Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune-dysfunction in pancreatic cancer

空間分辨多組學(xué)單細胞分析揭示胰腺癌免疫功能障礙的機制

背景部分

• Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)

  • very aggressive malignant disease
  • extremely poor prognosis ==> complex and dense microenvironment.
  • largely resistant to immunotherapy
    • relatively few coding mutations
    • few neo-antigenic targets embedded in an “immunologically cold” TME with a dominant immunosuppressive myeloid infiltrate ==> impedes intratumoral CD8+ T cell infiltration and activation
  • PDAC的惡性源于其復(fù)雜且密集（dense）的腫瘤微環(huán)境舔痪。PDCA一方面編碼突變較少铃绒，另一方面這種微環(huán)境相對來說是一種冷免疫狀態(tài)希俩，然后有免疫抑制性的髓系細胞浸潤尉剩，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞浸潤和激活減少。

• Early oncogenesis

  • oncogenic driver ==> accumulation of immune and stroma cell components in the tumor microenvironment (TME) ==> immunosuppressive niche that shapes cancer cell states supporting tumor progression

• 盡管最近的里程碑式研究為PDAC中上皮、基質(zhì)和免疫區(qū)室的復(fù)雜性提供了重要的見解

• 對于腫瘤浸潤免疫細胞群药薯，特別是CD4 T細胞和B細胞的亞型和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，以及特定的腫瘤相關(guān)免疫表型救斑，仍知之甚少童本。

• 缺乏相鄰正常胰腺組織對照。

目標

• To further advance the design of immunotherapeutic strategies in PDAC by an improved
  understanding of the unique tumor-related immune landscape.
• 為了通過更好地了解獨特的腫瘤相關(guān)免疫景觀脸候，進一步推進PDAC免疫治療策略的設(shè)計
• scRNA + CyTOF + 空轉(zhuǎn) + mfIHC
• Our data corroborate and further extend previous single-cell analyses of the TME in PDAC, providing a spatially-resolved fine map of the immune ecosystem in PDAC and a comprehensive resource for future functional studies and the exploration of therapeutic strategies in this disease.
• 我們的數(shù)據(jù)證實并進一步擴展了先前對PDAC中TME的單細胞分析穷娱，提供了PDAC中免疫生態(tài)系統(tǒng)的空間分辨精細圖譜，為未來的功能研究和探索該疾病的治療策略提供了全面的資源运沦。

擴展認知泵额，精細描繪

Result

A single cell map of the immune microenvironment in human PDAC

人類PDAC免疫微環(huán)境的單細胞圖譜

我覺得都這兒就是描繪了一下腫瘤內(nèi)細胞的一個分布情況。

單細胞測序
細胞間存在明確界限：

• immune (CD45+,PTPRC)epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM)

• stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)

• 材料：9例原發(fā)PDCA做單細胞測序携添，瘤VS瘤旁

• 用流式分選出足夠的EpCAM- CD45+細胞嫁盲，然后做單細胞測序，其中3個病人還做了CD45-的單細胞測序烈掠。

空轉(zhuǎn)

• 材料：病理切片
• 做多重免疫熒光加空轉(zhuǎn)

細胞學(xué)

• CyTOF和FACS分析白細胞組分
• 患者術(shù)前血樣中獲得的PBMC

免疫學(xué)評估

• 應(yīng)用mfIHC評估了30名患者的外科切除標本中的免疫亞型羞秤，并根據(jù)TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中未接受治療的PDAC患者隊列驗證了結(jié)果。

結(jié)果

• 19229 tumor cell / 3744 non-tumor cell
• 20,000 read pairs per cell

• 無監(jiān)督聚類 + UMAP降維：12個聚類（大部分聚類在9個患者中都有左敌，且是PDAC和相鄰組織共有）

  
  
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進一步驗證

• scRNAseq鑒定的主要免疫亞群瘾蛋，應(yīng)用多重IHC驗證：腫瘤組織中CD4 T細胞、Tregs和ur巨噬細胞的顯著富集矫限。

  
  
