前期文章：
- 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質粒骨架及其各個要素的介紹：
解剖式學習一個質粒結構--update
質粒系列之什么是質粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway痢毒、RMCE的一些內容：
基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過兩篇：
團隊作案HEK293，史上最強搬磚細胞
不想再用慢病毒了蚕甥，我還有什么別的選擇嗎哪替？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個CRISPR screening的專題，只有開頭梢灭，未得完善：精準大海撈針--5. CRISPR screening專題
- 質粒系列之再談無縫連接--Gibson assembly
正文
我們前面分別講述了依賴于限制性內切酶的限制性克隆以及依賴于同源臂同源重組的Gibson assembly夷家。前者的發(fā)現(xiàn)使得質粒改造變得成為可能，而后者的發(fā)明使得質粒構建變得如此快捷敏释。我們在前文中提到限制性克隆的主要缺點是依賴特異性的酶切位點，然而限制性克隆中的Golden Gate克隆 （以下簡稱GG克旅）則并不遜色于Gibson assembly钥顽，堪稱質粒改造王者，根本原因是GG克隆中所用到的IIS酶十分特殊靠汁。
限制性內切酶分類繁多蜂大，根據切割位點類型分為3類 ，切得老遠老遠的是I型蝶怔；切割識別位點外25個bp左右的是III型奶浦；切割識別別位點及其附近的是II型。II型還有特定的亞型踢星，包含IIS類澳叉，切割識別位點之外5-6個剪輯對的序列，簡略比較圖如下：
上圖我將II型默認為我們常規(guī)用到的Ⅱ型酶（IIP型），由于II型酶還有各類亞型成洗，為了方便后續(xù)學習五督，我們先簡單了解一下II型酶家族都有哪些分類以及特征。
1. II型限制性內切酶家族
數(shù)量：II型限制性內切酶是日常分子生物學中最常見的酶瓶殃，如基因克隆和DNA片段分析充包。目前已發(fā)現(xiàn)超過3500種II型酶，可識別超過350種DNA序列遥椿。通過對細菌和古細菌基因組的分析基矮，已確定了數(shù)千種II型酶，但其特征仍未確定冠场。
命名：限制性內切酶依據發(fā)現(xiàn)它們的微生物命名愈捅。例如，HindIII叫Hin d three是在流感嗜血桿菌（<u>H</u>aemophilus influenzae）<u>d</u>血清型中發(fā)現(xiàn)的第<u>3</u>種內切酶慈鸠，由此可第二種和第一種則分明名為HindI蓝谨、HindII。有時添加前綴r以區(qū)分限制性內切酶與它們細胞內的修飾酶青团。因此譬巫，R.HindIII專指限制性內切酶，M.HindIII專指修飾酶督笆。當無歧義時芦昔，前綴r被省略。
常規(guī)亞分類： Type IIP, IIS, IIC, and IIT娃肿。II型酶分類有多達十幾種咕缎，有機會的話我們可以詳細討論各種亞分類的不同結構以及為何會產生不同的切割結果（挖坑），想要自行學習的小伙伴可在文末查看我們推薦的文獻料扰。下面我們簡單介紹一下常規(guī)使用的幾種II酶亞類的區(qū)別凭豪。
大家一定好奇，II后面的字母是如何來的呢晒杈？
(1) IIP（<u>P</u>alindromic）：IIP型是最重要的亞型嫂伞，占分子生物學中酶的90%以上 ，識別長度為4到8個堿基對的回文序列拯钻，切割位點也通常在該序列內 帖努。大多數(shù)IIP型酶識別特異的DNA序列，每個位置只能有一個特定的堿基對(例如BglII: AGATCT)粪般，但一些IIP型酶可識別簡并（模糊）序列拼余，其中可以有不同的堿基對。
