文章信息今天分享的這篇文章于2019年10月9日發(fā)表在期刊Nature上，文章題目為：Decoding human fetal liverhaematopoiesis 惊完。DOI號為：https://doi.org/10.1038/s41586-019-1652-y.
** 摘 要 **
通過10x Genomics 和 Smart-seq2單細(xì)胞測序平臺對不同胎齡的14個胎肝樣本凉唐、7個皮膚樣本兵怯、3個腎臟樣本、3個卵黃囊樣本進(jìn)行測序募舟，獲得了138,575個胎兒肝臟細(xì)胞及約74,000個皮膚杂数，腎臟和卵黃囊細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜哈扮。推斷了造血干細(xì)胞/多能祖細(xì)胞（HSC/MPP）的發(fā)育軌跡，定義胎肝造血過程中紅系玻募、淋系及髓系各個階段的造血細(xì)胞只损，首次發(fā)現(xiàn)了胎兒皮膚中存在成紅前體細(xì)胞，卵黃囊中存在肥大細(xì)胞，NK細(xì)胞及固有淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞跃惫。隨著妊娠的進(jìn)展叮叹，胎肝HSC/MPP分化成為紅細(xì)胞的比例降低，髓系及淋系的比例增高爆存，與此同時HSC/MPP的分化潛能也發(fā)生了變化蛉顽。
方法及分析概覽
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樣品：共收集17個胎兒標(biāo)本，包括14個肝臟樣本先较、7個皮膚樣本携冤、3個腎臟樣本、3個卵黃囊標(biāo)本闲勺，其中皮膚曾棕、腎臟被稱為非淋巴組織（non-lymphoid tissues，NLTs）菜循。樣品詳細(xì)信息如下：
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建庫測序：10x Genomics樣本通過3’ v2 試劑及 V(D)J Reagent Kits建庫后通過Illumina HiSeq 4000 測序翘地；Smart-seq2樣本通過Illumina Nextera XT kit (Illumina)測序。
數(shù)據(jù)上游分析：10x Genomics 測序數(shù)據(jù)通過Cell Ranger軟件進(jìn)行的比對及定量癌幕，參考基因組為GRCh38 人類參考基因組衙耕。Smart-seq2 測序數(shù)據(jù)通過STAR軟件進(jìn)行比對。使用htseq-count（v.0.10.0）計算基因的read計數(shù)序芦。
質(zhì)量控制：除去表達(dá)< 200個基因且線粒體基因>20％的細(xì)胞臭杰，除去少于3個細(xì)胞中表達(dá)的基因。用Scrublet去除Doublets谚中。最終獲得了138,575（n = 14）個胎兒肝臟細(xì)胞（使用Smart-seq2分析了1,206個細(xì)胞）渴杆，54,690（n = 7）個皮膚，9,643個腎臟（n = 3）和10,071個卵黃囊（n = 3）細(xì)胞宪塔。10x Genomics平均每個細(xì)胞檢測到約3,000個基因磁奖，使用Smart-seq2平均檢測到約6,000個基因/細(xì)胞。
降維某筐、聚類及細(xì)胞定義：應(yīng)用Seurat包（v2.3.4）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化比搭，scaledata, variable gene detection，PCA南誊、TSNE身诺、UMAP降維，Louvain graph-based 聚類抄囚。細(xì)胞定義通過經(jīng)典marker及DEG霉赡。胎肝細(xì)胞聚類又加用了兩種聚類方法：agglomerative clustering及Gaussian Mixture，然后用Rand指數(shù)衡量三種聚類方法之間的一致性幔托。細(xì)胞定義完后穴亏，通過胎肝數(shù)據(jù)訓(xùn)練support vector machine (SVM)來構(gòu)建細(xì)胞類型分類器蜂挪，之后用SVM細(xì)胞分類器來定義smart-seq2數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型。
樣本整合：相同組織樣本之間整合用Harmony嗓化，不同組織樣本之間的整合用Merge (Seurat函數(shù))棠涮。kBET衡量批次效應(yīng)。
下游分析：通過比較FDG刺覆，PAGA和diffusion-map推測發(fā)育軌跡严肪。使用Monocle2中的DifferentialGeneTest函數(shù)計算偽時變化的基因。CellPhoneDB推斷細(xì)胞之間相互作用隅津。
功能驗證：免疫組化诬垂、免疫熒光、HSC/MPP 培養(yǎng)伦仍。
主要結(jié)果
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1.構(gòu)建了胎兒肝細(xì)胞圖譜
Fig. 1a 實驗流程
Fig. 1b 胎兒肝臟細(xì)胞圖譜
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Fig. 1c 各妊娠階段中每個譜系細(xì)胞的比例结窘，胎肝主要以紅系造血為主，但隨著胎齡的增加充蓝，紅系比例下降隧枫，髓系及淋系比例增加。
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2. 細(xì)胞類型鑒定
Fig. 2a 展示胎肝各種細(xì)胞類型的marker谓苟，*表示后續(xù)用于流式分選細(xì)胞鑒定的marker官脓。
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Fig. 2b 通過選定的marker進(jìn)行流式分選后，Giemsa染色鑒定細(xì)胞類型涝焙。
