Highlights

• Tertiary lymphoid structures are sites of in situ B cell maturation toward plasma cells
• IgG+ and IgA+ plasma cells disseminate into the tumor tissue along fibroblastic tracks
• Tumor cells are labeled by locally produced IgG
• Patients with IgG-labeled tumor cells have high response rate to ICI and prolonged PFS

背景知識(shí)：

一級(jí)淋巴器官窑睁，也可以稱為初級(jí)淋巴器官剥险，又稱中樞淋巴器官，主要有胸腺投剥，骨髓和腔上囊（禽類獨(dú)有，或稱法氏囊），這些器官的淋巴細(xì)胞不能直接參與機(jī)體的免疫功能，而要經(jīng)過分化袍暴，才能特異性免疫。一級(jí)淋巴器官是造血干細(xì)胞增殖隶症、分化成為Naive T政模、B淋巴細(xì)胞的場(chǎng)所，并向周圍淋巴器官輸送淋巴細(xì)胞蚂会，促進(jìn)周圍淋巴器官的發(fā)育淋样。
二級(jí)淋巴器官又稱為外周免疫器官或周圍淋巴器官，包括脾胁住、淋巴結(jié)趁猴、咽扁桃體刊咳、闌尾，以及分布在全身的淋巴小結(jié)和淋巴組織儡司。在免疫反應(yīng)的個(gè)體發(fā)育中娱挨，受中樞淋巴組織的影響，是T細(xì)胞和B細(xì)胞等定居和增殖的場(chǎng)所捕犬。外周淋巴器官接受和容納由中樞淋巴器官遷來的淋巴細(xì)胞跷坝。 在抗原刺激下，淋巴細(xì)胞增殖分化碉碉，產(chǎn)生參與免疫應(yīng)答的T效應(yīng)細(xì)胞或漿細(xì)胞柴钻。T效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放各種淋巴因子（lymphokin），漿細(xì)胞分泌抗體垢粮。周圍淋巴器官廣泛分布于全身各重要部位贴届，形成第二道免疫防線。
三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）是后天在非淋巴組織中形成的免疫細(xì)胞的組織聚集物足丢。TLS不是在生理?xiàng)l件下發(fā)現(xiàn)的粱腻，而是在慢性炎癥的背景下產(chǎn)生的庇配，如自身免疫性疾病斩跌、慢性感染和癌癥。TLS的結(jié)構(gòu)與次級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)類似捞慌∫唬可以看成是一個(gè)架構(gòu)在成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上的淋巴細(xì)胞聚集體，包含兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域：T細(xì)胞區(qū)（如下圖啸澡，T cell zone）和（濾泡）B細(xì)胞區(qū)袖订。成熟的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)被定義為存在有生發(fā)中心（Germinal centre，GC）嗅虏，GC內(nèi)含有T濾泡輔助細(xì)胞和濾泡狀樹突細(xì)胞洛姑，GC是產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞的重要場(chǎng)所，其中長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞又可以分泌高親和力的抗體皮服。有研究揭示三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞共同影響了癌癥的預(yù)后以及對(duì)免疫檢查點(diǎn)治療的效果楞艾。而且除了少數(shù)例外，腫瘤中TLS的存在與免疫治療后更好的預(yù)后和臨床結(jié)果相關(guān)龄广。但是晶渠，TLS在癌癥中的形成的驅(qū)動(dòng)因素以及這些結(jié)構(gòu)對(duì)腫瘤內(nèi)免疫反應(yīng)的貢獻(xiàn)仍不完全清楚砰苍，具體是哪種B細(xì)胞和漿細(xì)胞在此發(fā)揮了重要的作用也尚不明確。

腫瘤中三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的組成和功能（Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy）

Science 375, eabf9419 (2022)

SUMMARY

腫瘤內(nèi)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu) (TLS) 的存在與較好的臨床預(yù)后和對(duì)癌癥免疫治療的反應(yīng)有關(guān)。在這里践啄，作者10x Genomics Visium FFPE空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探究了腎細(xì)胞癌 (RCC) 中 TLS 內(nèi) B 細(xì)胞成熟和漿細(xì)胞 (PC) 的形成過程。
B細(xì)胞repertoire分析揭示了 TLS 中的B細(xì)胞克隆的多元化、選擇和擴(kuò)增，以及遠(yuǎn)端完全成熟的克隆型的存在择葡。
在 TLS⁺ 腫瘤中，產(chǎn)生 IgG 和 IgA 的 PC 沿著fibroblastic tracks播散到腫瘤床中痊夭。
TLS⁺ 腫瘤存在大量產(chǎn)IgG 的 PC 和 IgG 染色陽性的凋亡的腫瘤細(xì)胞刁岸，提示了TLS中產(chǎn)IgG PC的抗腫瘤效應(yīng)。在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的 RCC 患者中她我，治療反應(yīng)和無進(jìn)展生存期與 IgG 染色陽性的腫瘤細(xì)胞相關(guān)虹曙。因此，腫瘤內(nèi) TLS 維持與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的 B 細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生番舆，產(chǎn)生直接的抗腫瘤作用酝碳。