(2) IIS（<u>S</u>hifted cleavage）：IIS型酶在識別序列之外的固定位置切割DNA亩歹。裂解點移（shift）到序列的一側匙监。IIS就是GG克隆使用到的酶類凡橱。
(3) IIC（<u>C</u>ombined）：同時具有內切酶和甲基轉移酶活性。限制性內切酶大部分是由細菌和古菌產生的舅柜，其對宿主細胞具有潛在毒性梭纹，而對限制性內切酶的保護性解毒劑會以DNA甲基轉移酶的形式產生。這種酶識別與限制性內切酶相同的序列致份，通過化學方法改變細胞自身DNA的每個位點变抽，防止其被裂解。而這種DNA修飾包括甲基化氮块，可通過形成空間位阻绍载，阻止限制性內切酶與該位點結合。IIC型酶可以同時催化兩種相互競爭的反應：酶切和甲基化滔蝉。甲基轉移酶反應普遍需要輔助因子s -腺苷蛋氨酸(SAM)击儡。有些IIC型酶在裂解時也需要SAM，有些僅僅受到SAM的刺激蝠引，還有一些根本不需要SAM阳谍。如果存在SAM，甲基化會隨著裂解而進行螃概，從而阻止完全消化矫夯。IIC型酶在分子生物學中應用不多，所以我也并未用過這種酶吊洼。
(4) IIT（<u>T</u>wo different subunits or <u>T</u>wo different catalytic ）：異源二聚體限制性內切酶训貌，包含兩個不同的亞基，或具有兩個不同的催化位點冒窍。
2. Golden Gate克隆特性
通過以上描述递沪，我們得到的最直觀信息是：（1）IIS型裂解識別序列外的序列；（2）IIS型為無痕連接综液。因而可以推測GG克隆的特性：
（1）切割識別序列外序列款慨， 則說明切割位點并不特異，任意序列只要在這附近有特異性的IIS型酶識別位點即可意乓，這就提供了酶切的無限可能樱调！
（2）無痕連接：切割后若為自連，則IIS酶會不斷酶切自連位置届良，因此自連產物幾乎不太可能會被轉化進感受態(tài)細胞（只有酶切不完全的情況下，會有原始質粒被轉入感受態(tài)的可能）圣猎；切割后若連接成功則丟失酶切位點士葫，因而只要連接，即是成功送悔÷裕基于這個特性爪模，酶切和連接可以在同一試管內完成，無需酶切回收片段后再連接荚藻，該效率堪比Gibson assembly屋灌。
（3）速度快、效率高：由于切割和連接可在同一管內完成且效率幾近100%应狱，因此反應在半小時內即可完成共郭。
（4）多片段可同時組裝，只要插入片段兩端酶切位點設計得當疾呻，即可同時連接多達10個以上片段除嘹。
Golden Gate克隆示意圖
下圖描述了兩種常用的插入片段制備辦法，無論是酶切還是PCR岸蜗，其根本還是要產生互補的粘性末端尉咕，因此只要粘性末端設計得當，可同時插入多種片段璃岳。具體的方法可參考2020年新發(fā)表的文章：Synthetic DNA Assembly Using Golden Gate Cloning and the Hierarchical Modular Cloning Pipeline年缎，具體信息在文末給出。該文描述了5種basic protocol铃慷，并給出了案例分析以及實驗條件单芜，由于本文篇幅有限，則不再展開該文枚冗，但非常值得一讀缓溅。
3. 案例學習
在我們前面CRISPR-Csa9實驗記錄系列推文中，將sgRNA插入到Cas9質粒這個步驟使用的就是GG克隆的方法赁温。接下來我們仍以這個克隆為例坛怪，分析實驗設計方案以及實驗條件調整用意。
3.1 準備gRNA oligo片段股囊，一般使用梯度退火即可達到互補配對的效果
原設計匯總sgRNA的獲取是通過PCR擴增的袜匿，PCR產生的線狀DNA產物需要通過T4 PNK進行磷酸化，以提高后續(xù)連接效率稚疹。而我們的方案中由于使用的載體是 pSpCas9(BB)-2A-GFP居灯，載體經過改進，BbsI兩位點在U6啟動子后面内狗，gRNA scaffold前面怪嫌，因此只需要將那20 nt長度的gRNA序列插入即可。而這gRNA序列是公司合成的柳沙，無須再進行磷酸化岩灭。
