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好了璃岳，這一篇繼續(xù)分享單細胞空間的聯(lián)合分析年缎，看一下在腦轉(zhuǎn)移CD8⁺ T細胞的時空圖譜悔捶，參考文獻在The CD8⁺ T cell landscape of human brain metastases，看來單細胞空間的聯(lián)合分析運用单芜，慢慢就會成為主流蜕该。

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Abstract

盡管檢查點阻斷免疫療法改善了結(jié)果，但腦轉(zhuǎn)移患者在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中預(yù)后最差洲鸠。免疫檢查點阻斷劑靶向耗盡的 CD8⁺ T 細胞上的抑制性受體堂淡，如 PD-1，以恢復其抗癌功能扒腕。然而绢淀，許多患者在對免疫檢查點封鎖的初始反應(yīng)后沒有反應(yīng)或進展，盡管腦轉(zhuǎn)移的局部治療有很好的選擇瘾腰，但遠處顱內(nèi)衰竭很常見皆的。為了開發(fā)更有效的腦轉(zhuǎn)移治療策略，了解腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞的表型是必不可少的蹋盆。在這里费薄，對腦轉(zhuǎn)移瘤中包含的 CD8⁺ T 細胞進行了詳細的表征。腦轉(zhuǎn)移灶被 CD8⁺ T 細胞密集浸潤栖雾；腫瘤樣本的血液污染很少見楞抡。與患者匹配的循環(huán)細胞相比，腦轉(zhuǎn)移浸潤的 CD8⁺ T 細胞具有獨特的表型析藕，其特征是 PD-1 的表達更頻繁拌倍，亞群由額外的共抑制分子和駐留標記 CD69 的表達定義。單細胞 RNA 測序鑒定了腦轉(zhuǎn)移浸潤 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞內(nèi)的四種表型亞群噪径。其中兩個populations——一個終末分化populations和一個分裂populations——的特征是共抑制分子的高表達和缺乏祖細胞標志物（如 TCF-1）的表達。終末分化和分裂populations之間存在顯著的 T 細胞受體 (TCR) 重疊数初，表明分裂細胞產(chǎn)生終末分化細胞找爱。這兩個populations與其他腦轉(zhuǎn)移浸潤性 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞之間的 TCR 重疊最小。來自腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞的 T 細胞克隆在循環(huán)中很少見泡孩，特別是來自終末分化和分裂populations的克隆车摄。分析系統(tǒng)地鑒定了對微生物抗原特異的bystander CD8⁺ T 細胞；這些細胞浸潤腦轉(zhuǎn)移灶并表達與衰竭的祖 CD8⁺ T 細胞共享的基因仑鸥，如 TCF7 和 IL7R吮播。對腦轉(zhuǎn)移瘤進行了空間轉(zhuǎn)錄組學，并使用一種新方法從空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)中獲取 TCR 序列眼俊。這些數(shù)據(jù)揭示了 TME 內(nèi)由其基因表達模式和細胞因子譜定義的不同生態(tài)位意狠。終末分化的 CD8⁺ T 細胞優(yōu)先占據(jù)腫瘤實質(zhì)內(nèi)的niche〈郑總之环戈，結(jié)果表明闷板，抗原特異性限制了腦轉(zhuǎn)移 TME 內(nèi) CD8⁺ T 細胞可用的空間定位、表型狀態(tài)和分化途徑院塞。

Introduction

腦轉(zhuǎn)移會影響大約 20% 的癌癥患者遮晚，與顱外轉(zhuǎn)移相比，腦轉(zhuǎn)移的總生存期明顯更差拦止。盡管它們對免疫檢查點阻斷 (ICB) 有反應(yīng)县遣，但腦轉(zhuǎn)移瘤也接受局部治療 - 放射治療有或沒有手術(shù)切除 - 因此很難辨別 ICB 后 CD8⁺ T 細胞重振對這些腫瘤的孤立影響。大腦包含一個獨特的免疫環(huán)境汹族，通常被認為具有免疫抑制作用萧求，可保護中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 免受過度炎癥的影響。Although there is loss of blood-brain-barrier (BBB) integrity within brain tumors, the consequent less-selective blood-tumor-barrier (BTB) and surrounding stroma of brain tissue may together affect inflammatory signaling and cell recruitment to the tumor microenvironment (TME) of brain metastases.腦轉(zhuǎn)移瘤被 CD8⁺ T 細胞浸潤鞠抑，這可能與 CD8⁺ T 細胞浸潤患者匹配的原發(fā)腫瘤無克隆相關(guān)饭聚，這表明與原發(fā)腫瘤相比，腦轉(zhuǎn)移可能具有不同的決定因素來控制對 ICB 的反應(yīng)搁拙。

CD8⁺ T 細胞是細胞毒性淋巴細胞秒梳，通過其 T 細胞受體 (TCR) 與 MHC I 類肽復合物的抗原特異性結(jié)合來識別感染或腫瘤細胞。抗原清除后箕速，效應(yīng) CD8⁺ T 細胞分化為記憶細胞酪碘，防止抗原再次暴露。在抗原未被清除的情況下盐茎，如癌癥或慢性感染兴垦，效應(yīng) CD8⁺ T 細胞會耗盡，一種以增殖和細胞毒性能力受損為特征的狀態(tài)字柠。耗竭的 CD8⁺ T 細胞表達抑制性分子探越，如 PD-1，進一步促進耗竭表型窑业。 PD-1 和其他抑制通路是 ICB 藥物的目標钦幔，ICB 藥物會阻斷衰竭的 CD8⁺ T 細胞中的抑制性信號傳導，以挽救其增殖和細胞毒性功能常柄。 ICB 藥物在癌癥治療中的臨床應(yīng)用已導致疾病控制和患者存活率的顯著改善鲤氢，但是很大比例的癌癥患者患有難治性疾病，對 ICB 沒有反應(yīng)或在初始反應(yīng)后進展西潘。提高 ICB 功效的一種策略是同時阻斷在耗竭的 CD8⁺ T 細胞上表達的多種抑制性分子卷玉。為了確定這種組合方法的潛在治療靶點，需要對靶點耗盡的 CD8⁺ T 細胞進行詳細的表型表征喷市。