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• 進一步分析TME內(nèi)所有主要細胞類型的相鄰情況瘦黑，及其與腫瘤（這兒感覺是邊界）的接近程度（圖1D-F）

• 表明腫瘤免疫細胞的相互作用在空間上受到限制，只有成纖維細胞和樹突狀細胞（DC細胞）聚集在腫瘤邊界

  
  
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CD8 T and NKT cell function is dysregulated in the tumor microenvironment in PDAC

PDAC腫瘤微環(huán)境中CD8+ T細胞和NKT細胞功能失調(diào)

這兒為了進一步分析CD8+ T細胞的情況。

聚焦分析CD8+ T細胞

• 進一步分析CD8+ T細胞的亞群情況幸斥，腫瘤和相鄰非腫瘤樣本共有6個定義明確的亞群（圖2A，B）咬扇。
• 表達多種抑制性受體的
  • 初始CD8 T細胞（Naive CD8）
  • 耗竭的CD8 T（CD8-Tex）細胞
• 根據(jù)GZMK甲葬、GNLY和IFNG的差異表達鑒定了三組CD8 T效應(yīng)細胞（CD8-Teff）
  • CD8-Teff-GZMK
  • CD8-Teff-GNLY
  • CD8-Teff-IFNG

• 還一組CD8組織駐留記憶（CD8 tissue-resident memory，CD8-Trm）

  
  
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GZMK 分子靶點綜述
顆粒酶是絲氨酸蛋白酶懈贺，由細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞釋放的胞質(zhì)顆粒所分泌经窖。顆粒酶可誘導(dǎo)病毒感染細胞的凋亡，從而殺死它們梭灿。人的顆粒酶包括顆粒酶A画侣、顆粒酶B、顆粒酶H堡妒、顆粒酶K和顆粒酶M
GNLY：編碼顆粒溶素的基因 同用名: LAG2; NKG5; LAG-2; D2S69E; TLA519
顆粒溶素（英語：Granulysin配乱，又譯為“顆粒溶解素”）
該基因的產(chǎn)物是類皂苷蛋白 (SAPLIP) 家族的成員，位于 T 細胞的細胞毒性顆粒中皮迟，在抗原刺激時釋放搬泥。這種蛋白質(zhì)存在于細胞毒性 T 淋巴細胞和自然殺傷細胞的細胞毒性顆粒中，對結(jié)核分枝桿菌和其他生物體具有抗菌活性伏尼。已經(jīng)鑒定出編碼不同亞型的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄物變體忿檩。
GZMB 分子靶點綜述
顆粒酶B(GranzymeB)是一種絲氨酸蛋白酶，最常見于細胞毒性淋巴細胞(CTLs)和自然殺傷細胞(NK細胞)顆粒中爆阶。由這些細胞分泌的GranzymeB和穿孔蛋白一起作用介導(dǎo)靶細胞的凋亡燥透。最近，人們發(fā)現(xiàn)許多非細胞毒性細胞從嗜堿性粒細胞辨图、肥大細胞到平滑肌細胞也可產(chǎn)生GranzymeB班套。GranzymeB通過刺激細胞因子的釋放參與誘導(dǎo)炎癥，同樣也參與細胞外基質(zhì)重塑徒役。升高的GranzymeB水平與許多自身免疫性疾病孽尽、一些皮膚病和1型糖尿病有關(guān)。
IFNG 分子靶點綜述
IFN-γ主要由Th1型細胞產(chǎn)生忧勿，屬于II型細胞因子中干擾素家族中的一員杉女，是一類分泌型糖蛋白，由143個氨基酸組成鸳吸，相對分子質(zhì)量是16942熏挎。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)晌砾，介導(dǎo)細胞免疫坎拐，加強受體介導(dǎo)的吞噬功能，增強巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷活性，具有抗病毒感染及抗腫瘤等生物學(xué)活性哼勇。
PRF1（穿孔素 1）功能概要
該基因編碼的蛋白質(zhì)與在免疫中很重要的補體成分 C9 具有結(jié)構(gòu)相似性都伪。這種蛋白質(zhì)形成膜孔，允許釋放顆粒酶和隨后的靶細胞細胞溶解积担≡删В孔的形成是發(fā)生在靶細胞的質(zhì)膜中還是發(fā)生在靶細胞內(nèi)的內(nèi)體膜中尚有爭議。該基因的突變與多種人類疾病相關(guān)帝璧，包括糖尿病先誉、多發(fā)性硬化癥、淋巴瘤的烁、自身免疫性淋巴組織增生綜合征 (ALPS) 褐耳、再生障礙性貧血和家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥 2 型 (FHL2) ，這是一種罕見且致命的兒童早期常染色體隱性遺傳病.