該研究的樣本來自3個(gè)隊(duì)列的130個(gè)treatment-naive的ccRCC患者。作者對(duì)其中24個(gè)樣品進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)恨狈，對(duì)全部130個(gè)樣品做了免疫組化疏哗，免疫熒光和基于AI的proximity assessment來分析了腫瘤微環(huán)境的結(jié)構(gòu)。

Figure S1

1. Spatial TME architecture unveils areas of B cell rich hot spots in TLS+ tumors

為了分析TLS對(duì)TME結(jié)構(gòu)的影響禾怠，作者對(duì) frozen (n = 12) 和 FFPE (n = 12) 的24個(gè) ccRCC原發(fā)性腫瘤進(jìn)行了10x空間轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)返奉。（frozen：8個(gè)TLS⁺，4個(gè)TLS^-吗氏；FFPE：10個(gè)TLS⁺芽偏，2個(gè)TLS^-）
在對(duì)切片進(jìn)行 HE 染色后，經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家 (VV) 對(duì)每個(gè)腫瘤的整體組織以及TLS 的存在和定位進(jìn)行了注釋弦讽。Fig 1展示了一個(gè) TLS⁺ 冷凍切片腫瘤（Fig 1A-C）污尉、一個(gè) TLS⁺ FFPE 腫瘤（Fig 1D-F）和一個(gè) TLS^- 冷凍切片腫瘤（Fig 1G-I）。

碳酸酐酶9（蛋白質(zhì)名稱：CAIX往产，基因名稱：Ca9）是ccRCC腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物被碗，在24個(gè)樣品中，23個(gè)檢測(cè)到了Ca9仿村，這和其在大多數(shù)ccRCC腫瘤中表達(dá)相一致锐朴，并且在腫瘤切片中Ca9分布均勻 (Fig 1B, E, H)。使用微環(huán)境細(xì)胞群 (MCP)-counter評(píng)估 TME 的免疫和基質(zhì)細(xì)胞群的分布蔼囊，該counter可以從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)估計(jì)細(xì)胞類型豐度¹焚志。在下圖所示的 TLS⁺ 腫瘤中，B 細(xì)胞譜系（包含識(shí)別從幼稚細(xì)胞到 PC 的所有成熟步驟的基因）和 T 細(xì)胞（識(shí)別不同的 T 細(xì)胞群）基因特征優(yōu)先在TLS 區(qū)域中表達(dá)（Fig C, F） 压真。
對(duì)TLS和其他腫瘤區(qū)進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)TLS區(qū)的B細(xì)胞譜系和T細(xì)胞評(píng)分更高(p < 2e–16 respectively, Fig S2 A, B)娩嚼。而且腫瘤表現(xiàn)出 CD8 T 細(xì)胞特征的低表達(dá)，但在 TLS 區(qū)域略有富集（p = 0.017）滴肿。 TLS 中的單核細(xì)胞譜系特征略高（分別為 p = 0.00081 和 p = 0.035）岳悟，而 NK 細(xì)胞更廣泛地分布在整個(gè)腫瘤切片中。內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均勻分布，在 TLS 內(nèi)得分較低）贵少，而在 TLS 區(qū)域發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞特征的高表達(dá)呵俏。
TLS^- 腫瘤沒有顯示出上述組織模式(Fig 1I)，MCP counter 分析顯示 B 細(xì)胞譜系評(píng)分非常低且分散分布滔灶，其他免疫和基質(zhì)也是分散分布普碎。這些不同的 TME 空間組織模式在 8 個(gè) TLS⁺ 和 4 個(gè) TLS^- 冷凍切片腫瘤以及 10 個(gè) TLS⁺ 和 2 個(gè) TLS^- FFPE 腫瘤中始終可以識(shí)別，這表明 TLS 與 B細(xì)胞譜系录平、T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的表達(dá)有關(guān)麻车。

Fig 1

Figure S2, frozen

Figure S2, FFPE

Figure S3

2. Immunoglobulin (Ig) gene expression inside and at distance from TLS

為了確定 TLS 在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)印記，作者在冷凍切片的連續(xù)切片上通過CD20/CD3/PD-1三色 IF 確認(rèn)了 HE 定義的 TLS 位置(Fig 2A, B)斗这，在 FFPE 樣品上通過CD3/CD20的IHC確認(rèn)了 HE 定義的 TLS 位置(Fig 2F, G)动猬。隨后作者在 TLS 和腫瘤區(qū)域之間進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。