耗盡的 CD8⁺ T 細胞由具有不同功能相种、抑制性分子表達和組織歸巢模式的不同表型亞群組成。austed progenitor PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞由轉(zhuǎn)錄因子 TCF-1 的表達維持东抹，具有自我更新和產(chǎn)生進一步分化的子細胞的能力蚂子。Transitory PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞是這些祖細胞的直接后代沃测，其特征是效應(yīng)分子的表達和 TCF-1 的缺失。這些transitory cells 是遷移的食茎；在這種狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了癌癥和慢性感染中的循環(huán)抗原特異性 CD8⁺ T 細胞蒂破，以 CX3CR1 表達為標志。在遷移到非淋巴組織后别渔，這些transitory cells 進一步分化為終末分化的populations附迷，抑制分子的表達增加。這些most-exhausted CD8⁺ T 細胞駐留在非淋巴組織中哎媚，效應(yīng)器功能較差喇伯，并且缺乏增殖能力。

這些 CD8⁺ T 細胞群對 PD-1 通路阻斷的反應(yīng)各不相同拨与。 ICB 后觀察到的增殖爆發(fā)需要耗盡的祖細胞群稻据，這會導致暫時效應(yīng)細胞的數(shù)量顯著增加。 ICB 還作用于抗原部位的效應(yīng) CD8⁺ T 細胞买喧，通過增加顆粒酶和穿孔素等分子的表達來改善其效應(yīng)功能捻悯。 鑒于其需要響應(yīng) PD-1 通路阻斷的增殖爆發(fā)，耗盡的 CD8⁺ T 細胞的祖細胞群在腫瘤免疫學研究中受到了極大的關(guān)注淤毛，其中許多已經(jīng)量化了腫瘤浸潤的 TCF-1⁺ 細胞今缚。 然而，腫瘤浸潤性 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞的抗原特異性很少被確定低淡。

在人乳頭瘤病毒陽性 (HPV+) 頭頸部鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性耗盡祖 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞姓言，該細胞生長在口咽淋巴組織中。最近還在黑色素瘤和非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)了類似的祖細胞蔗蹋，其中大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 處于終末分化狀態(tài)何荚。在小鼠模型中，抗原特異性耗盡祖 CD8⁺ T 細胞在腫瘤引流淋巴結(jié)中富集猪杭，并且在慢性感染期間僅在次級淋巴器官中發(fā)現(xiàn)兽泣。然而，尚不清楚腫瘤特異性耗盡的祖 CD8⁺ T 細胞是否存在于大腦中生長的腫瘤中胁孙。在缺乏抗原特異性信息的情況下，通常從表型推斷 CD8⁺ T 細胞功能称鳞。然而涮较，這種方法被一些分子標記在 CD8⁺ T 細胞分化的多個階段的表達所混淆。例如冈止，TCF-1 由幼稚狂票、記憶和衰竭的祖 CD8⁺ T 細胞表達。 CMV 和 EBV 特異性效應(yīng)記憶 CD8⁺ T 細胞共表達 TCF-1 和 TOX熙暴，一種與 T 細胞耗竭相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子闺属，并且在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 EBV 和流感特異性 CD8⁺ T 細胞慌盯。此外，據(jù)報道掂器，大腦駐留記憶細胞可維持抗原非依賴性 PD-1 表達亚皂。

在這里，對 31 名接受手術(shù)切除大的和/或有癥狀的腦轉(zhuǎn)移瘤的患者的腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞及其周圍 TME 進行了詳細的表征国瓮。腦轉(zhuǎn)移灶被 CD8⁺ T 細胞充分浸潤灭必，其中大部分是 PD-1⁺。使用單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)乃摹，在浸潤腦轉(zhuǎn)移的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞中鑒定了四個clusters：分裂細胞禁漓、終末分化細胞和兩個與衰竭的祖細胞共享一些表型特征的細胞群。這前兩個cluster彼此共享顯著的克隆重疊孵睬，但與祖細胞樣種群具有最小的 T 細胞受體 (TCR) 重疊播歼。我們系統(tǒng)地鑒定了腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞中微生物抗原特異性的bystander細胞；這些在終末分化和分裂的群體中很少見掰读，并且具有類似于衰竭祖細胞的表型秘狞。bystander在腦轉(zhuǎn)移浸潤的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞和循環(huán) PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞中以相似的頻率存在。為了確定腫瘤內(nèi)特定 CD8⁺ T 細胞克隆的位置磷支，我們使用一種新方法從空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)中獲取 TCR 序列谒撼，并表明來自每個表型群體的 CD8⁺ T 細胞在空間上僅限于腦轉(zhuǎn)移 TME 的特定區(qū)域，具有不同的基因表達模式和細胞因子譜雾狈±保總之，我們的結(jié)果表明善榛，腦轉(zhuǎn)移被不同的 CD8⁺ T 細胞群體浸潤辩蛋，這些 CD8⁺ T 細胞采用特定的表型，并根據(jù)抗原特異性分離到 TME 內(nèi)的不同niche中移盆。這些數(shù)據(jù)可以指導治療腦轉(zhuǎn)移瘤的新型免疫治療策略悼院。