觀察結(jié)果渴庆，non Tumor vs Tumor

• 與鄰近的正常組織相比铃芦，CD 8-Teff-GZMK和CD 8-Teff-GNLY細胞在腫瘤中的豐度顯著降低（補充圖2B）。

  
  
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細胞層面差異基因分析

• CD8-Teff簇的差異基因表達分析顯示把曼，CD8-Teff-GNLY細胞在整個Teff簇中表達相對較高水平的細胞毒性模塊（補充圖CD）杨帽，這些模塊在腫瘤浸潤的CD 8-Teff細胞群中顯著下調(diào)（前文圖C和補充圖E-G）
• 注： 這兒的GZMB，PRF1嗤军，GLNY都在瘤內(nèi)低表達注盈，三種腫瘤中都是這樣的。
  
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這種T細胞分群存在什么樣的進化趨勢叙赚？

• 進化軌跡分析老客。

• 初始CD8 T細胞位于軌跡路徑的開始，CD8-Tex震叮、CD8-Teff-IFNG和CD8-Teff-GZMK細胞大多位于末端狀態(tài)（圖2D）胧砰。

• 注： Tex往T1方向走，IFHG和GZMK往另一個方向苇瓣。
  

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• 沿著這兩個軌跡尉间，衰竭和免疫功能障礙的信號被上調(diào)，而幼稚和細胞毒性的信號被下調(diào)（這個和前文PDAC里面細胞毒性模塊下調(diào)我理解是一致的）击罪，這表明PDAC中的CD8 T細胞逐漸獲得衰竭和功能障礙的表型哲嘲。（H-T1；I-T2）

  
  
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驗證

• 通多重免疫熒光媳禁，進一步驗證了PDAC TME中有CD8 Tex的存在（表達各種抑制性受體）（2E）眠副。我們進一步分析了CD8 T細胞的空間分布，特別是穿孔素表達標記的細胞毒性亞群（PRF1竣稽？）囱怕。
• PRF1+ CD8+ T細胞幾乎不存在于PDAC TME內(nèi)霍弹，并且傾向于在腫瘤邊緣處、接近CD163+的巨噬細胞周圍略微富集
• F：腫瘤組織的7-Panel多重IHC娃弓。放大區(qū)域顯示箭頭標記的PRF1+CD8+T細胞典格。
• G、H：PDAC里大部分是PRF1-的忘闻，邊界外PRF1+明顯增多钝计。

• I：不同種類細胞間的相對距離。

  
  
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PDAC & LUAD

• 評估兩類腫瘤的浸潤性T細胞的頻率和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)齐佳。
• LUAD中沒找到CD8+ Trm（圖J）
• LUAD中，CD8+ Teff具有更高水平的PRF1和GZMB债沮，說明有更高的細胞毒性潛力炼吴，同時PDCD1和CTLA4水平更高。
• 注： 這兒感覺可以說明這種腫瘤的免疫治療效果會比較好疫衩？