通過留一交叉驗(yàn)證(leave-one-out cross validation)對(duì) 4 個(gè)冰凍的 TLS+ 腫瘤進(jìn)行了 TLS 印記markers的研究 (a method that performs sequential permutations by identifying genes from 3 tumors and validating them on the fourth one)表箭。平均 FC > 2 且 p.adj < 0.05（Bonferroni 校正）的基因被納入分析 (Fig S3A)赁咙。作者在signature中選擇了在至少 3 個(gè) TLS+ 腫瘤中表達(dá)AUC>= 0.7 的基因 (是單個(gè)基因?qū)LS區(qū)和非TLS區(qū)的區(qū)分度>=0.7嗎？)免钻，得到了 29 個(gè)基因的 TLS imprint signature (Figures S3B and S3C)彼水。該特征包括 12 個(gè)免疫球蛋白基因（IGHA1、IGHG1极舔、IGHG2凤覆、IGHG3、IGHG4姆怪、IGHGP叛赚、IGHM澡绩、IGKC稽揭、IGLC1、IGLC2肥卡、IGLC3 和 JCHAIN）溪掀、5 個(gè) B 細(xì)胞標(biāo)志物（CD79A、FCRL5步鉴、MZB1揪胃、SSR4 和 XBP1）， 2 個(gè) T 細(xì)胞標(biāo)志物（TRBC2 和 IL7R）氛琢、2 個(gè)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物（CXCL12喊递、LUM）、2 個(gè)補(bǔ)體蛋白編碼基因（C1QA 和 C7）阳似，以及 CD52骚勘、APOE、PTLP、PTGDS俏讹、PIM2 和 DERL3 基因当宴。這 29 個(gè)基因signature是 TLS imprint的標(biāo)志物，其在discovery冰凍 TLS+ 腫瘤的 AUC 范圍為 0.89 至 0.97泽疆，而在其余validation冰凍 TLS+ 腫瘤中户矢，其AUC 范圍為 0.77 至 0.94 (Figures 2A–2C) 。該特征在12 個(gè) FFPE 腫瘤上也得到進(jìn)一步驗(yàn)證(Figures 2F–2H)殉疼。在 9/10 TLS+ 腫瘤中梯浪，該特征 AUC 范圍為 0.75 至 0.93。但一個(gè)樣本例外瓢娜，AUC 為 0.62 且 TLS 印記特征表達(dá)較弱驱证。該腫瘤缺乏 TLS 成熟度標(biāo)志物，例如 CD23 和 BCL6恋腕，以及外周淋巴結(jié)尋址素陽性 (PNAd+) 高內(nèi)皮小靜脈 (HEV)抹锄。在 4 個(gè)冰凍和 2 個(gè) FFPE TLS^- 腫瘤中僅觀察到印跡特征的稀疏表達(dá)，除了一個(gè)腫瘤(a_1)荠藤，盡管通過 HE 染色和 CD3-CD20 IF 標(biāo)記沒有觀察到 TLS伙单，基因特征識(shí)別出了表達(dá) MZB1 PC 相關(guān)基因和 IGHG1 的小區(qū)域。

Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS 印記特征中的顯著富集促使作者特別關(guān)注了 B 細(xì)胞哈肖。首先是想要精確定位與 TLS 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性 B 細(xì)胞亞型吻育。作者通過robust cell type decomposition RCTD的方法² 使用扁桃體 B 細(xì)胞單細(xì)胞分析³中定義的 B 細(xì)胞亞群對(duì)空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了空間映射。發(fā)現(xiàn)naive B 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)較低(Figure 2D)淤井，盡管其與 TLS 顯著相關(guān)(Fig S2C)布疼。并且發(fā)現(xiàn) FCRL4+ 記憶 B 細(xì)胞(p < 2e?-16)，GC B 細(xì)胞 (p = 0.0087) 和漿母細(xì)胞(漿細(xì)胞前體)(p = 2e?-16)與TLS 特征相關(guān)(Figures 2D and S2C)币狠。PC 相關(guān)基因 MZB1 在 TLS 中表達(dá)較高游两，而在冷凍切片的腫瘤區(qū)域中總體低 (p = 2e?-16) (Figure S2C)。在 FFPE 腫瘤中也得到了類似的結(jié)果 (Figures 2I, S2D)漩绵。然而贱案，在腫瘤內(nèi)的不同位置也觀察到許多分散的、遠(yuǎn)離 TLS 的 MZB1 表達(dá)點(diǎn)(Figures 2D and 2I)止吐。 MZB1 是漿母細(xì)胞特征的一部分宝踪，在 PCs 中高度表達(dá)。由于漿母細(xì)胞僅限于 TLS 區(qū)域(Figures 2D and 2I)碍扔，并且在 TLS 外發(fā)現(xiàn) MZB1 的高表達(dá)瘩燥，因此表達(dá) MZB1 的 PC 可能不僅存在于 TLS 中，而且存在于腫瘤bed中不同。由于 PC 的主要功能是產(chǎn)生抗體厉膀，于是作者分析了免疫球蛋白基因的空間表達(dá)。 IGHM 幾乎只在 TLS 區(qū)域表達(dá)(p < 2e?-16)，進(jìn)一步證明了 TLS 內(nèi)non-switched B 細(xì)胞的存在站蝠，而 IGHG1汰具、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的幾何平均值）基因在 TLS 區(qū)域高度表達(dá)，但也在腫瘤其他區(qū)域表達(dá)(Figures 2E, 2J, S2C, and S2D)菱魔。IGHG1 和 IGHA1 的分散表達(dá)表明isotype-switched PC 已在 TLS 中形成并出現(xiàn)遠(yuǎn)處遷移留荔。

