2023年6月测垛，陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院黃嵐教授團(tuán)隊(duì)在?Clinical and Translational Medicine雜志上發(fā)表了題名為“Single-Cell RNA Sequencing Reveals a Mechanism Underlying the Susceptibility of the Left Atrial Appendage to Intracardiac Thrombogenesis During Atrial Fibrillation”的研究論文。研究人員對(duì)來(lái)自 3 例持續(xù)性房顫患者的左心耳及右心耳樣本進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）翅萤。結(jié)合?Tbx5+/-?房顫模型小鼠及 GST pull-down、免疫共沉淀、體外重組蛋白剪切實(shí)驗(yàn)、流體剪切力等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)房顫患者心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞（EECs）抗凝功能降低是左心耳血栓形成易感性的潛在機(jī)制角塑，該發(fā)現(xiàn)有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)不同細(xì)胞亞群及分子靶點(diǎn)的房顫抗凝療法。該研究中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)由博奧晶典提供淘讥。
【發(fā)表期刊】Clinical and Translational Medicine
【影響因子】10.6
【發(fā)表時(shí)間】2023年6月
【檢測(cè)技術(shù)】scRNA-seq圃伶、GST Pull down、免疫共沉淀蒲列、體外重組蛋白剪切實(shí)驗(yàn)
01
研究背景
房顫（AF）是臨床上最常見(jiàn)的心律失常窒朋，目前全世界房顫患者約為 3300 萬(wàn)人。房顫導(dǎo)致心房收縮功能喪失及血流動(dòng)力學(xué)異常極大的增加了心腔內(nèi)血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)蝗岖，造成心源性卒中侥猩。研究發(fā)現(xiàn)，相比于右心耳剪侮，左心耳血栓是房顫致腦卒中血栓的主要來(lái)源拭宁。然而房顫狀態(tài)下左心耳血栓發(fā)生率明顯高于右心耳的原因目前仍不清楚。因此瓣俯，深入探索房顫時(shí)左心耳血栓形成的分子機(jī)制杰标，對(duì)于房顫患者的精準(zhǔn)化抗凝治療具有重要的臨床意義。
02
研究路線
03
主要結(jié)果
1. 房顫患者的心耳單細(xì)胞圖譜
研究人員從 3 例接受外科直視手術(shù)的持續(xù)性房顫患者中收集左心耳（LAA）和右心耳（RAA）組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序彩匕，對(duì)篩選得到的 32326 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析腔剂，鑒定出 11 類(lèi)細(xì)胞后分別進(jìn)行 top 基因表達(dá)分析及 GO / KEGG 功能富集分析。
2. 房顫患者心耳內(nèi)皮細(xì)胞重新分群及亞群分析
在圖譜完成之后驼仪，作者關(guān)注到了內(nèi)皮細(xì)胞掸犬，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞重新聚類(lèi)后鑒定出 8 種亞群，比較了左右心耳 8 個(gè)亞群的變化绪爸。值得注意的是湾碎，EECs 亞群在左心耳的比例顯著低于右心耳，KEGG 分析顯示凝血級(jí)聯(lián)途徑的相關(guān)基因在左右心耳間具有顯著差異奠货，包括左心耳中?ADAMTS1?上調(diào)以及?TFPI?和?TFPI2?的下調(diào)介褥。因?yàn)樵撗芯恐袩o(wú)健康人的對(duì)照數(shù)據(jù)，所以隨后作者對(duì)比了公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的健康人左右心房EECs的基因表達(dá)情況，最后確定了?ADAMTS1柔滔、TFPI?及?TFPI2?在房顫患者左右心耳的差異性表達(dá)特征溢陪。作者又通過(guò) SCENIC 分析，發(fā)現(xiàn)調(diào)控血栓前狀態(tài)差異性基因表達(dá)的潛在轉(zhuǎn)錄因子睛廊。
3. 房顫患者心耳成纖維細(xì)胞分析及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化擬時(shí)序分析