程序性細胞死亡蛋白 1 (PDCD1) （其實就是PD-1）
是一種在活化 T 細胞中表達的免疫抑制受體硅蹦；它參與 T 細胞功能的調(diào)節(jié)，包括效應(yīng) CD8+ T 細胞的功能闷煤。此外童芹，該蛋白還能促進 CD4+ T 細胞分化為 T 調(diào)節(jié)細胞。 PDCD1 在包括黑色素瘤在內(nèi)的多種腫瘤中表達鲤拿，并已證明在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用假褪。此外，這種蛋白質(zhì)已被證明參與了自身免疫的防御近顷，然而生音，它也有助于抑制有效的抗腫瘤和抗微生物免疫。
CTLA4 分子靶點綜述
細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)蛋白 4 (CTLA-4)窒升，又名 CD152缀遍，是免疫球蛋白超家族中的成員，在輔助型 T 細胞表面表達饱须。 CTLA-4 類似于 T 細胞的共刺激蛋白 CD28域醇，它們都結(jié)合 CD80 和 CD86。CTLA-4 傳遞抑制信號給 T 細胞蓉媳，而 CD28 則傳 遞刺激信號譬挚。CTLA-4 可作為免疫檢查點發(fā)揮功能、下調(diào)免疫系統(tǒng)督怜、當結(jié)合抗原遞呈細胞表面的 CD80 或 CD86 時作為“關(guān) 閉”開關(guān)殴瘦。細胞內(nèi)的 CTLA-4 同樣存在于調(diào)節(jié)性 T 細胞中，對它們的功能發(fā)揮是重要的号杠。該基因突變與胰島素依賴型糖尿病蚪腋、甲狀腺機能亢進丰歌、橋本甲狀腺炎、乳糜瀉屉凯、系統(tǒng)性紅斑狼瘡立帖、甲狀腺相關(guān)眼病、 原發(fā)性膽汁性肝硬化和其它自身免疫性疾病有關(guān)悠砚。CTLA-4 基因的多態(tài)性與自身免疫性疾病如自身免疫性甲狀腺疾病和多 發(fā)性硬化癥有關(guān)晓勇，但這種關(guān)聯(lián)性通常較弱。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中灌旧，人們發(fā)現(xiàn)可溶性 CTLA-4 的剪接變異體異常產(chǎn)生绑咱，且存 在于患有該病的患者血清中。

聚焦NKT

• 基于scRNAseq進一步鑒定NKT細胞（也是細胞毒細胞）（圖1B枢泰，補充圖1B）描融。
• mfIHC證實non-tumor和tumor區(qū)域均存在CD3+ CD56+ 細胞（NK細胞的marker、圖3A）衡蚂。
• 與CD8-Teff細胞類似窿克，NKT細胞具有更高的細胞毒性潛力，其特征是在鄰近的非腫瘤組織中GZMB毛甲、GNLY和PRF1的表達更高年叮，而在腫瘤部位，免疫抑制分子的表達升高（圖3B）玻募。

T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域(TIGIT) 是一種在淋巴細胞上表達的抑制性受體只损，最近作為癌癥免疫治療的主要新興靶點受到廣泛關(guān)注。
CCL5 分子靶點綜述
趨化因子配體5(CCL5)补箍，又名RANTES改执，是一種趨化細胞因子。它可趨化T細胞坑雅、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞辈挂，在招募白細胞到炎癥位點發(fā)揮著積極的作用。在T細胞釋放的細胞因子如IL-2和IFN-γ的幫助下裹粤，CCL5可誘導(dǎo)某些自然殺傷細胞(NK)增殖和活化形成CC趨化因子活化的殺傷(CHAK)細胞终蒂。CCL5也是一種由CD8+T細胞釋放的HIV抑制因子。最近遥诉，研究者正在開發(fā)完善乳酸菌體內(nèi)產(chǎn)生CCL5的方案拇泣，以期其成為抑制HIV進入的局部殺菌劑。

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TME中的NKT不成熟
有趣的是矮锈，IRF8霉翔，一種已知對NK細胞功能成熟至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在非腫瘤區(qū)域的NKT細胞中表達水平更高（圖3C）苞笨，表明在TME中债朵，NKT細胞在功能上仍不成熟子眶。