未成熟B細(xì)胞和初始B細(xì)胞：mIgM⁺
成熟B細(xì)胞：mIgM⁺ mIgD⁺
活化并發(fā)生過抗體類別轉(zhuǎn)換：mIgG⁺, mIgA⁺, mIgE⁺(產(chǎn)生的分泌型抗體一部分會(huì)暫時(shí)留在B細(xì)胞表面，成為活化B細(xì)胞的標(biāo)志)

值得注意的是澜倦，在與泛 Ig 基因（IGKC聚蝶、JCHAIN）、IGHG1 和 IGHA1 基因相同的位置發(fā)現(xiàn)了泛成纖維細(xì)胞標(biāo)記 COL1A1 的高表達(dá)以及 MCP-counter 成纖維細(xì)胞特征(Figures 1C, 1F, 2E, and 2J)藻治。此前有報(bào)道顯示CXCL12 與位于骨髓碘勉、淋巴結(jié)髓索和慢性炎癥組織中的 PC 生態(tài)位中的 PC 遷移和滯留有關(guān)，我們分析了 CXCL12 的表達(dá)桩卵，發(fā)現(xiàn)它與 MZB1 的表達(dá)共定位 (Figure S4A)验靡。

為了進(jìn)一步評(píng)估這些不同signatures之間的空間共定位，每個(gè)spot中的各個(gè)signature的表達(dá)被通過二分法 (使用中值作為截止點(diǎn))定義為“高”或“低”表達(dá)雏节。當(dāng)一個(gè)基因被兩個(gè)特征共享時(shí)胜嗓，它會(huì)從其中一個(gè)特征中刪除，以避免其對(duì)統(tǒng)計(jì)分析的影響钩乍。因此辞州，當(dāng)分析TLS/MZB1 overlap的時(shí)候，作者從 TLS imprint signature 中刪除了 MZB1寥粹。當(dāng)分析TLS 和 CXCL12 基因表達(dá)之間的重疊時(shí)变过，則刪除了CXCL12。隨后通過計(jì)算兩個(gè)特征之間的卡方檢驗(yàn)來評(píng)估有意義的重疊涝涤，并用黃色突出顯示分類為“高/高”的點(diǎn)媚狰。該分析不僅證實(shí)了 TLS 特征與 MZB1、成纖維細(xì)胞和 CXCL12 的共定位妄痪，而且還證實(shí)了成纖維細(xì)胞與 CXCL12哈雏、MZB1 與成纖維細(xì)胞以及 MZB1 與 CXCL12 在距 TLS 一定距離處的共定位 (Figure S4A)楞件。這些共定位在其他 TLS+ 腫瘤中也得到證實(shí)衫生，而在 TLS-腫瘤中則觀察到輕微或無關(guān)聯(lián)⊥两總體而言罪针，可以得出結(jié)論，在 TLS+ 腫瘤中黄伊，表達(dá) IGHG1 和 IGHA1 的 PC 存在于 TLS 附近泪酱，并且可能與成纖維細(xì)胞相關(guān)地在腫瘤內(nèi)遷移。

Figure 2

Figure S3

Figure S4

3. Spatial B cell receptor (BCR) profiling identifies in situ hypermutation and clonal selection

TLS 中 B 細(xì)胞成熟亞型和 PC 的共定位提示了原位 B 細(xì)胞適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。在這個(gè)過程中墓阀，B 細(xì)胞會(huì)突變其 B 細(xì)胞受體 (BCR) 序列毡惜，并選擇和擴(kuò)增親和力最強(qiáng)的克隆(也就是下面的4)。