Results

Human brain metastases are well-infiltrated by CD8⁺ T cells

在超過 18 個月的時間里，我們從埃默里大學醫(yī)院的 31 名接受了至少一個腦轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)切除的患者中收集了新鮮的腦轉(zhuǎn)移腫瘤標本和匹配的血液樣本咒循。 樣本是在手術(shù)切除時新鮮獲得的据途，包括多種原發(fā)腫瘤類型的混合物，其中最豐富的是肺癌叙甸，這與它是最有可能轉(zhuǎn)移到大腦的原發(fā)癌癥一致颖医。所有患者都未接受免疫治療。 通過流式細胞術(shù)定量所有樣品的免疫浸潤裆蒸。 一部分樣本用于高參數(shù)流式細胞術(shù)熔萧、單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)、T 細胞受體 (TCR) 測序和具有空間分辨轉(zhuǎn)錄組學的免疫組織化學.

腦轉(zhuǎn)移灶被免疫細胞浸潤，范圍從每克腫瘤 2.9 x 10⁴ 到 2 x 10⁷ 個 CD45⁺ 淋巴細胞不等（中位數(shù)為 7.6 x 10⁵）佛致，其中乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶的浸潤密度最低贮缕。 CD8⁺ T 細胞浸潤也各不相同（范圍為 3.4 x 10³ 至 1.5 x 10⁷，中值 2.0 x 10⁵ CD8⁺ T cells/gram of tumor）俺榆，乳腺癌組織學再次顯示浸潤密度最低感昼。 盡管樣本之間存在顯著差異，但無論原發(fā)腫瘤類型如何肋演，CD8⁺ T 細胞在腦轉(zhuǎn)移灶中的淋巴細胞比例相似抑诸。

A subset of brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells have a progenitor phenotype

為了query腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞的表型，對患者匹配的腫瘤浸潤和循環(huán) CD8⁺ T 細胞進行了高參數(shù)流式細胞術(shù)爹殊。盡管存在一些差異蜕乡，但表達 PD-1 的腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞的頻率在不同的腫瘤組織學中是一致的。我們比較了其他共抑制分子梗夸、轉(zhuǎn)錄因子和效應(yīng)分子顆粒酶 B (GZMB) 在 PD-1^- 和 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞上的表達层玲。與 PD-1^- 細胞相比，TOX 和共抑制分子 TIM3反症、CD39 和 CTLA-4 在 PD-1⁺ 細胞上顯著更高辛块。盡管 CD69 在 PD-1⁺ 細胞上表達更高，但近一半的 PD-1^- 細胞也表達 CD69铅碍，表明這些細胞中的一部分也存在于腫瘤中润绵。雖然效應(yīng)分子 GZMB 和共刺激分子 CD28 在 PD-1⁺ 和 PD-1^- CD8⁺ T 細胞之間的表達相似，但 CD8⁺ T 細胞的祖細胞功能標志物（如 CD127 和 TCF-1）在 PD-1^- 細胞中更高胞谈。

關(guān)于腦轉(zhuǎn)移瘤中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞的豐度和表型知之甚少尘盼，并且不清楚腫瘤特異性耗盡的祖細胞是否存在于這些腫瘤中。 CD127 和 CD28 已被用作慢性感染和癌癥中 TCF-1⁺ 祖 CD8⁺ T 細胞的細胞外標志物烦绳。在腦轉(zhuǎn)移浸潤的 CD8⁺ T 細胞中卿捎，與 PD-1⁺ TCF-1^- 細胞相比，CD28 和 CD127 在 PD-1⁺ TCF-1⁺ 上的表達頻率更高径密，但它們的表達并未完全重現(xiàn) TCF-1 的表達午阵。 CD127 在 PD-1⁺ TCF-1^- 細胞中大部分不存在，但僅在一半的 PD-1⁺ TCF-1⁺ 細胞中表達享扔。 CD28 是一種更敏感的 TCF-1 表達標記物底桂，在超過 75% 的 TCF-1⁺ 細胞上發(fā)現(xiàn)，但缺乏特異性惧眠，在超過 50% 的 TCF-1^- 細胞上表達戚啥。轉(zhuǎn)錄因子 TOX 是 CD8⁺ T 細胞耗竭的標志物和調(diào)節(jié)劑，在癌癥和慢性感染的抗原特異性 CD8⁺ T 細胞上表達锉试。在我們的隊列中，44% 的腦轉(zhuǎn)移浸潤 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞表達 TOX，37% 是 PD-1⁺呆盖； 14% 的 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞共表達 PD-1 和 TOX拖云。因此，盡管腦轉(zhuǎn)移灶中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞的頻率很高应又，但這些細胞表型多樣宙项，僅 TCF-1 表達可能不足以作為腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞祖細胞功能的標志物。

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Phenotypically distinct populations of CD8⁺ T cells infiltrate brain metastases