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全身循環(huán)中NKT的情況

• 流式顯示：外周NKT細胞表現(xiàn)出更強大的細胞毒性前表型，具有更高的穿孔素表達和更高的細胞毒性活性序芦，這在腫瘤浸潤的NKT細胞中幾乎完全減弱（D臭杰、E）。

  
  
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• 此外谚中，腫瘤浸潤的NKT細胞表現(xiàn)出：

• 異常耗竭的表型（共表達TIM3渴杆、LAG3和CTLA4，圖F）

• 主要調(diào)節(jié)表型為CD4宪塔、IL-4和IL-13（圖G）磁奖。

  
  
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腫瘤細胞的一個空間情況

• NKT細胞傾向于在腫瘤邊界富集（圖3H，I）

  
  
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• 小背景： 導(dǎo)管/腫瘤細胞和NKT細胞之間的許多免疫調(diào)節(jié)相互作用是通過配體-受體分析來推斷的某筐。這兒包括：

  • MIF / CD74（促進腫瘤免疫逃避）
  • NKG2A / HLA-E（損害NKT細胞的細胞毒性活性并限制抗腫瘤免疫反應(yīng)）

• 以上這些interaction在不用細胞類型中都有出現(xiàn)点寥，感覺就是可以促進腫瘤的惡性表型（圖3J）。

• 而且来吩，與CRC、GC和LUAD的NKT細胞相比蔽莱，PDAC中效應(yīng)分子的表達尤其受損（圖3K）弟疆。

  
  
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Tumor-infiltrating CD4 T cells have an exceptionally dysfunctional phenotype in pancreatic cancer

腫瘤濾過性CD4 T細胞在癌癥中具有異常的功能異常表型

注： 前文講了中的免疫圖景，講了CD 8和NKT盗冷，現(xiàn)在開始講CD 4了怠苔？

FNG 分子靶點綜述
IFN-γ主要由Th1型細胞產(chǎn)生，屬于II型細胞因子中干擾素家族中的一員仪糖，是一類分泌型糖蛋白柑司，由143個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量是16942锅劝。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生攒驰，具有調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)，介導(dǎo)細胞免疫故爵，加強受體介導(dǎo)的吞噬功能玻粪，增強巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷活性，具有抗病毒感染及抗腫瘤等生物學(xué)活性诬垂。

• 先是找了單細胞做聚類劲室，這次基于已知的marker特征聚出六類。（圖A-C）
  • naive CD 4
  • 激活的 CD 4 T細胞（CD 4 Tact-IFGN结窘、TNF很洋、TNFSF9）
  • 記憶性 CD 4 T細胞（CD 4 Tmem-IL7R、CD40LG隧枫、LTB喉磁、KLF2）
  • Treg（FOXP3谓苟、IL2RA14）
  • 兩種CD 4 T細胞耗竭的pattern（圖C）
    • CD 4 Tex（PDCD1、TIGHT线定、CTLA4娜谊、CXCL13）
    • CD 4 CD52（CD52、RORA斤讥、（腫瘤部位CCL2纱皆、CCL5、CCL20也高））（引導(dǎo)Tregs和巨噬細胞進入TME）

一些觀察結(jié)果

• 在PDAC中芭商，初始CD4 T細胞大多進展為Treg和CD4CD52亞型（圖D）
• 腫瘤與瘤旁的分布情況（圖E派草、F）
  • CD4-Tex簇幾乎完全來自腫瘤樣本的。
  • Tregs铛楣、CD4-Tact-IFNG近迁、CD4-Tmem在腫瘤部位積聚

  • 而CD4CD52細胞在相鄰的非腫瘤區(qū)域內(nèi)相對豐富

    
    
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驗證

• mfIHC分析證實了TME中存在耗盡的CD4 T和Treg表型（圖G）

  
  
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• TIGIT表達標記的CD4 T細胞在腫瘤附近和內(nèi)部顯示出更高的豐度

  
  
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• 針對PDAC和PBMC進行CyTOP：

  • Treg在腫瘤部位積聚

  • 而全身水平上的CD 4 T細胞擴增主要為CD 4 Tmem

    
    