免疫系統(tǒng)中TCR和BCR庫包括了很多特異性不同的克隆斯撮，這種多樣性的形成機(jī)制主要包括4種：
（1）組合多樣性：在免疫球蛋白V, (D), J重排的過程中经伙，只能在眾多的V, D, J基因片段中各取1個(gè)，但是每種基因片段都有很多種勿锅。以人的Ig重鏈V區(qū)為例帕膜，其排列組合種類可以達(dá)到40(VH) X 25(VD) X6(VJ)=6000種，以此類推溢十，理論上IgV區(qū)基因片段加上輕重鏈組合后多樣性可以達(dá)到1.9X1000000種垮刹；
（2）連接多樣性：Ig基因片段在進(jìn)行連接的時(shí)候往往有插入、缺失张弛、替換核苷酸的情況發(fā)生荒典，從而產(chǎn)生新的序列或者直接改變插入片段后密碼子閱讀框，這被稱為連接多樣性吞鸭；
（3）受體編輯：有一些識(shí)別自身抗原的TCR种蝶、BCR并未被清除，而是對(duì)受體序列進(jìn)行修改瞒大，從而保留克麦φ鳌；
（4）體細(xì)胞高頻突變：成熟的B細(xì)胞在外周淋巴器官的生發(fā)中心中進(jìn)行抗體親和力成熟的過程中透敌，編碼V區(qū)CDR部位的DNA序列發(fā)生點(diǎn)突變盯滚，從而增強(qiáng)抗體與抗原的親和力。

以上的四種機(jī)制能夠保證在大多數(shù)情況下體內(nèi)都能夠找到對(duì)特定病原體有反應(yīng)能力的B細(xì)胞克滦锏纭（雖然不一定是最適合的）魄藕，機(jī)制(1), (2), (3)也能保證在絕大多數(shù)情況下我們能有合適的T細(xì)胞克隆。

為了證明這些事件撵术，有必要研究 BCRs 的核苷酸序列背率。 Visium 空間技術(shù)基于條形碼轉(zhuǎn)錄本的 RNA 測(cè)序，這使我們得以access原始轉(zhuǎn)錄本并執(zhí)行空間 BCR repertoire 分析嫩与。我們使用了公開可用的MiXCR⁴ (這是一種旨在從 5‘ RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別 BCR IgL 和 IgH 克隆型及其種系體細(xì)胞超突變的工具) 以及 3’ Frozen Visium 試劑盒寝姿，它使我們能夠獲得足夠長(zhǎng)度的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物捕獲大多數(shù) IGL 和一些 IGH 序列的完整互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)3 區(qū)。通過 3 倍推薦深度（每個(gè)點(diǎn) 150,000 個(gè)讀數(shù)划滋，相當(dāng)于每個(gè)樣本 2.25 億個(gè)讀數(shù)）的測(cè)序促進(jìn)了這種捕獲饵筑。MiXCR 鑒定了許多獨(dú)特的克隆型：總共 3,015 個(gè) λ 輕鏈、3,084 個(gè) kappa 輕鏈和325 重鏈处坪。TLS+ 腫瘤中發(fā)現(xiàn)了最多的獨(dú)特克隆型和總 Ig 計(jì)數(shù)根资。在 TLS 區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量最多的獨(dú)特輕鏈克隆型(Figure 3A)架专。B 細(xì)胞成熟是通過測(cè)量 Ig 輕鏈的 V 區(qū)的突變計(jì)數(shù)與映射的 V germline基因進(jìn)行比對(duì)來評(píng)估的。中位 V 基因突變計(jì)數(shù)在 TLS 區(qū)域中顯示低至中位水平玄帕，并且值得注意的是部脚，在腫瘤區(qū)域中遠(yuǎn)離 TLS 的大部分是高度突變的序列 (Figure 3B)。盡管如此裤纹，在 TLS 區(qū)域測(cè)量到了全范圍的突變睛低，包括高度突變的序列，而距 TLS 一定距離的大多數(shù) Ig 轉(zhuǎn)錄物富含高度突變的序列(Figures 3B and 3C)服傍，表明體細(xì)胞高頻突變發(fā)生在 TLS 中钱雷，且突變的 PC 在整個(gè)腫瘤中遷移。作者研究了47 個(gè) ccRCC 腫瘤（包括 Visium 分析的 12 個(gè)冷凍腫瘤）的bulk 5‘ RNA-seq 中的輕鏈和重鏈突變計(jì)數(shù)吹零，這些腫瘤使用 TLS 印記特征的中值表達(dá)被分類為 TLS high或low腫瘤罩抗。對(duì)于 VL（中位 TLS high = 12 個(gè)突變，中位 TLS low = 8 個(gè)突變灿椅，p = 0.0163）和 VH 基因（中位 TLS high = 19）套蒂，中位 TLS low = 13.5 個(gè)突變，p = 0.0227）茫蛹，TLS high與 TLS low腫瘤的總體體細(xì)胞高頻突變都顯著更高 (Figure 3D)操刀。為了確定體細(xì)胞高頻突變是否伴隨著克隆型選擇，作者研究了bulk 5’ RNA-seq 數(shù)據(jù)的 IgH 庫婴洼。TLS high的所有樣本都表現(xiàn)出大量的總克隆型計(jì)數(shù)以及計(jì)數(shù)超過 100 次的更高比例的克隆型(Figure 3E)骨坑。事實(shí)上，30% 的 TLS high 腫瘤庫被識(shí)別超過 100 次的克隆型占據(jù)柬采，而 TLS low腫瘤中這一比例為 1% (p = 10e-7)欢唾，揭示了 TLS 高樣本中持續(xù)的免疫反應(yīng)。相反粉捻，TLS-low 樣本顯示出較少的多樣性礁遣，計(jì)數(shù)較低，大多數(shù)被測(cè)量不到 10 次肩刃，除了一個(gè)腫瘤有 123 個(gè) IgH 克隆型祟霍，只有 2 個(gè)被計(jì)數(shù)超過 100 次(Figure 3E)。