所有腫瘤浸潤和匹配的循環(huán) CD8⁺ T 細胞的 FlowSOM 聚類確定了六個populations株扛。cluster 1 和cluster 2 優(yōu)先在血液中發(fā)現(xiàn)尤筐，cluster 4 和cluster 5 僅是腫瘤浸潤。cluster 3在血液和腫瘤中以高頻率存在洞就，cluster 6在血液和腫瘤中都是罕見的盆繁。cluster 1 由初始 CD8⁺ T 細胞組成，其特征是表達 CCR7 和 CD45RA旬蟋；它在腫瘤中的低頻率表明腦轉(zhuǎn)移標本的血液污染最小油昂。cluster 2 中的細胞主要是 CD45RA⁺ 并表達高水平的顆粒酶 B。cluster 3 存在于循環(huán)和腫瘤compartments中倾贰，由具有高水平 CD28冕碟、CD127 和 TCF-1 的異質(zhì) PD-1- 和 PD-1dim 細胞組成。cluster 4 和 5 中的細胞均表達 CD69匆浙，這與組織駐留及其在腫瘤中的優(yōu)勢一致安寺。cluster 4 和 5 中的細胞也表達 CD38，TCF-1 和 CD127 的表達量較低首尼；后兩種標志物在腫瘤內(nèi) CD8⁺ T 細胞上的表達主要限于cluster 3挑庶，即腫瘤和循環(huán)compartments之間共享的cluster。cluster 5 似乎是一個耗盡的饰恕、終末分化的 CD8⁺ T 細胞群挠羔，表達 PD-1 以及其他共抑制分子，包括 CTLA-4埋嵌、CD39 和 TIM-3破加。cluster 5 中的大多數(shù)細胞也表達 TOX，并且是 TCF-1^-雹嗦。cluster 6 中的細胞正在分裂 (KI-67⁺) 并表達激活標記范舀，例如 HLA-DR 和 CD38，以及耗竭標記了罪，例如 PD-1锭环。cluster 6 細胞表達 CD28，但 TCF-1 和 CD127 水平低泊藕。

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Brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells comprise four metaclusters with distinct transcriptional phenotypes

對腫瘤相關(guān)病毒和新抗原表位特異的 CD8⁺ T 細胞表達 PD-1辅辩。在我們的隊列中，腫瘤內(nèi)的 PD-1 表達在終末分化的第 5 cluster和分裂細胞中最高。 PD-1 在富含腫瘤的cluster 4 和cluster 3 中的一些細胞中也以較低水平表達玫锋，這在血液和腫瘤之間共享蛾茉。為了確定轉(zhuǎn)錄譜、詢問分化途徑并檢查這些 PD-1 表達細胞的抗原特異性撩鹿，在手術(shù)切除后立即對從三個非小細胞肺癌 (NSCLC) 腦轉(zhuǎn)移瘤和兩個黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移瘤中分離的分選 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞進行了 scRNA-seq 和 TCR 測序谦炬。選擇這兩種組織學是因為它們通常會轉(zhuǎn)移到大腦。還從患者匹配的血液中分選了幼稚 CD8⁺ T 細胞作為對照节沦。從 22,828 個已測序的細胞中键思，我們確定了 14 個 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞群，這些細胞群被分層聚類為 5 個具有相似基因表達模式的meta-cluster：A甫贯、B吼鳞、C、Dividing (D) 和 Na?ve获搏。與我們的流式細胞術(shù)分析一致赖条，原始細胞主要存在于血液中。五名患者中有四名在每個 AD cluster中都有細胞常熙，除了患者 17纬乍，他在meta-cluster C 中沒有細胞。肺癌腦轉(zhuǎn)移與黑色素瘤的腦轉(zhuǎn)移之間每個meta-cluster中的細胞百分比沒有差異裸卫，這表明在我們的隊列中仿贬，起源組織并沒有強烈影響腦轉(zhuǎn)移浸潤的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞的表型。

metaclusters A 和 D 中腫瘤浸潤的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞具有與 FlowSOM cluster 5 相似的終末分化表型墓贿，其特征是編碼共抑制分子的基因高表達茧泪，如 CTLA4、ENTPD1（CD39）聋袋、HAVCR2 (TIM-3) 和 LAG3队伟，與包含腫瘤反應(yīng)細胞的這一populations一致。分裂metacluster中的細胞還通過細胞周期基因的高表達來定義幽勒，例如 MKI67 (KI-67) 和 TOP2A嗜侮。基因集富集分析 (GSEA) 顯示啥容，在 CD8⁺ T 細胞耗竭的鼠 LCMV（淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒）模型中表征的瞬時轉(zhuǎn)錄特征在 Dividing metacluster 中富集锈颗，表明這些細胞可能正在經(jīng)歷從干細胞樣到終末期的分化-分化的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞。metacluster B 和 C 表達最低水平的共抑制標記咪惠。它們通過在metaclsuter C 中組織駐留基因（如 CD69）的更高表達而相互區(qū)分击吱。metaclsuter B 和 C 與終末分化和分裂細胞相比包含具有更高表達祖標記 TCF7 (TCF-1) 和IL7R (CD127)。

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Terminally-differentiated CD8⁺ T cells have minimal clonal overlap with circulating or progenitor-like tumor-infiltrating CD8⁺ T cells

為了確定循環(huán)和腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞之間的克隆關(guān)系遥昧，我們對從患者匹配的外周血中分選的非初始 PD-1⁺ 和 PD-1^- CD8⁺ T 細胞進行了 TCR 測序覆醇。 與循環(huán) PD-1^-CD8⁺ T 細胞相比朵纷，循環(huán) PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞的 TCR 多樣性較低，與腫瘤浸潤細胞的重疊更多永脓。 然而柴罐，循環(huán)和腫瘤浸潤 CD8⁺ T 細胞之間的總體重疊很小，這表明表達富含腫瘤的 TCR 的循環(huán) CD8⁺ T 細胞很少見憨奸。 循環(huán)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞似乎更加罕見，因為來自終末分化細胞的 TCR 在血液中很少被發(fā)現(xiàn)凿试。 確實表達富含血液的 TCR 的腫瘤浸潤細胞主要位于metaclsuters B 和 C排宰。這與流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)一致，其中腫瘤中的 TCF-1 和 CD127 表達僅限于 FlowSOM cluster 3那婉，這個細胞群在血液和腫瘤之間共享板甘。