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• 注： PDAC的TME中的細胞介導(dǎo)了免疫抑制。

PDAC vs LUAD

• CD 4 CD 52 T細胞簇在LUAD中完全不存在
• CD 4-Tex細胞相對更豐富
• 在PDAC和LUAD中觀察到Tregs的相對豐度相似簸州，但在PDAC中Tregs顯示出顯著更高的抑制性受體表達（圖J）

• 類似地鉴竭，PDAC中的CD4-Tex細胞表達更高水平的抑制性受體TIGIT（圖K）。

  
  
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B lymphocytes in the pancreatic cancer microenvironment exhibit a regulatory, immunosuppressive phenotype

胰腺癌癥微環(huán)境中的B淋巴細胞表現(xiàn)出調(diào)節(jié)性免疫抑制表型

注： 接著做B細胞

整體分布
B細胞似乎分散在整個PDAC TME中岸浑，但在腫瘤上皮細胞附近減少（圖E）搏存。

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分類

• 聚類，基于marker分成4類

• MS4A1/CD 20低表達矢洲，SDC1/CD138 高表達

• MS4A1/CD 20高表達的B細胞

  • 進一步基于轉(zhuǎn)錄表達聚類：
  • naive B
  • class-switched memory B

  • plasmablast B（和漿母細胞表達譜一致）

    
    
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• 盡管所有3個B細胞亞群都存在于正常鄰近組織和腫瘤組織中璧眠，但腫瘤浸潤的原始和記憶B細胞表達的TGFB1水平升高。

  
  
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分析細胞間作用情況

• 細胞鄰近度分析：B細胞和T細胞以及巨噬細胞之間的物理距離略短（圖1里面的）读虏。

  
  
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• 基于scRNAseq進行細胞間通訊分析：表達TGFB1的B細胞傾向于與CD8 T細胞和巨噬細胞相互作用（圖C）

• PDAC和LUAD中B細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組的比較顯示

  • LUAD中幼稚B細胞的頻率顯著更高责静，而記憶B細胞和漿母細胞在PDAC中相對更豐富（圖D）

  • PDAC中腫瘤浸潤的幼稚B細胞表達顯著更高水平的TGFB1 Pr（圖E）

    
    
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Myeloid cells in the PDAC TME are largely skewed towards tumor-promoting subsets

PDAC TME中的髓細胞在很大程度上偏向于腫瘤促進亞群

注： 接著做髓系細胞

分類

• 聚類，基于canonical markers分成4類
  • C1Q macrophages
  • MARCO macrophages
  • CD14+ monocytes
  • CD16+ monocytes

MARCO是巨噬細胞表面的一種清道夫受體（scavenger receptor盖桥，SR）灾螃。. SR受體家族包含許多受體，大量的研究集中在心血管疾病中SR受體的模式識別功能葱轩，而對癌癥中的SR受體的作用知之甚少睦焕。. 此前已有研究表明，在實體瘤小鼠模型中靴拱，使用MARCO抗體可以逆轉(zhuǎn)TAM的免疫抑制作用垃喊，并減少腫瘤的進展。

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• 所有4個亞類都可以在腫瘤和鄰近的正常組織中鑒定
• 經(jīng)典的CD14+ 單核細胞在TME中相對更豐富

• C1Q巨噬細胞在鄰近的正常細胞中富集袜炕。

  
  
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驗證巨噬細胞

• mfIHC驗證了腫瘤和鄰近正常區(qū)域中存在兩種表型不同的巨噬細胞亞群（圖D）本谜。

• 進一步去比較這兩種亞群（圖E）

  • C1Q亞群表達了更高水平的參與抗原呈遞和共刺激的基因
  • MARCO巨噬細胞的特征是維持腫瘤促進微環(huán)境的基因表達更高

• 基因集富集分析（GSEA）證實了這一點（圖F）。

  
  