最后盈包，為了確定擴(kuò)增的 IgH 克隆型的克隆關(guān)系和位置沸呐，作者對(duì) 3’RNA-seq 空間數(shù)據(jù)進(jìn)行了克隆性評(píng)估(clonality assessment)。克隆性由相同的 VH 基因家族续语、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 長(zhǎng)度以及 VH 序列之間的 CDR3 核苷酸序列的最大差異為 15% 來定義垂谢。為了可視化這些關(guān)系，作者計(jì)算了每個(gè) VH CDR3 序列之間的 Levenshtein 距離疮茄，并使用圓形樹展示了一個(gè)TLS+ 腫瘤(id: b_1)滥朱。共計(jì) 31 個(gè)具有 2 至 16 個(gè)獨(dú)特成員的克隆家族被鑒定出來 (Figure 3F)。在一個(gè)家族中力试，一些克隆可以在多達(dá) 20 個(gè)不同的空間位置被檢測(cè)到多達(dá) 80 次徙邻。IgH 克隆型在 Visiumslide 上的定位證明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在遠(yuǎn)處稀疏遷移(Figure 3G)。一些克隆型甚至可以在距它們所在的 TLS 區(qū)域高達(dá) 3 mm 處檢測(cè)到可能已經(jīng)生成(Figure 3G)畸裳。為了證實(shí)這些結(jié)果缰犁，作者從配對(duì)的bulk 5’ RNA-seq 推斷的克隆型中尋找從空間 3’ RNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定的克隆型的 CDR3 核苷酸序列。在腫瘤b_1上怖糊，作者鑒定出15個(gè)IGH CDR3序列的存在（共169個(gè)）(Figure 3F)帅容。克隆家族 1 的 CDR3 序列 CATYNAGEGGRGYW 的克隆型也在bulk 50' RNA-seq 數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)伍伤，從而證實(shí)了分析的結(jié)果并徘。此外，這些克隆型位于 TLS 內(nèi)部和遠(yuǎn)離 TLS 的位置扰魂，表明相應(yīng) B 細(xì)胞克隆的遷移麦乞。在 TLS-low 樣本中，檢測(cè)到的克隆型數(shù)量非常少劝评，限制了對(duì) Ig 轉(zhuǎn)錄物的分析姐直，也支持了腫瘤內(nèi) PC 主要在 TLS 中產(chǎn)生的假設(shè)。 總之蒋畜，這些數(shù)據(jù)支持原位 TLS 介導(dǎo)的成熟声畏，允許在腫瘤的各個(gè)區(qū)域選擇、克隆擴(kuò)增和傳播選定的 PC姻成。