為了探究腦轉(zhuǎn)移浸潤 PD-1⁺CD8⁺T 細胞的分化途徑，分析了 scRNA-seq metacluster之間的 TCR 重疊详炬。終末分化和分裂細胞（分別為metacluster A 和 D）彼此之間有大量的 TCR 重疊盐类。然而，這些分裂和耗盡的細胞與metaclusters B 和 C 表現(xiàn)出最小的 TCR 重疊呛谜，其中包含具有較少耗盡表型的細胞在跳。每個患者腫瘤內(nèi)的大多數(shù) CD8⁺ T 細胞克隆——尤其是最豐富的克隆——大多僅限于耗盡（metacluster A/D）或祖細胞樣（metacluster B/C）表型，表明這些群體在很大程度上具有未共享的抗原-特異性隐岛。與metacluster B/C 中的細胞相比猫妙，終末分化細胞（metacluster A/D）中的 TCR 多樣性也較低【郯迹基于這些數(shù)據(jù)割坠，假設(shè)metacluster B 和 C 中的細胞可能主要是對非腫瘤抗原特異的記憶bystander CD8⁺ T 細胞，并且在從循環(huán)遷移后已駐留在腫瘤內(nèi)妒牙。

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Brain metastasis-infiltrating bystander CD8⁺ T cells have phenotypic similarities to exhausted progenitor CD8⁺ T cells

以前的研究已經(jīng)確定了腫瘤浸潤的 bystander CD8⁺ T 細胞彼哼，但對腦轉(zhuǎn)移的 bystander 浸潤知之甚少。 我們查詢了 VDJdb湘今，這是一個具有已知特異性的 TCR 數(shù)據(jù)庫敢朱，與來自我們的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 TCR 匹配，并在兩名患者中的每一個中確定了一個 CMV 特異性 TCR象浑。 兩種 CMV 特異性 TCR 均由metacluster B/C 中的細胞專門表達榛瓮。 為了通過實驗query腦轉(zhuǎn)移浸潤bystander CD8⁺ T 細胞的豐度和表型，我們體外擴增了四名患者的 PBMC坊谁，這些患者的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)是可用的矮嫉。 我們用微生物肽池 (CEFX) 刺激這些細胞，通過 FACS 分離 IFNγ+ 和 IFNγ-CD8⁺ T 細胞蚪拦，并對每個子集進行 TCR 測序杖剪，以確定對 CEFX 刺激有細胞因子分泌反應(yīng)的 TCR冻押，因此是微生物特異性的。

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比較來自該測定的 TCR 序列與從上述 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中鑒定的序列顯示盛嘿，CEFX 特異性細胞占腦轉(zhuǎn)移浸潤 PD-1⁺ CD8⁺T 細胞的 0.07% 至 1.70%洛巢。 從表型上看，在所有四名患者的 B/C metacluster中都發(fā)現(xiàn)了 CEFX 特異性腦轉(zhuǎn)移浸潤性 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞次兆，這些細胞顯著富集稿茉。 中位數(shù)為 1.9% 的metacluster B/C 細胞是 CEFX 特異性的，而metacluster A 和 D 為 0.07%芥炭，總循環(huán) PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞為 1.1%漓库。 值得注意的是，來自患者 17 的 12.3% 的metacluster B/C 細胞是 CEFX 特異性的园蝠。 重要的是渺蒿，這些經(jīng)過實驗驗證的bystander細胞中的一些具有與其他研究中表征的腫瘤特異性祖細胞 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞相似的轉(zhuǎn)錄表型，以 IL7R（CD127）彪薛、TOX 和 TCF7（TCF-1 ）的表達為標志 茂装。 在腫瘤內(nèi)的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞中，IL7R 和 TCF7 在 CEFX 特異性細胞上的表達最高善延。

鑒于通過這種方法測試的已知微生物 T 細胞表位數(shù)量很少少态，并且循環(huán)和腫瘤浸潤 PD-1⁺ T 細胞之間的bystander 、非腫瘤特異性細胞的頻率相似挚冤，人腦轉(zhuǎn)移灶中總bystander 細胞的頻率可能要高得多况增。 此外，考慮到與腫瘤浸潤性終末分化細胞和循環(huán)細胞相比训挡，metacluster B/C 中 CEFX 特異性細胞的富集澳骤，很可能metacluster B/C 中的許多細胞對非腫瘤抗原具有特異性并且不具有在腫瘤內(nèi)產(chǎn)生具有終末分化表型的細胞。 雖然這些數(shù)據(jù)并不排除腦轉(zhuǎn)移灶中存在小的腫瘤特異性耗盡祖細胞群澜薄，但大部分腫瘤浸潤的 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞似乎是非腫瘤抗原特異性的bystander 細胞为肮。

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CD8⁺ T cell phenotype is related to spatial distribution within the tumor

鑒于與腫瘤內(nèi)的其他亞群相比，終末分化細胞的不同表型和抗原特異性肤京，我們假設(shè)腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞的每個亞群可能位于 TME 的不同區(qū)域內(nèi)颊艳，因此從周圍組織接收不同的信號。 為了測試這一點忘分，我們在六個腦轉(zhuǎn)移組織切片上進行了空間轉(zhuǎn)錄組學棋枕，一種原位測量基因表達的方法：一個黑色素瘤、一個腎細胞癌妒峦、一個乳腺癌和三個肺癌重斑。 基于基因表達對捕獲點進行聚類，并且基于 H&E 染色中的外觀對每個聚類進行注釋肯骇。