內(nèi)皮細(xì)胞分析完之后形真，作者又關(guān)注到了成纖維細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞比例分析顯示多數(shù)成纖維細(xì)胞分布在左心耳超全，而馬松染色也證實(shí) AF 患者左心耳的組織纖維化程度重于右心耳咆霜。左心耳成纖維細(xì)胞特異性高表達(dá)一些促進(jìn)纖維化基因（PDGFRL、MFAP5卵迂、CILP）和基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)基因（MFAP5裕便、TNFAIP6、PTX3）见咒。在看到成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)特征之后偿衰，作者提出了一個(gè)疑問(wèn)，AF 患者左心耳中成纖維和內(nèi)皮細(xì)胞之間是否有潛在分化關(guān)系改览？所以下翎，接下來(lái)作者構(gòu)建了基于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞宝当、和 unknown 細(xì)胞之間的擬時(shí)序分析视事，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中 unknown 細(xì)胞大多位于分化中間階段，結(jié)合細(xì)胞亞群的軌跡分布及其特征性基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)部分成纖維細(xì)胞是在房顫過(guò)程中由內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)的庆揩。
4. 房顫患者心耳免疫細(xì)胞分析
接下來(lái)關(guān)注焦點(diǎn)為免疫細(xì)胞俐东，研究人員鑒定出了包括巨噬、單核订晌、淋巴和 B 細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞虏辫。通過(guò)比較左右心耳差異發(fā)現(xiàn)，右心耳中有更多的單核锈拨、淋巴和 B 細(xì)胞砌庄，而左心耳中有更多的巨噬細(xì)胞。此外奕枢，右心耳巨噬細(xì)胞具有更高水平的編碼金屬硫蛋白（MT1G娄昆，M1TX）的基因，這可能和抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生相關(guān)缝彬。作者對(duì)巨噬細(xì)胞重分群后萌焰，發(fā)現(xiàn) M1 型巨噬細(xì)胞在左心耳中的比例高于右心耳，說(shuō)明在房顫慢性炎癥過(guò)程中谷浅，左心耳中的巨噬細(xì)胞發(fā)生了促炎表型的轉(zhuǎn)化扒俯。
5. 房顫模型小鼠中的?TFPI族购、TFPI2?和?ADAMTS1?表達(dá)
在之前的內(nèi)皮細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)了?TFPI、TFPI2?和?ADAMTS1?在左右心耳的差異表達(dá)陵珍，為了進(jìn)一步探索它們之間的關(guān)系，該研究先構(gòu)建了 AF 模型小鼠（Tbx5fl/+; CMV-Cre）违施，通過(guò)心電圖驗(yàn)證其造模成功互纯，馬松染色也觀察到心耳纖維化程度明顯高于對(duì)照組，麥胚凝集素（WGA）染色觀察到 AF 小鼠心肌細(xì)胞顯著肥大磕蒲。RT-PCR 驗(yàn)證相關(guān)基因在 AF 小鼠與竇律小鼠左右心耳組織中的表達(dá)情況留潦。免疫熒光也觀察到 AF 的心內(nèi)膜中，TFPI?和?TFPI2?在 RAA 中的表達(dá)均高于 LAA辣往。
6. 血流剪切力變化調(diào)控心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中 TFPI兔院、TFPI2 和 ADAMTS1 表達(dá)
瘀血和湍流被認(rèn)為是房顫過(guò)程中 LAA 血栓形成的重要因素，特征是內(nèi)皮細(xì)胞壁面剪切應(yīng)力的降低站削，那么血流介導(dǎo)的剪切力降低是否與 LAA EECs 中 TFPI 和 TFPI2 表達(dá)水平變化有關(guān)呢坊萝？作者進(jìn)行了接下來(lái)的探索，首先通過(guò)流式分選出 EECs许起，利用 WB 及免疫熒光驗(yàn)證了 TFPI 和 TFPI2 在房顫小鼠左心耳 EECs 中表達(dá)下調(diào)十偶，ADAMTS1 的表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步尋找調(diào)控這些蛋白表達(dá)差異性的驅(qū)動(dòng)因素园细，研究人員在體外模擬不同血流狀態(tài)惦积，在模擬房顫血流瘀滯條件下（2 dyn/cm2），EECs 中 ADAMTS1 表達(dá)上調(diào)猛频，而 TFPI 和 TFPI2 表達(dá)下調(diào)狮崩，同時(shí) TFPI 和 TFPI2 發(fā)揮的抗 FXa 活性也顯著下降。