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3. 胎肝及非淋巴組織的造血
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Fig. 3a FDG圖展示所有的造血細(xì)胞卑笨，可看到從HSC/MPP向三系的分化軌跡。image.png
- Extended Data Fig. 3a 巨核細(xì)胞仑撞、肥大細(xì)胞赤兴、成紅細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞MEMP (megakaryocyte–erythroid–mast cell progenitor)。分化過程中動態(tài)調(diào)節(jié)的基因不同隧哮，紅系譜系中的TAL1和KLF1桶良，巨核細(xì)胞譜系中的F11R，PBX1和MEIS1沮翔，肥大細(xì)胞分化中的HES1陨帆。
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Fig. 3b 從卵黃囊到肝臟，紅細(xì)胞血紅蛋白基因表達(dá)以及從原始血紅蛋白HBZ和HBE1表達(dá)到胎兒血紅蛋白（HBA1和HBG2）表達(dá)的時間變化采蚀。image.png
- Extended Data Fig. 3e 肥大細(xì)胞疲牵，巨核細(xì)胞和紅系譜系細(xì)胞在肝、卵黃囊榆鼠、皮膚瑰步、腎臟中均顯示出較高的關(guān)聯(lián)性。
- Extended Data Fig. 3d 皮膚MEMPs表達(dá)了一些早期的成紅細(xì)胞基因璧眠，包括MYL4，表明這些細(xì)胞可能充當(dāng)皮膚中的紅細(xì)胞祖細(xì)胞，具有造血功能责静。
4. 胎肝和非淋巴組織的淋系細(xì)胞生成
- Fig. 4a & 4b 胎肝及非淋巴組織淋系細(xì)胞展示袁滥。在胎肝中發(fā)現(xiàn)了淋系兩個方向分支，NK-T-ILC及B系灾螃。與肝臟和卵黃囊相比题翻，非淋巴組織中存在Pro-B，pre-B和B細(xì)胞腰鬼，但缺少HSC / MPP和pre-B前體細(xì)胞嵌赠。
- Extended Data Fig. 5h & 5i NLT中的早期淋巴/ T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞和ILC與肝臟相比相同的基因表達(dá)趨勢熄赡。然而姜挺，趨化因子（XCLI和CXCL8）和細(xì)胞毒性顆粒（GNLY）基因的組織特異性表達(dá)表明，在皮膚和腎臟中發(fā)生了NK細(xì)胞的成熟和組織適應(yīng)性彼硫。NLT中的ILC前體細(xì)胞缺乏其成熟后代ILC1炊豪，ILC2和ILC3的全套特征標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄因子。
- Extended Data Fig. 5a 根據(jù)PAGA拧篮， NK細(xì)胞（表達(dá)NCAM1词渤，CD7，IL2RB和CD3E）和ILC前體（表達(dá)KIT串绩，KLRB1缺虐，IL7R和RORC）在淋巴分支中具有共同的起源。
- Extended Data Fig. 5e HSC / MPP到B細(xì)胞分化過程中動態(tài)變化的基因包括SPIB礁凡，SP100和CTSS高氮。
5. 髓樣細(xì)胞組織分布特征
- Fig. 5a & Fig. 5b 胎兒肝臟，胎盤和卵黃囊的HSC / MPP把篓，髓系祖細(xì)胞纫溃，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的FDG圖。
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Extended Data Fig. 6a & 6b. DC分化涉及CLEC11A韧掩，BATF3和ID2的動態(tài)調(diào)節(jié)紊浩，而單核細(xì)胞分化涉及S100A8 / A9，F(xiàn)CGR1A / 2A和S100A12的動態(tài)調(diào)節(jié)疗锐。漿細(xì)胞樣DC（pDC）前體從早期髓樣前體和pre-B前體細(xì)胞分化而來坊谁，與最近在小鼠中相關(guān)研究結(jié)果一致。image.png
6. HSC/MPP分化潛能隨胎齡變化
Fig. 6a & 6b FDG展示各個階段的HSC/MPP滑臊。根部的HSC表達(dá)CLEC9A, HLA-DRA及最高水平的原始基因如MLLT3口芍，為多能的LT-HSC。
Fig.6c-e 來自CD34 + CD38-CD45RA- HSC / MPP的單細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生單能和多能的細(xì)胞群體雇卷。含有紅系細(xì)胞的細(xì)胞群明顯減少鬓椭，而含有NK細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞群則隨著胎齡的增加而增加颠猴。胎齡小于9周時，無含B細(xì)胞的群體產(chǎn)生小染，提示這一階段B細(xì)胞在胎肝中尚未分化翘瓮。
Fig 6f-6g胎肝HSC / MPP G0期的比例隨著胎齡的增加而增加，表明HSC逐漸趨于沉默狀態(tài)裤翩。與臍帶血及骨髓相比资盅，胎肝HSC / MPPs顯示編碼熱休克蛋白（HSPA1A）的基因表達(dá)較高，可能用于維持基因組和蛋白質(zhì)組完整性踊赠，而MHC-1（HLA-B）含量較低呵扛，表明與抗原呈遞能力較低。
總結(jié)
文章從單細(xì)胞水平筐带，較為全面的構(gòu)造了胎兒肝臟造血圖譜今穿，不僅推測出HSC/MPP向三系的分化軌跡，同時發(fā)現(xiàn)了HSC/MPP內(nèi)部的細(xì)胞異質(zhì)性及成熟度的變化烫堤，為研究人類其他器官及組織的發(fā)育軌跡提供了理想模板荣赶。
轉(zhuǎn)自單細(xì)胞天地