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腫瘤實質(zhì)——指的是腫瘤細胞區(qū)域——和周圍的基質(zhì)很容易通過它們的基因表達譜來區(qū)分窥浪。 對于腫瘤正常邊界清晰可見的切片祖很，腫瘤實質(zhì)和周圍基質(zhì)之間差異表達的基因數(shù)量范圍為 3,914-7,480。 在腫瘤實質(zhì)和基質(zhì)混合的兩個樣本中漾脂，兩個區(qū)域之間差異表達的基因數(shù)量為637和2,327假颇。 六個組織切片之一完全由腫瘤實質(zhì)組成，排除了該分析骨稿。

TME 異質(zhì)性和免疫浸潤之間的相互作用很明顯笨鸡。在腎細胞癌病例中，腫瘤“small nests” ”的CD8A坦冠、CD8B和CD4表達密度高于腫瘤的“l(fā)arge nests” ”镜豹，血管周圍結(jié)締組織增生區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平甚至更高。此外蓝牲，在腫瘤實質(zhì)和腦組織可見的兩個肺癌樣本中，CD3E 轉(zhuǎn)錄水平在腫瘤與腦的界面處最高泰讽。在腫瘤實質(zhì)被炎癥包圍的黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移組織切片的示例中（患者 16）例衍，CD3E、CD4已卸、CD8A 和 CD8B 轉(zhuǎn)錄本的密度在腫瘤周圍炎癥和直接相鄰的腫瘤實質(zhì)中最高佛玄。總之累澡，這些結(jié)果與之前的觀察結(jié)果一致梦抢，即與腫瘤核心相比，免疫細胞在腦轉(zhuǎn)移的外圍區(qū)域富集愧哟。 在黑色素瘤樣本中奥吩，與 CD8⁺ T 細胞的終末分化表型相關(guān)的基因表達，如 HAVCR2 (TIM-3)蕊梧、LAG3霞赫、CXCL13 和 GZMB 在炎癥附近的腫瘤實質(zhì)中最高，而祖標志物 TCF7 (TCF-1) 和 IL7R (CD127) 在炎癥基質(zhì)中的表達最高肥矢，表明免疫細胞表型確定其在不同 TME 中的位置端衰。在黑色素瘤樣本中，與 CD8⁺ T 細胞終末分化表型相關(guān)的基因甘改，如 HAVCR2 (TIM-3)旅东、LAG3、CXCL13 和 GZMB十艾，在炎癥附近的腫瘤實質(zhì)中表達最高抵代。總之疟羹，這些數(shù)據(jù)表明 CD8⁺ T 細胞表型和腦轉(zhuǎn)移 TME 內(nèi)的位置是相關(guān)的主守。

Terminally-differentiated CD8⁺ T cell clones are preferentially located in the tumor parenchyma

定義這些 CD8⁺ T 細胞表型的基因也可能由 TME 內(nèi)的其他細胞表達禀倔，例如 CD4⁺ T 細胞。 因為已經(jīng)證明腦轉(zhuǎn)移瘤中的 TCR 克隆受到表型限制——也就是說参淫，表達單個 TCR 的細胞主要在 scRNA-seq metacluster A/D 或 B/C 內(nèi)救湖，但不是兩者——TCR 在腫瘤內(nèi)的定位將允許腫瘤內(nèi)特定 CD8⁺ T 細胞表型的可視化。 為了確定腦轉(zhuǎn)移 TME 中 CD8⁺ T 細胞是否存在空間限制涎才，開發(fā)了一種從空間轉(zhuǎn)錄組學基因表達文庫中擴增 TCR 轉(zhuǎn)錄本的方法鞋既。 通過將空間轉(zhuǎn)錄組學和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的 TCR 克隆聯(lián)系起來，我們可以確定具有特定轉(zhuǎn)錄表型的 CD8⁺ T 細胞在 TME 中的位置耍铜。

在對其進行空間轉(zhuǎn)錄組學的六個組織中邑闺，來自新鮮組織的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)可用于兩個 - 患者 15 和 16，分別是肺癌和黑色素瘤樣本棕兼。 在黑色素瘤樣本（患者 16）中陡舅，我們觀察到具有 metacluster A/Dividing 表型的 CD8⁺ T 細胞克隆主要位于腫瘤實質(zhì)中，而具有 metacluster B/C 表型的 CD8⁺ T 細胞克隆主要存在于腫瘤周圍炎癥中 . 不僅metacluster A/Dividing TCR 在腫瘤實質(zhì)中富集伴挚，而且與具有metacluster B/C 表型的那些相比靶衍，在腫瘤外發(fā)現(xiàn)的具有這種表型的 TCR 克隆也優(yōu)先位于更靠近腫瘤邊界的位置。 這些發(fā)現(xiàn)在肺癌腦轉(zhuǎn)移（患者 15）中得到證實茎芋，其中整個組織切片是腫瘤實質(zhì)颅眶，僅由metacluster A/分裂細胞表達的 TCR 駐留。

鑒于 TME 內(nèi)特定位置的特定 CD8⁺ T 細胞子集的這種偏好田弥，我們試圖確定它們是否根據(jù)它們的位置接收不同的信號輸入涛酗。因此，比較了腫瘤不同空間基因表達cluster之間的轉(zhuǎn)錄譜偷厦。在腎細胞癌樣本（患者 24）中商叹，基因表達因腫瘤結(jié)構(gòu)而異：305 個基因在腫瘤的小巢和大巢之間差異表達。與大腫瘤巢相比只泼，小腫瘤巢內(nèi)的 MHC I 表達更高沈自，這表明同一腫瘤內(nèi)的 CD8⁺ T 細胞可能會根據(jù)它們在實質(zhì)內(nèi)的位置接受不同水平的 TCR 刺激。在黑色素瘤樣本（患者 16）中辜妓，564 個基因在炎癥附近的腫瘤區(qū)域和腫瘤實質(zhì)的其余部分之間差異表達枯途。與實質(zhì)的其余部分相比，外周炎癥附近腫瘤中 MHC I 和 MHC II 的轉(zhuǎn)錄水平更高籍滴，這表明該區(qū)域腫瘤特異性細胞的 TCR 刺激最大酪夷。相反，在乳腺癌樣本（患者 24）中孽惰，MHC I 在包含腫瘤實質(zhì)的捕獲點中高度下調(diào)晚岭，這可能表明該患者的 CD8⁺T 細胞的腫瘤相關(guān)抗原呈遞有限。在黑色素瘤樣本（患者 16）中勋功，CXCL9坦报、CXCL10库说、CXCL11 和 CXCL13 以及 TGF-β 在外周較高，這表明該區(qū)域的 T 細胞與更深瘤內(nèi) T 細胞相比受到獨特的趨化因子和細胞因子環(huán)境的影響片择。

