒定的細胞亞群部分重疊术辐，如d8 Eff和CTL細胞。但是施无，仍有一些細胞cluster只在scATAC-seq數(shù)據(jù)中鑒定出辉词，包括Mem-CTL，表明染色質可及性可以提供細胞分化模式的額外特征猾骡。
通過基因活性分析瑞躺，我們將scATAC-seq數(shù)據(jù)的8個cluster分成了兩大類群：CTL和non-CTL，它們在細胞毒性基因如Gzma卓练、Gzmb和Klrc1（NKG2A）處具有不同的染色質科技型特征隘蝎。其中购啄，CTL細胞類群主要包括d8樣本的CTL襟企，d15樣本的Trans CTL I和Trans CTL II，以及d30樣本的Mem-CTL細胞群狮含，而non-CTL細胞類群包括d8樣本的Eff和MP顽悼，d15樣本的Trans Mem和d30樣本的Mem細胞群。這兩大細胞類群具有不同的染色質可及性特征几迄，如Ccr7基因在non-CTL細胞類群中可及性較高蔚龙，而Klrg1基因在CTL細胞類群中可及性較高。值得注意的是映胁，盡管我們在scATAC-seq的d30樣本中鑒定到了兩群不同的記憶CD8 T細胞（Mem和Mem-CTL）木羹，但是在單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中只鑒定到一個記憶CD8 T細胞群〗馑铮總之坑填，基于scATAC-seq數(shù)據(jù)，我們在急性感染模型中鑒定到了兩大類具有不同表觀遺傳特征的細胞類群弛姜，它們分別具有細胞毒性和記憶性的特征脐瑰。這種分支分化模式是在d8樣本中出現(xiàn)的，與記憶和效應CD8 T細胞的早期命運分化決定觀念相一致廷臼。
為了進一步探究這兩大類具有不同表觀遺傳特征細胞類群的潛在轉錄調控因子苍在，我們對CTL和non-CTL細胞類群的差異可及性peak進行轉錄因子TF motif的富集分析。結果發(fā)現(xiàn)一些TFs主要富集到特定的細胞cluster中荠商，如AP1 motifs在Mem細胞cluster中富集寂恬，ZEB1, TCF3(E2A), TCF12(HEB)和SNAI motif主要富集到non-CTL細胞cluster中（包括Eff，MP莱没，Trans Mem和Mem）掠剑。基于基因活性分析郊愧，我們發(fā)現(xiàn)轉錄因子Zeb1主要在non-CTL細胞類群中高表達朴译，而Zeb2則在CTL細胞類群中高表達井佑。TF motif富集分析結果也表明ZEB1 motif強烈地富集到non-CTL細胞類群中。這些結果與前期發(fā)現(xiàn)的Zeb1和Zeb2分別在記憶Tmem和效應Teff細胞形成和功能分化中的作用相一致眠寿。因此躬翁，我們的結果表明Zeb2在T細胞毒性功能形成中發(fā)揮著重要作用，并強調了Zeb2-Zeb2 轉錄因子對在急性感染模型中CD8 T細胞CTL和non-CTL細胞類群分支分化中的重要功能盯拱。
Mem-CTL（包括Trans CTL I和Trans CTL II）細胞類群可能是CTL效應細胞在病毒清除后殘留的能持續(xù)存在的細胞群盒发。為了驗證這個猜想，我們檢測更晚時期的CD8 T細胞中是否仍然存在Mem和Mem-CTL細胞類群狡逢。因此宁舰，我們收集了急性感染條件下d60和d200天的病毒特異性CD8 T細胞進行單細胞scATAC-seq測序分析。的確奢浑，在d60樣本中蛮艰，我們鑒定到了兩種不同染色質可及性特征的細胞類群，將其命名為效應記憶EM和EM-CTL細胞雀彼。其中壤蚜，EM-CTL細胞在細胞毒性相關基因如Gzma、Gzmb和NK細胞受體基因處的染色質可及性增強。