3.2 使用Golden Gate克隆將gRNA片段插入
經過調整，將T7連接酶改為T4連接酶赂鲤，而T4連接酶的緩沖液已經帶有DTT噪径、ATP等成分柱恤，無須另外添加。雖然我們總是說GG克隆可以在30分鐘內完成反應找爱，但在這個實驗中我們使用的是37℃與25℃交替反應6個循環(huán)梗顺，即為酶切-連接進行6個循環(huán)。在酶切-連接6個循環(huán)結束后车摄，添加一個37℃ 30 min的步驟用于酶切未完全酶切的載體質粒寺谤，以減少感受態(tài)轉化后的自連克隆。同時添加65℃ 5 min步驟用于失活BbsI和T4連接酶练般，以免對感受態(tài)細胞造成傷害矗漾。
4. Golden Gate應用
4.1 合成生物學
合成生物學家已經開發(fā)出一種模塊化克隆策略MoClo，它使用IIS型限制性內切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地組裝多達6個DNA片段薄料。這種方法利用IIS型酶在識別位點外切割的能力敞贡，并允許具有兼容懸端的DNA片段被有效組裝。
通過設計出獨特的酶識別位點摄职，使DNA模塊的側翼呈反向方向誊役，這樣多個DNA組分就可以在一個單一反應中定向組裝，而在兩者之間只保留一個確定的4bp融合位點谷市。
MoClo系統(tǒng)由三組克隆載體（Level 0, Level 1, Level 2）組成蛔垢，可以在三個連續(xù)的組裝步驟中使用。
（1）在開始之前迫悠，將包含基本部分（啟動子鹏漆、utr、編碼序列创泄、終止子等）的DNA片段插入到單個的level 0質粒中艺玲；
（2）在第一步組裝中，兼容的level 0被定向組裝成level鞠抑，創(chuàng)建一個轉錄單元（例如:啟動子饭聚、5 UTR、編碼區(qū)域和終止子）搁拙。
（3）接下來秒梳，多達6個level 1模塊可以類似地組裝成level 2，從而形成一個基因結構箕速。
在最后的組裝步驟中結合多個2級載體可以創(chuàng)建更復雜的結構酪碘。
4.2 基因工程
就如我們上面舉的案例一樣，在CRISPR-Cas9基因編輯技術中盐茎，我們用到GG克隆將gRNA有效的插入到Cas9質粒中婆跑。此外基于GG克隆強大的DNA片段組裝能力，可使用GG克隆高效組裝TALEN以及TAL序列庭呜，從而參與基因編輯工作滑进。具體信息可以查看我們文末提到的參考資料。其實只要是用到質粒改造的領域募谎，GG克隆都有可能參與扶关。因此無所謂它到底應用在哪兒了。
5. 結語
GG克隆雖然有效率高数冬、速度快且操作簡單的優(yōu)點节槐。從多組分組裝來說，Gibson assembly仍相當具有競爭力拐纱。同傳統(tǒng)限制性克隆一樣铜异，插入片段中如若含相同的IIS型酶切位點，會造成額外的酶切秸架，因此IIS酶的酶切只能存在對的位置揍庄。而如果插入片段中含有同樣的識別位點，可通過PCR對該片段進行點突變沉默东抹。而如果插入片段的相同IIS酶切位點太多無法完成突變時蚂子，可考慮使用Gateway克隆。我們之后也會單獨寫一篇Gateway克络郧（繼續(xù)挖坑）食茎。
對于非合成生物學、基因工程領域的我們馏谨，平時用到GG克隆的情況不多别渔。首先IIS型酶種類并不算特別多，目前NEB上約有50種惧互；其次與傳統(tǒng)限制性克隆一樣哎媚，GG克隆仍然依賴酶切識別位點；載體或者插入片段同時擁有合適酶切位點的情況不多見壹哺，還需要通過PCR對插入片段額外引入粘性末端抄伍，這個操作過程與Gibson assembly差不多一致，因此大多數(shù)情況大家還是會選擇Gibson assembly管宵。然而Gibson assembly依賴可同源重組的粘性末端截珍，當載體中具有相似同源片段時會有錯配的可能，此時可考慮使用GG克隆箩朴。
今天就到此為止岗喉，謝謝大家。