大塊腫瘤實質(zhì)和周圍組織之間細胞因子和趨化因子表達的差異也是明顯的潜的。 例如，TGFB1（編碼 TGF-β）在三個樣品的基質(zhì)中富集字管，而其受體主要在薄壁組織中表達更高啰挪。 IFN-γ 受體亞基 IFNGR2 在五個腫瘤中的四個的實質(zhì)中升高。 VEGFA 和 VEGFB 在所有五種腫瘤的實質(zhì)中均上調(diào)嘲叔。 鑒于腫瘤中表型和克隆受限的 CD8⁺ T 細胞亞群的差異定位亡呵，我們的結(jié)果共同表明抗原信號（或缺乏）將這些不同的 CD8⁺ T 細胞亞群驅(qū)動到腦轉(zhuǎn)移內(nèi)的特定壁龕，在那里它們接收明顯不同的信號輸入.

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Discussion

在這項工作中硫戈，描述了人腦轉(zhuǎn)移的 CD8⁺ T 細胞浸潤锰什，這是許多癌癥類型發(fā)病率和死亡率的重要原因。 維持大腦獨特的免疫特權(quán)環(huán)境的血腦屏障 (BBB) 似乎在腦轉(zhuǎn)移瘤中分解丁逝。 由此產(chǎn)生的血腫瘤屏障 (BTB) 具有更高的滲透性歇由，但保留了 BBB 的一些特征，并因腫瘤類型而異果港。 盡管腦轉(zhuǎn)移瘤對 ICB 有一些反應(yīng)，但理論上糊昙，BTB 創(chuàng)造的半特權(quán)免疫環(huán)境可以限制免疫細胞進入和/或維持進入腦轉(zhuǎn)移瘤 TME辛掠。 在這里，我們展示了人腦轉(zhuǎn)移瘤被 CD8⁺ T 細胞充分浸潤释牺，盡管浸潤程度因患者而異萝衩。

我們發(fā)現(xiàn)與患者匹配的血液相比，不同的 CD8⁺ T 細胞亞群填充了腦轉(zhuǎn)移没咙。腫瘤內(nèi)的大多數(shù) CD8⁺ T 細胞是 PD-1⁺猩谊，我們的 scRNA-seq 分析將這些 PD-1⁺ 細胞聚集成分裂和終末分化的細胞——它們是克隆相關(guān)的——以及兩個共享 TCR 重疊的不太耗竭的細胞亞群彼此但不與分裂或終末分化的細胞〖栏眨總體而言牌捷，腫瘤浸潤和循環(huán) PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞之間的 TCR 重疊較低，這與 HPV+ 頭頸癌患者中明顯缺乏循環(huán)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞一致涡驮。然而暗甥，消耗較少的腫瘤浸潤細胞確實與循環(huán)細胞有有意義的克隆重疊，而終末分化的腫瘤浸潤細胞則很少捉捅。值得注意的是撤防，我們發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移瘤包含非腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞，這些細胞表達在耗盡的祖細胞群中也發(fā)現(xiàn)的標記物棒口，并且在腫瘤浸潤和循環(huán) PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞中的頻率相似寄月。最后辜膝，我們將這些表型和克隆受限的 CD8⁺ T 細胞與 TME 內(nèi)的離散空間偏好聯(lián)系起來。與耗竭相關(guān)的 CD8⁺ T 細胞克隆在腫瘤實質(zhì)內(nèi)富集漾肮，其中局部細胞因子和趨化因子環(huán)境與周圍基質(zhì)顯著不同厂抖，在那里發(fā)現(xiàn)耗竭的 CD8⁺ T 細胞克隆較少〕蹰伲基于這些發(fā)現(xiàn)验游，我們的數(shù)據(jù)支持一個模型，其中 CD8⁺ T 細胞以不依賴抗原的方式浸潤腦轉(zhuǎn)移的 TME保檐。一旦 CD8⁺ T 細胞保留在腫瘤中耕蝉，抗原信號或缺乏抗原信號就會促使 CD8⁺T 細胞募集到 TME 內(nèi)的空間生態(tài)位。在每個 TME 生態(tài)位內(nèi)夜只，CD8⁺ T 細胞表型隨著來自周圍細胞因子環(huán)境的輸入而進化垒在，并且取決于抗原特異性，持續(xù)的 TCR 刺激扔亥。