Figure 3

4. Plasma cells disseminate from TLS along fibroblastic tracks

為了分析腫瘤內(nèi) PCs 和成纖維細(xì)胞的位置以及原位 CXCL12 的表達(dá)砰识，作者使用了多重 IF對(duì) FFPE 腫瘤切片進(jìn)行了染色（使用多發(fā)性骨髓瘤癌基因 1 (MUM1) (IRF4) 作為 PCs的標(biāo)志，使用COL1 (Col1a)作為成纖維細(xì)胞的標(biāo)志）佣渴。在 TLS 區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到雙陽性 MUM1+ IgG+ PC 和一些 MUM1+ IgA+ PC辫狼，由連續(xù)切片上的顯色 CD3/CD20 標(biāo)記定義 (Figure 4A)。在這些區(qū)域觀察到 COL1+/CXCL12+ 成纖維細(xì)胞與 MUM1+ PC 緊鄰(Figure 4B)辛润。此外膨处，在遠(yuǎn)離 TLS 的地方證明了 PC 沿著成纖維細(xì)胞軌道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中(Figure 4C, zoom 1,2)砂竖，從而證明它們?cè)谀[瘤床中的遷移真椿。為了定量評(píng)估 PC 和成纖維細(xì)胞之間的空間關(guān)系，作者對(duì) DAPI/MUM1/IgG/IgA IF 染色樣品上的成纖維細(xì)胞核進(jìn)行了 AI 檢測(cè)乎澄。如下圖所示突硝，成纖維細(xì)胞核的檢測(cè)映射了 COL1+ 成纖維細(xì)胞軌跡 (Figures 4D, 4E, 4H, and 4I)。絕大多數(shù) PC 與成纖維細(xì)胞核非常接近置济，兩個(gè)腫瘤的平均距離分別為 17.5 和 19 um (Figures 4G, K)解恰。在 44 個(gè)腫瘤樣本上測(cè)得的平均距離為 25.7 um锋八。總而言之护盈，這些數(shù)據(jù)展示了 Ig 和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共表達(dá)挟纱，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和 CXCL12 的共表達(dá)，并驗(yàn)證了 PC 在 TLS 內(nèi)的位置以及空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞 (FRC) 空間上的位置腐宋。值得注意的是紊服，在被 MUM1+ IgG+ 成纖維細(xì)胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的 IgG (Figures 4F, J)。

5. TLS and Ig-producing PCs are associated with IgG antibodies bound to apoptotic tumor cells and with response to immunotherapy

為了進(jìn)一步研究 TLS胸竞、腫瘤內(nèi) PC 和 Ig 染色之間的聯(lián)系欺嗤，作者首先分析了 TLS 成熟度。 成熟 TLS 的特點(diǎn)是 GC 包含一個(gè)被 T 細(xì)胞區(qū)包圍的 B 細(xì)胞區(qū)卫枝，其中存在 CD4+PD1+ T 細(xì)胞煎饼、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh 細(xì)胞和產(chǎn) CXCL13 的細(xì)胞 (Figure 5B)。 GC 區(qū)的特點(diǎn)是在外圍檢測(cè)到 CD23+ 濾泡樹突細(xì)胞 (FDC)剃盾、BCL6+ CD20+ B 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 網(wǎng)絡(luò)(Figure 5C)腺占。 作者研究了 103 個(gè)腫瘤中 TLS 的存在與 PC 密度之間的相關(guān)性。 觀察到 TLS 的存在與 MUM1+ IgG+ 細(xì)胞和 MUM1+ IgA 細(xì)胞的密度之間存在顯著關(guān)聯(lián)(Figure 5D)痒谴。 作者進(jìn)一步研究了 57 個(gè) TLS+ 樣本上 TLS 成熟度標(biāo)記與 MUM1+IgG+ 和 MUM1+IgA+ PCs 密度的相關(guān)性衰伯。 發(fā)現(xiàn)含有 CD23+ FDC 網(wǎng)絡(luò)、BCL6+ 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 與 MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性 (Figure 5E)积蔚。

Figure 5

在腫瘤巢周圍檢測(cè)到高密度的產(chǎn)生 Ig 的 PC 和在腫瘤巢中觀察到 IgG 促使研究抗腫瘤抗體的存在(Figures 4F and 4J)意鲸。 值得注意的是，在 TLS+ 腫瘤中觀察到了CAIX+腫瘤細(xì)胞膜和anti-human IgG連接的強(qiáng)信號(hào)尽爆，在TLS-腫瘤中則沒有觀察到(Figure 6A)怎顾。 隨后對(duì) 103 個(gè)腫瘤的量化顯示 IgG 陽性率很高，與 TLS- 腫瘤相比漱贱，TLS+ 中的腫瘤細(xì)胞高達(dá) 100%（中位數(shù)分別為 70% 和 30%槐雾，p = 0.0046）(Figure 6B; Table S3)。 在 TLS+ 和 TLS- 腫瘤中均觀察到弱 IgA 標(biāo)記 (Figure 6F; Table S3)幅狮。 此外募强，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞上的 IgG 標(biāo)記與 MUM1+ IgG+ PC 的腫瘤浸潤(rùn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)（MUM1+IgG+ 高腫瘤的中位 IgG 標(biāo)記 = 80%，MUM1+IgG+ 低腫瘤的中位 IgG 標(biāo)記 = 40%崇摄，p = 0.000195） (Figure 6C)擎值，IgA 標(biāo)記則非常低(Figure 6D)。