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驗證單核細胞

• PDAC浸潤的CD14+單核細胞群體表達高水平的參與血管生成和免疫調(diào)節(jié)的基因偎窘，表明其對腫瘤的促進作用

• 而不太豐富的非經(jīng)典CD16+單核細胞顯示出促炎表型

  
  
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PDAC vs LUAD

• 單核細胞的相對比例在PDAC和LUAD之間具有可比性
  

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• 在PDAC TME中乌助，C1Q和MARCO巨噬細胞以相等的比例存在溜在，但在LUAD中，巨噬細胞主要為C1Q型（圖H他托，是不是說明驗證更明顯）

• 在PDAC的MARCO巨噬細胞中掖肋，與免疫抑制細胞類型募集相關(guān)的趨化因子（CCL2、CCL20）的表達顯著更高（圖I）

  
  
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Tumor-infiltrating dendritic cells in PDAC have a dysfunctional phenotype with traits of impaired cross-presentation capability

PDAC中的腫瘤浸潤性樹突狀細胞具有功能失調(diào)的表型赏参，其交叉呈遞能力受損

注： 接著做DC細胞志笼，快做完了嗚嗚嗚嗚。

分類

• 聚類把篓，基于常用標記分成5類
• 兩個傳統(tǒng)DC（在瘤內(nèi)均較低）
  • cCD1
  • cCD2（主要）
• 在TME中發(fā)現(xiàn)了三個額外的DC群體纫溃。
  • 一組活化的DC，共預(yù)表達與DC成熟和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因韧掩，類似于其他實體癌中富含免疫調(diào)節(jié)分子（mregDCs）的成熟DCs紊浩，（也表達IDO1、LGALS9疗锐、IL6和STAT3坊谁，可能減弱T細胞活化和細胞毒性）
  • 一簇潛在的單核細胞衍生的DC（MoDC）（高表達的促炎細胞因子）

  • 一組漿細胞樣DC（pDC），（高表達ICOSLG和TGFB1）

    
    
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驗證

• mfIHC分析證實了PDAC TME中滑臊，cDC2是最豐富的DC群體

  
  
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PDAC vs LUAD

• PDAC和LUAD之間的DC亞群比例相似
• 但在PDAC中
  • cDC1表達的抗原交叉呈遞相關(guān)基因（HLA-A呜袁、HLA-C、TAP2和PSMB9）水平顯著較低
  • CCL17和IL8水平較高：可能促進Treg遷移和血管生成简珠。

• 在LUAD中，cDC1表達高水平的CXCL9（可能與CD8 T細胞募集到TME中有關(guān)）

  
  
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The spatial composition of the immune microenvironment in PDAC and its interrelation with regional epithelial transcriptional states

PDAC免疫微環(huán)境的空間組成及其與區(qū)域上皮轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的相關(guān)性

注： 終于到我心心念念的空轉(zhuǎn)力虹钮！好讀完感覺是集中吐槽的一個Section

小目標

為了進一步研究PDAC中免疫細胞亞型的空間分布及其與惡性上皮細胞的關(guān)系聋庵，我們對組織切片進行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。

分析圖像

• 在PDCA樣本上標注腫瘤芙粱、腫瘤-基質(zhì)界面和周圍基質(zhì)祭玉，并在spot陣中進行可視化（圖A）。
• 已知在許多癌癥類型中起作用的基因在腫瘤區(qū)域過度表達（圖B）

• 餅圖用于顯示每個點的單個細胞類型的分布（圖C）春畔。

  
  
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注： 這兒想說幾句脱货，這個區(qū)域腫瘤實在是太小了，小的離譜律姨。其次直接把單細胞那么多個類都map過來振峻，出來的結(jié)果就很搞，這個就花的不談择份，根本感覺看不出太多有用的信息扣孟。不知道一共做了幾張空轉(zhuǎn)，如果就這一張荣赶，感覺沒啥意思凤价。