同時，在d60樣本中更耻，我們還鑒定到了組織駐留記憶TRM和中央記憶CM細胞孔轴。然而，在d200樣本中，我們只鑒定到了一群CM細胞（CM d200）和少量的TRM細胞。其中，d60和d200樣本中的CM細胞聚類到不同的cluster中萧豆，表明記憶CD8 T細胞的染色質可及性特征隨著時間的持續(xù)而不斷變化。TF motif富集分析發(fā)現(xiàn)ZEB1 motif在CM和TRM細胞中顯著富集蟹漓，而在EM和EM-CTL細胞中幾乎沒有富集炕横。這些結果表明，d30樣本中存在的Mem-CTL細胞在持續(xù)一個月后的d60樣本中仍然存在葡粒，而在d200樣本中幾乎檢測不到份殿。總之嗽交，我們的結果解析了急性感染條件下CD8 T細胞向記憶和效應T細胞分化的發(fā)育軌跡卿嘲，表明長壽記憶CD8 T細胞的效應功能在急性感染的早期就已被表觀遺傳特征所決定。
Figure 2. Acute-resolving infection generates two branches of effector and memory CD8 T cells distinguished by epigenetic cytolytic potential
單細胞轉錄組數(shù)據(jù)揭示Tex細胞亞群的轉錄異質性
不同于急性感染模型夫壁，CD8 T細胞在慢性感染或癌癥中會誘導分化為耗竭Tex細胞拾枣，它們通常會高表達一些抑制性受體，并伴隨著效應功能的減弱。目前梅肤，人們已經(jīng)鑒定出了多種不同的Tex細胞亞群司蔬，包括耗竭前體細胞，中間過渡態(tài)耗竭細胞和終末分化的耗竭細胞姨蝴。然而俊啼，耗竭Tex細胞的整體異質性特征仍缺少全面的了解。為了探究不同分化時間點中Tex細胞的發(fā)育途徑和異質性特征左医，我們將慢性感染不同時間的CD8 T細胞進行單細胞scRNA-seq測序分析授帕。在d8樣本中，我們聚類分出了4個細胞cluster浮梢。其中一個細胞cluster包含效應樣細胞（Eff-like）跛十，它有別于急性感染中的Eff細胞cluster。將Cl13 Eff-like和Arm Eff細胞cluster進行基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)Tox秕硝，Lag3芥映，Rgs16和Ifi27l2a基因在Cl13 Eff-like細胞cluster中高表達，而Klrg1缝裤，Ccr2和Selplg基因則在Arm Eff細胞cluster中高表達屏轰。代謝通路富集分析結果表明T細胞激活相關通路在Arm Eff細胞中富集颊郎，而病毒響應基因如I型干擾素響應相關通路在Cl13 Eff-like細胞中富集憋飞。同時，我們還發(fā)現(xiàn)了兩群處于增殖狀態(tài)的細胞cluster姆吭，大多數(shù)增殖的細胞分布在d8 Eff-like細胞cluster中榛做。在d8 Cl13細胞群中，有一群耗竭前體Exh-Pre細胞内狸，它與急性感染下的MP細胞具有相似的基因表達特征检眯，如Il7r，Id3昆淡，Tcf7锰瘸，Lef1，Sell和Ccr7昂灵。然而避凝，該群細胞還高表達耗竭相關基因如Tox，Tox2眨补，Pdcd1和Lag3管削，與前期研究發(fā)現(xiàn)的在慢性感染早期就存在耗竭命運決定的細胞群的結果相一致。