作者還進(jìn)一步檢測(cè)到剪切應(yīng)力變化與上述蛋白表達(dá)變化存在時(shí)間相關(guān)性鹿寻，在 6 dyn/cm2?處理后睦柴，所有蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而在 2 dyn/cm2?處理 30min 后 ADAMTS1 的時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)烈和，且在 50 min 時(shí)達(dá)到平臺(tái)期爱只，而隨后 TFPI 和 TFPI2 的表達(dá)僅在 50-90 min 后才出現(xiàn)下降，說(shuō)明剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 TFPI 和 TFPI2 的表達(dá)降低可能依賴(lài)于 ADAMTS1 上調(diào)招刹。
7. ADAMTS1 以直接結(jié)合方式剪切 TFPI 和 TFPI2恬试，并抑制其抗 FXa 活性
上述發(fā)現(xiàn)說(shuō)明 ADAMTS1 的上調(diào)可能影響了 TFPI 和 TFPI2 的表達(dá)降低，那么具體機(jī)制是什么疯暑？作者又進(jìn)行了下一步的研究训柴，通過(guò) pull-down 及 Co-IP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TFPI 和 TFPI2 與 ADAMTS1 間存在直接相互作用。通過(guò) AlphaFold2 建模并根據(jù)蛋白對(duì)接評(píng)分預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)間的潛在結(jié)合位點(diǎn)妇拯。重組蛋白體外剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明幻馁，ADAMTS1 可以以時(shí)間依賴(lài)的方式剪切 TFPI 和 TFPI2洗鸵，并抑制其發(fā)揮的抗 FXa 活性作用。最后仗嗦，作者又在體外通過(guò) shRNA 沉默?ADAMTS1?驗(yàn)證了 ADAMTS1 對(duì) TFPI 和 TFPI2 發(fā)揮的特異性剪切作用膘滨。以上結(jié)果說(shuō)明 ADAMTS1 可以直接剪切 TFPI 和 TFPI2，阻斷其抗 Fxa 活性稀拐，從而導(dǎo)致局部凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)失衡火邓，促進(jìn)心房血栓形成。
全文結(jié)論及研究意義
1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了房顫患者心耳組織細(xì)胞組成及左右心耳轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性德撬；
2. 房顫患者左心耳血栓形成易感性與其心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞抗凝活性因子表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)铲咨；
3. 血流動(dòng)力學(xué)改變可調(diào)控ADAMTS1表達(dá)，ADAMTS1發(fā)揮剪切作用進(jìn)而影響EECs抗凝因子TFPI及TFPI2的表達(dá)蜓洪。
該研究首次繪制了房顫患者心耳的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜纤勒，有助于從單細(xì)胞層面深入了解房顫病理生理過(guò)程及左右心耳的異質(zhì)性。研究結(jié)果揭示了房顫患者左心耳血栓形成易感性的可能機(jī)制隆檀，即：EECs 中?ADAMTS1?表達(dá)上調(diào)和?TFPI/TFPI2?降低導(dǎo)致的局部凝血-抗凝失衡摇天，該機(jī)制為房顫患者抗凝治療提供了新的靶點(diǎn)，給房顫患者抗卒中治療帶來(lái)了新希望恐仑。
參考文獻(xiàn)
Yang J, Tan H, Sun M, et al. Single-cell RNA sequencing reveals a mechanism underlying the susceptibility of the left atrial appendage to intracardiac thrombogenesis during atrial fibrillation.Clin Transl Med. 2023;13(6):e1297. doi:10.1002/ctm2.1297