瘤內(nèi)異質(zhì)性

• 對不同病理注釋區(qū)域中免疫細胞亞型相對比例的量化表現(xiàn)出明顯的瘤內(nèi)異質(zhì)性
• 腫瘤區(qū)域的原始CD8鸽斟、CD8-Trm、cDC1利诺、cDC2富蓄、單核細胞衍生的DC、NK細胞慢逾、C1Q巨噬細胞以及肥大細胞顯著減少（圖D）

cell-cell 交互

• 進一步關(guān)注細胞-細胞相互作用立倍，作者分析了TME中參與免疫反應(yīng)的配體-受體對
• 這闡述了一個抑制T和NK細胞活性以及免疫逃避的環(huán)境（圖7E，F(xiàn)）氛改。
  • LAG3與MHC II類復(fù)合物的基因共表達帐萎，這表明抗原呈遞與免疫檢查點共同調(diào)節(jié)，抑制CD4 T細胞活化胜卤。
  • T和NK細胞上TIGIT的表達與其配體PVR和PVRL2在髓系和上皮細胞上的表達相關(guān)疆导，從而潛在地誘導(dǎo)T細胞和NK細胞中的調(diào)節(jié)性、非細胞毒性特征

  • 圖F示例性地說明了HAVCR2/TIM3和LGALS9的表達水平的相關(guān)性（抑制T細胞活化和細胞毒性）

    
    
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Composition of the immune microenvironment and its association with PDAC patient prognosis

免疫微環(huán)境的組成及其與PDAC患者預(yù)后的關(guān)系

目的和干了啥

• 為了系統(tǒng)地繪制腫瘤浸潤性免疫亞型的組成差異及其對患者生存的影響
• 30名PDAC患者葛躏，15生存期短澈段，15長期生存，沒有新輔的情況下切除術(shù)
• 應(yīng)用mfIHC

結(jié)果：生存

• 根據(jù)scRNAseq分析確定的免疫抑制表型
• 在短期生存隊列中舰攒，B細胞（CD20+）败富、NKT細胞（CD3+CD56+）、NK細胞（CD56+）和選擇性活化巨噬細胞（CD68+CD163+）的比例顯著更高
• 在長期存活者中摩窃，CD4 T兽叮、CD8 T和moDC（CD11C+BDCA1+CD1A+）顯示出顯著更高的豐度

結(jié)果：免疫細胞

• 進一步研究f免疫表型與腫瘤分級的潛在關(guān)聯(lián)
• CD8 T細胞在G2腫瘤中比G3腫瘤中相對更豐富

進一步驗證mfIHC結(jié)果（這兒就是上公共數(shù)據(jù)看看生存合不合前面的marker相符）

• 使用TCGA/ICGC數(shù)據(jù)集（有免疫表達特征相關(guān)資料），并建立了108名治療前無癥狀PDAC患者的隊列猾愿。
• CIBERSORTx用于預(yù)測細胞類型鹦聪，患者根據(jù)TME中免疫細胞亞型的水平進行分層。
• Kaplan-Meier生存分析蒂秘，比較了每種細胞類型的低與高標志性評分的組
  • 結(jié)果顯示泽本，較高的B、NKT姻僧、IL-4+ NKT和選擇性激活的巨噬細胞標志與較短的總生存期顯著相關(guān)
  • 而較高的CD3 T（不包括Tregs和NKT細胞）规丽、CD4 T，CD8 T和CD8 Teff GNLY細胞與較長的生存期相關(guān)

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• 由于腫瘤促進或腫瘤抑制微環(huán)境的形成依賴于多個免疫亞群的協(xié)調(diào)撇贺，我們假設(shè)腫瘤浸潤免疫亞群不同的模式可能是某些預(yù)后亞群的特征赌莺。
• 單變量分析確定了各種免疫亞型的組合關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)與患者生存率相關(guān)松嘶。進一步確定了兩個復(fù)合免疫特征雄嚣，將PDAC患者明確劃分為預(yù)后亞組。
• CD8 T high、CD4 T high缓升、選擇性活化巨噬細胞 low 的腫瘤總生存更長（圖B）

• PDAC TME中CD 8 high申鱼、B cell low珊擂、MARCO巨噬細胞 low總生存更好（圖C）

  
  
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