接下來撑螺，我們繼續(xù)探究耗竭晚期時間點中Tex細胞群的異質性特征含思。我們在d15和d30樣本中鑒定到了7個細胞cluster。其中，在這些時間點中有一群耗竭祖細胞Exh-Prog與d8的Exh-Pre細胞具有相似的轉錄特征含潘，但是它也存在著自己獨特的轉錄特征饲做，如高表達Eomes和Fos基因。同時遏弱，我們還鑒定到了兩群高表達熱激活蛋白的Exh-HSP細胞群和干擾素響應基因（ISG）艇炎，其他兩群細胞高表達多種抑制性受體，類似于以前定義的終末耗竭Tex細胞腾窝∽鹤伲基于無監(jiān)督聚類，終末耗竭Tex細胞分出了兩個不同的細胞群Exh-term和Exh-TermGzma虹脯，后者高表達細胞毒性基因如Gzma驴娃。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一群以前未鑒定到的Tex細胞循集，它們高表達NK細胞相關基因唇敞，我們將其定義為Exh-KLR細胞。由于Exh-Int與Exh-KLR和Exh-HSP細胞cluster處在鄰近的細胞群中咒彤，我們認為這些細胞類群可能都是處于中間過渡態(tài)Tex細胞疆柔。為了進一步探究新鑒定的Exh-KLR細胞亞群的轉錄特征，我們將Exh-KLR細胞和Exh-Int和Exh-Term細胞進行差異比較分析镶柱。結果發(fā)現(xiàn)Exh-KLR細胞亞群會高表達NK細胞相關基因（Klrs旷档，F(xiàn)cgr2b等），細胞毒性基因（Gzma和Gzmb）歇拆，細胞遷移相關基因（S1pr5和Itgb7）鞋屈，以及一些轉錄因子（Zeb2，Klf2故觅，Klf3和Id2）厂庇。這些結果表明Exh-KLR細胞群相比于其他Tex細胞亞群具有更強的細胞毒性潛能。近期有研究表明高表達NK細胞受體的CD8 T細胞具有臨床免疫治療潛能输吏。
接下來权旷，我們想知道這些Tex細胞亞群，包括Exh-KLR細胞贯溅，是否可以使用流式細胞術鑒定出拄氯。基于病毒特異性的P14 CD8 T細胞盗迟，在d8時間點坤邪，Exh-Pre和Eff-like細胞群可以通過LY108和TIM3蛋白區(qū)分出。在d15和d30時間點罚缕，可以使用分層畫門的策略鑒定出主要的細胞群艇纺。其中，Exh-Prog細胞可以定義為LY108+CX3CR1-。在LY108-CX3CR1+細胞群里黔衡，Exh-KLR細胞可以通過KLRC1(NKG2A)和KLRD1(CD94)的表達區(qū)分開蚓聘，而Exh-Int細胞定義為NKG2A-CD94-。在LY108-CX3CR1-細胞群里盟劫，Exh-Term和Exh-Termgzma細胞可以通過GZMA的表達進行區(qū)分開夜牡。與單細胞轉錄組表達數(shù)據(jù)相一致的是，Exh-Termgzma細胞也高表達CD244(2B4)蛋白侣签。因此塘装，基于細胞表面蛋白標記，我們可以清楚地區(qū)分出慢性感染中的不同Exh-Pre, Eff-like, Exh-Prog, Exh-Int, Exh-KLR, Exh-Term和 Exh-TermGzma細胞影所。同時蹦肴，我們還發(fā)現(xiàn)這些細胞群的比例隨著感染時間的推移而不斷變化，特別是Exh-KLR細胞從d15到d30天間不斷增加猴娩。在RNA水平阴幌，Exh-KLR細胞高表達一些NK細胞受體基因，包括KLRB1C(NK1.1)和KLRA9(Ly49l)卷中。隨著時間的推移矛双，這些蛋白的表達逐漸增加。在d30天時蟆豫，Exh-KLR細胞群存在一定的異質性议忽，可以通過這些NK細胞受體蛋白的表達進行區(qū)分。NK細胞受體基因的表達不是慢性感染Cl13中特有的无埃，急性感染Arm中的大多數(shù)CD8 T細胞在d8和d30天時也表達KLRC1和KLRD1徙瓶，這與先前研究報道的在病毒和細菌感染的CD8 T細胞中也高表達NK細胞受體基因的結果相一致毛雇。