為了揭示腫瘤結(jié)合 IgG 抗體的潛在功能逐抑，作者使用檢測(cè)cleaved caspase 3的抗體檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)胞凋亡跡象鸠儿，通過其典型的大細(xì)胞核和透明細(xì)胞表型鑒定。下圖展示了在 一個(gè) TLS+ 和一個(gè) TLS- 腫瘤中cleaved caspase 3的染色情況厕氨。 在 IgG 染色高于 60%（這是區(qū)分兩個(gè)腫瘤群的最佳平均值）的腫瘤中进每，cleaved caspase 3+ 腫瘤細(xì)胞的密度顯著高于 IgG+ 腫瘤細(xì)胞低于 60% 的腫瘤（中位數(shù)：12.7 個(gè)細(xì)胞/ mm2 和 7.2 個(gè)細(xì)胞/mm2汹粤，p = 0.0255）(Figure 6F)。

作者隨后關(guān)注了可能在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中起作用的機(jī)制品追。由于巨噬細(xì)胞和 NK 細(xì)胞是抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC) 的主要效應(yīng)物玄括，作者分別評(píng)估了 76 和 98 個(gè)腫瘤上 CD68+ 巨噬細(xì)胞和 NKp46+NK 細(xì)胞的總密度冯丙，發(fā)現(xiàn)它們喝cleaved caspase-3+ 腫瘤細(xì)胞密度沒有相關(guān)性肉瓦。然而，發(fā)現(xiàn)具有大量凋亡細(xì)胞和高百分比 IgG 染色腫瘤細(xì)胞的腫瘤比具有大量凋亡細(xì)胞但低百分比 IgG 染色腫瘤細(xì)胞的腫瘤更容易被 CD68+ 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（p = 0.0054 ）(Figure S6A)胃惜。Proximity assessment證明 14 個(gè)腫瘤上 CD68+ 巨噬細(xì)胞和cleaved caspase 3+ 腫瘤細(xì)胞呈正相關(guān)泞莉，凋亡細(xì)胞數(shù)量多，IgG 染色腫瘤細(xì)胞百分比高(Figure S6B)船殉。NK 細(xì)胞的密度低于巨噬細(xì)胞鲫趁，并沒有表現(xiàn)出這種相關(guān)性(Figures S6C and S6D)。此外利虫，作者發(fā)現(xiàn) 13.6% 的凋亡腫瘤細(xì)胞位于小于 25 mm 的巨噬細(xì)胞處挨厚，而沒有觀察到 NK 細(xì)胞和凋亡腫瘤細(xì)胞之間的緊密接近（中位數(shù) = 0.5%）(Fig- ure S6E)。Figure 6G 展示了CD68+巨噬細(xì)胞和IgG-stained/cleaved caspase 3+腫瘤細(xì)胞之間的close proximity糠惫。

為了評(píng)估 IgG 腫瘤染色對(duì) ICI 治療患者的影響疫剃，我們?cè)u(píng)估了來自 NI 治療患者的 35 個(gè)腫瘤和來自 Nivolumab 治療患者的 16 個(gè)腫瘤（一名 Nivolumab 治療患者的 IgG 腫瘤染色不可評(píng)估，一名患者缺少臨床信息） 硼讽。作者選擇平均 IgG 腫瘤染色 (60%) 作為截止值巢价，因?yàn)樗鼌^(qū)分了最好的兩個(gè)腫瘤群體 (Figure 6H)。對(duì)于 NI 治療的患者固阁，證明了 IgG 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記高于平均值的患者的治療反應(yīng)與 62% 的客觀反應(yīng)（OR：完全和部分反應(yīng)）之間存在顯著關(guān)聯(lián)壤躲，而 IgG 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記低于平均值的患者為 18% OR (p = 0.0384)，以及與低 IgG 腫瘤細(xì)胞染色相比备燃，高 IgG 腫瘤細(xì)胞染色患者的 PFS 顯著延長(zhǎng)（中位 PFS = 16.3 個(gè)月對(duì) 6.4 個(gè)月碉克，p = 0.039）(Figure 6I)。僅接受 Nivolumab 治療的患者隊(duì)列太小并齐，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析漏麦。然而，在接受 ICI 治療的 51 名患者中冀膝，無論是單用 Nivolumab 還是 NI唁奢，對(duì)于腫瘤染色高的患者（未達(dá)到與 6.4 個(gè)月，p = 0.019）相比窝剖，觀察到 PFS 顯著延長(zhǎng)麻掸，并且 OR 數(shù)量呈增加趨勢(shì)（58% 對(duì) 32%）(Figure 6J)。

Figure 6

Figure S6

Reference

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