這項工作解決的一個關(guān)鍵問題是 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞在人腦轉(zhuǎn)移中的作用场躯。 TCF-1 在癌癥和慢性感染小鼠模型中的抗原特異性耗盡祖 CD8⁺ T 細胞上表達，并且 TCF-1 已被用作腫瘤免疫學研究中耗盡祖 CD8⁺ T 細胞的標志物旅挤。然而踢关，TCF-1 也在其他 CD8⁺ T 細胞亞群上表達，例如幼稚細胞和記憶細胞粘茄。我們發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移灶中的少數(shù) TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞共表達 TOX 和 PD-1签舞，這兩種蛋白質(zhì)也在耗盡的腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞上表達。至關(guān)重要的是柒瓣，我們發(fā)現(xiàn)有Bystander細胞對滲入腦轉(zhuǎn)移灶的微生物抗原具有特異性儒搭，并且這些細胞的一個子集與耗盡的祖 CD8⁺ T 細胞共享表型特征 - 例如 TCF-1 表達。Bystander 克隆在循環(huán)和腫瘤浸潤的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞中以相似的頻率存在芙贫÷辏基于這些數(shù)據(jù)，我們提出腦轉(zhuǎn)移 TME 中的許多 TCF-1⁺ PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞是Bystander 磺平。由于細胞因子和促炎信號分子的表達增加魂仍，而不是通過抗原驅(qū)動的過程，這些細胞可能會被募集到腫瘤中拣挪。因此蓄诽，腦轉(zhuǎn)移 TME 中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 細胞密度的增加可能表明腫瘤更加發(fā)炎，而不是大量腫瘤特異性耗盡的祖 CD8⁺ T 細胞媒吗。

分析表明仑氛，較少消耗的腦轉(zhuǎn)移浸潤 CD8⁺ T 細胞優(yōu)先保留在腫瘤實質(zhì)周圍的基質(zhì)中。相比之下，終末分化群體優(yōu)先位于腫瘤實質(zhì)內(nèi)锯岖。鑒于Bystander 細胞（采用較少消耗的表型）和終末分化細胞之間的克隆重疊有限介袜，很可能是抗原刺激將終末分化的 PD-1⁺ CD8⁺ T 細胞驅(qū)動到腫瘤實質(zhì)。在腫瘤實質(zhì)內(nèi)出吹，與基質(zhì)內(nèi)的 CD8⁺ T 細胞相比遇伞，這些細胞接收不同的信號輸入，可能促進它們獲得終末分化表型捶牢。例如鸠珠，我們表明與基質(zhì)相比，VEGF 表達在腫瘤實質(zhì)中富集秋麸；已發(fā)現(xiàn) VEGF 信號傳導可促進 CD8⁺ T 細胞上的 PD-1渐排、CTLA-4、TIM-3 和 TOX 表達灸蟆。這與我們在終末分化的 CD8⁺ T 細胞上觀察到的這些分子的更高表達一致驯耻。

在scRNA-seq 數(shù)據(jù)中鑒定的分裂 CD8⁺ T 細胞metacluster可以代表腫瘤特異性 TCF-1⁺ 耗盡祖細胞和終末分化細胞之間的中間分化狀態(tài)。人腦轉(zhuǎn)移瘤中的這些分裂細胞與暫時性抗原特異性 CD8⁺ T 細胞共享基因特征炒考，CD8⁺ T 細胞是 T 細胞耗竭的 LCMV 小鼠模型中淋巴駐留的衰竭祖細胞和非淋巴駐留的終末分化細胞之間的中間分化狀態(tài).在小鼠腫瘤模型中的工作表明可缚，腫瘤特異性耗盡的祖 CD8⁺ T 細胞存在于腫瘤引流淋巴結(jié)中，并且它們與腫瘤浸潤斋枢、終末分化的 CD8⁺ T 細胞克隆相關(guān)帘靡。此外，在小鼠模型中維持抗原特異性 CD8⁺ T 細胞需要淋巴結(jié)駐留祖細胞遷移到腫瘤瓤帚；瘤內(nèi) TCF-1⁺ 腫瘤特異性細胞不是自我維持的群體描姚。在轉(zhuǎn)移性癌癥的情況下，根據(jù)疾病的負擔缘滥，可能有許多腫瘤引流淋巴結(jié)的解剖部位，所有這些部位都可能含有腫瘤特異性耗盡的祖 CD8⁺T 細胞谒主。最近描述了一種引流大腦的淋巴系統(tǒng)朝扼，并表明頸部淋巴結(jié)也可以作為腦轉(zhuǎn)移特異性祖細胞 CD8⁺ T 細胞的儲存庫。我們的數(shù)據(jù)并不排除在腦轉(zhuǎn)移 TME 中存在少量腫瘤特異性祖細胞耗竭 CD8⁺ T 細胞霎肯，但表明這些其他位點可能是腫瘤特異性耗竭祖細胞的重要儲存庫擎颖。

Our findings have a number of therapeutic implications. First, the dense infiltration of brain metastases by CD8⁺ T cells provides a rational basis for the use and development of immunotherapies in the brain metastasis setting. Next, our data support the use of combination therapies with PD-1 pathway blockade to enhance rescue of exhausted, tumor-specific CD8⁺ T cells by targeting additional inhibitory molecules expressed on brain metastasis-infiltrating terminally-differentiated CD8⁺ T cells, such as CTLA-4 and LAG3. These terminally-exhausted CD8⁺ T cells within the TME may re-gain effector function with PD-1 blockade and/or combination therapies that lead to enhanced tumor cell killing. Finally, targeting the unique signaling niches in which brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells reside provides an additional opportunity to harness the immune system to improve disease control in the brain. Together our findings support the continued development of immunotherapeutic strategies that harness the anti-tumor efficacy of brain metastasis- infiltrating CD8⁺ T cells.

Method（主要是空間上尋找TCR克隆的方法）

Spatial transcriptomics，看來空間上的TCR克隆也是空間轉(zhuǎn)錄組文庫的特異性PCR观游，這個可以參考我之前分享的文章10X空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)創(chuàng)新之同時測RNA和TCR（BCR）

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