鑒于它們都表達NK細胞受體基因和效應分子嫉称，我們接下來將慢性感染中的Exh-KLR細胞與急性感染中的CTL和Mem-CTL細胞進行差異分析。結果發(fā)現(xiàn)Exh-KLR細胞與這兩群具有細胞毒性的細胞之間存在大量的差異表達基因DEGs灵疮，包括Tox织阅，Bcl2和Lag3等，它們在Exh-KLR細胞中高表達震捣。這些結果表明Exh-KLR細胞與急性感染中的Teff和Tmem細胞是不一樣的荔棉。同時，這結果也表明了盡管慢性感染中的Exh-KLR細胞和急性感染中的CTL和Mem-CTL細胞有著不同的分化路徑蒿赢，但是它們之間共享了表達NK細胞受體相關基因的轉錄程序润樱。
Figure 3. Exhausted CD8 T cells are transcriptionally heterogenous including a distinct subset characterized by expression of NK receptors
單細胞表觀組數(shù)據(jù)揭示4種不同的Tex細胞亞群
與Teff和Tmem細胞相比，耗竭Tex細胞具有獨特的表觀遺傳發(fā)育特征羡棵，至少部分是由轉錄因子TOX驅動的壹若。然而，這些Tex細胞群的表型和轉錄異質性與潛在的染色質景觀的異質性之間的關系仍不太清楚。這是一個關鍵的問題店展，因為Tex細胞獨特的表觀遺傳景觀限制了細胞的可塑性和對免疫治療方法的敏感性养篓。為了解決這些問題，我們接下來想知道這些Tex細胞亞群是否在單細胞scATAC-seq數(shù)據(jù)中也存在赂蕴。
對scATAC-seq數(shù)據(jù)進行聚類分群后柳弄，我們在慢性感染Cl13樣本中鑒定到了8個不同的細胞cluster。進一步進行細胞類型的注釋概说，在d8樣本中我們鑒定到了3個細胞cluster：一個Exh-Pre和兩個Eff-like細胞群碧注。將Eff-like I和Eff-like II細胞群進行比較發(fā)現(xiàn)一些基因的染色質可及性向Eff-like II細胞中逐漸增強，如Ccr9糖赔，S1pr1和Cd69以及一些整合素基因应闯，表明這些細胞可以遷移到外周組織中。在d15樣本中挂捻，我們鑒定到了Exh-Prog細胞群碉纺，同時還鑒定到一大群過度細胞Exh-Trans。在d30 樣本中刻撒，我們鑒定到了4個細胞群：Exh-Prog骨田，Exh-Int，Exh-KLR和Exh-Term声怔。為了了解這些表觀特異性的細胞群是否與轉錄異質性的細胞群相一致态贤，我們將scRNA-seq鑒定的細胞cluster與scATAC-seq的cluster進行相關性比較分析。結果發(fā)現(xiàn)scATAC-seq數(shù)據(jù)鑒定到的細胞cluster比scRNA-seq的cluster要少醋火，其中在d8（3 clusters vs 7 clusters）悠汽，d15（5 vs10）和d30（5 vs 11）。這些差異表明scATAC-seq鑒定到的少數(shù)細胞cluster可能具有多個不同的轉錄狀態(tài)芥驳。
接下來柿冲，我們繼續(xù)探究不同Tex細胞亞群的表觀遺傳特征。首先兆旬，我們在這些Tex細胞亞群中共鑒定到了20362個差異的染色質可及性區(qū)域（DACRs）假抄，并將這些DACRs注釋到鄰近的基因中。結果表明不同的Tex細胞亞群之間具有差異的和共享的ACRs丽猬。例如宿饱，Exh-Pre和Exh-Prog細胞群之間具有相似的DACRs圖譜，包括干細胞性相關基因如Tcf7脚祟，F(xiàn)oxp1和Id3基因處的DACRs谬以。Eff-like I和Eff-like II細胞群之間也共享了染色質可及性，如Ifng和Bhlhe40基因處的DACRs由桌，這些與Exh-KLR細胞也是相似的为黎。然而胡陪，Exh-KLR細胞還包含一些特有的DACRs如Rap1b，Id2和Klrb1c等碍舍。Exh-Term細胞表現(xiàn)出獨特的ACR圖譜柠座，包括Fyn，Ptger4片橡，Btg1和Rgs1基因妈经。
我們接下來想知道是什么轉錄因子TF潛在調控了不同Tex細胞的轉錄程序。我們對不同Tex細胞的ACRs區(qū)域進行TF motif富集分析捧书，正如所期望的一樣吹泡，Exh-Pre和Exh-Prog細胞的ACRs區(qū)域顯著富集到TCF1 motif。然而经瓷，Exh-Pre細胞中還富集到AP1 motif爆哑，表明它們響應著較強的TCR刺激，而Exh-Prog細胞中還富集到NFkB和RFX motif舆吮。Exh-Term細胞中富集到一些獨特的TF motif揭朝，如ETV, ETS和Fli1等，在Exh-KLR和Exh-Int細胞群中富集到一些共享的TF motif色冀，如KLF家族的轉錄因子潭袱。此外，我們還發(fā)現(xiàn)ZEB1 motif在Exh-KLR細胞中幾乎不存在锋恬，而在其他Tex細胞中都有一定的富集屯换，類似于急性感染中ZEB1不在CTL細胞群中富集。同時与学，我們還發(fā)現(xiàn)在Exh-KLR和CTL細胞群中都有著較強的Zeb2基因活性彤悔，而有著很低的Zeb1基因活性，表明他們之間共享了一些TF使用特征索守。盡管CTL和Exh-KLR細胞都有著較強的Zeb2基因活性晕窑，但是Exh-KLR細胞中還有著很強的Tox基因活性，這在急性感染的CTL細胞中是沒有的蕾盯。
為了進一步比較Exh-KLR和急性感染中的CTL細胞之間的表觀遺傳特征的差異幕屹，我們將CTL, Mem-CTL，和Exh-KLR細胞群各自特異的ACRs區(qū)域進行overlap重疊分析级遭。結果發(fā)現(xiàn)相比于CTL和Mem-CTL細胞，Exh-KLR細胞的ACRs區(qū)域大多是其特異的（2123/2739）渺尘。實際上挫鸽，Exh-KLR細胞與CTL和Mem-CTL細胞之間只共享了11%和3%的ACRs區(qū)域。Exh-KLR細胞特有的差異ACRs區(qū)域顯著富集著KLF和AP1 motif鸥跟，而CTL和Mem-CTL細胞中著主要富集著ETS, ETV和RUNX motif丢郊。因此盔沫，盡管Exh-KLR細胞群使用了類似急性感染中CTL細胞共有的細胞毒性和NK細胞相關基因的表觀遺傳和轉錄特征，但是它與CTL細胞之間仍然存在著巨大地差異枫匾，屬于不同的細胞亞群架诞。
總之，這些scATAC-seq數(shù)據(jù)揭示了不同Tex細胞亞群的染色質可及性景觀干茉，發(fā)現(xiàn)它們與Teff和Tmem細胞之間相似和差異的表觀遺傳特征谴忧，基于單細胞染色質數(shù)據(jù)鑒定到了4種主要的Tex細胞亞群：Exh-Prog, Exh-Int, Exh-KLR和Exh-Term。
Figure 4. The accessible chromatin landscape of TEX evolves over time and distinguishes fewer epigenetic cell fates under wider transcriptional diversity
