前期文章：
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解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
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基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過(guò)兩篇：
團(tuán)隊(duì)作案HEK293哺眯，史上最強(qiáng)搬磚細(xì)胞
不想再用慢病毒了唇敞，我還有什么別的選擇嗎墩弯？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個(gè)CRISPR screening的專題兰英，只有開頭玷坠，未得完善：精準(zhǔn)大海撈針--5. CRISPR screening專題
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在將CRISPR脫靶效應(yīng)時(shí)劲藐，我們?cè)谖哪┨岬紺RISPR編輯效率與P53狀態(tài)之間的關(guān)系，同時(shí)Cas9穩(wěn)定表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響樟凄，從而增加CRISPR-Cas9的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)聘芜。不禁會(huì)有疑問(wèn)：為何要將CRISPR與P53聯(lián)系在一起？
1. DNA損傷和P53 response
我們首先要了解DNA損傷與P53之間的關(guān)系缝龄，如下圖：
由上圖可見(jiàn)：
左上角：電離輻射（IR）等引起的DNA雙鏈斷裂（DSB）汰现，可經(jīng)由ATM信號(hào)從而激活P53；
右上角：UV等引起的DNA單鏈斷裂或損傷叔壤，可經(jīng)由ATR信號(hào)瞎饲，激活P53。
可見(jiàn)幾乎任何一種DNA損傷都會(huì)導(dǎo)向至P53反應(yīng)炼绘。而我們不止一次強(qiáng)調(diào)嗅战，CRISPR-Cas9的上半部分是引起DNA雙鏈斷裂（DSB），之后通過(guò)不同的修復(fù)方式達(dá)到精準(zhǔn)基因編輯（HDR俺亮，MMEJ）或移碼突變（NHEJ）驮捍。于是，CRISPR作為一種可造成DNA”損傷“的技術(shù)脚曾，該技術(shù)的應(yīng)用不可避免的引起P53反應(yīng)厌漂。
但，P53反應(yīng)和CRISPR技術(shù)應(yīng)用隱患有何關(guān)系斟珊？
2. P53的功能
接著苇倡，我們可以簡(jiǎn)單來(lái)看看P53在生命體中到底有何作用。
抑癌基因：TP53（tumor suppressor protein）可以說(shuō)只知名程度最高的抑癌基因之一（甚至可以說(shuō)是第一）囤踩。在大部分腫瘤中都可檢測(cè)到TP53突變旨椒，同時(shí)腫瘤細(xì)胞又常常表現(xiàn)出基因組紊亂的現(xiàn)象。因此堵漱，人們推測(cè)TP53的突變與腫瘤發(fā)生有關(guān)综慎。隨后有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，TP53在體細(xì)胞突變引起的腫瘤中高度突變勤庐，同時(shí)germline TP53突變的病人也常會(huì)罹患一種甚至多種腫瘤疾病示惊。
基因衛(wèi)士：TP53作為DNA損傷的反應(yīng)機(jī)制，在正常情況下P53蛋白由于MDM2的泛素化從而被快速降解愉镰，因此屬于不穩(wěn)定狀態(tài)米罚。而當(dāng)DNA損傷出現(xiàn)時(shí)，MDM2被磷酸化從而失去泛素化P53的功能丈探，P53的表達(dá)迅速增加录择。而P53作為一種轉(zhuǎn)錄因子，迅速調(diào)控下游的各項(xiàng)指標(biāo)。當(dāng)DNA損傷較輕時(shí)隘竭，P53會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯塘秦，從而給予細(xì)胞DNA修復(fù)的機(jī)會(huì)，經(jīng)過(guò)修復(fù)后的細(xì)胞可再次進(jìn)入細(xì)胞周期动看。而當(dāng)DNA損傷十分嚴(yán)重?zé)o法修飾時(shí)尊剔，P53會(huì)將引導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡，從而避免不良DNA損傷傳遞給子代菱皆。因而赋兵，TP53因其維持基因組穩(wěn)定性的作用，達(dá)到抑癌的效果搔预。
其他：P53的內(nèi)容十分繁多，如P53在腫瘤中的變化大多是錯(cuò)義突變而非缺失叶组，突變的部分大多在DNA binding domain拯田，導(dǎo)致P53功能缺失的突變我們叫“l(fā)oss of function, LOF”。而有一部分P53突變會(huì)產(chǎn)生突變體甩十，該突變體不僅抑制剩余的野生型的P53的功能船庇，同時(shí)自身還擁有新的功能，此時(shí)我們稱之為“gain of function, GOF”侣监，這時(shí)候的P53突變體可被稱為oncogene鸭轮。此外，如P53不僅僅在腫瘤細(xì)胞中有突變橄霉，其實(shí)在正常體細(xì)胞中也常檢測(cè)到突變窃爷，有前兩年有一篇文章詳細(xì)介紹了這部分內(nèi)容，并提出紫外線等是P53突變的主要原因之一姓蜂，所以小伙伴們按厘，防曬搞起來(lái)噻！
綜上所述钱慢，P53作為一個(gè)維持人體基因組穩(wěn)定性的重要基因逮京，如果CRISPR技術(shù)打斷了TP53的功能，那么其后果將相當(dāng)嚴(yán)重束莫。
3. 文獻(xiàn)解讀：P53抑制CRISPR-Cas9編輯
第一篇文章發(fā)便于2018年七月份的Nature Medicine懒棉，從標(biāo)題上很明顯看出內(nèi)容為，P53可抑制CRISPR-Caas9在人多功能干細(xì)胞上的應(yīng)用览绿。
1. 背景和科學(xué)問(wèn)題：起初人們發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞上進(jìn)行基因編輯的效率總是很低策严。
2. 目的和解決辦法：為了提高CRISPR編輯效率，作者通過(guò)以下兩種方式達(dá)成高達(dá)80%的基因編輯效率：
（1) 構(gòu)建Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人多功能干細(xì)胞（human pluripotent stem cell饿敲，hPSC）
如下圖所示享钞，作者將一個(gè)雙Tet-On 3G的Cas9及其篩選標(biāo)記元件插入到AAVS1位點(diǎn)，改系統(tǒng)可控制Cas9表達(dá)的時(shí)間。同時(shí)sgRNA投放方式為慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)栗竖。
(2) 瞬轉(zhuǎn)Cas9-ribonucleoproteins (RNPs)
<u>當(dāng)作者提高基因編輯效率后暑脆，發(fā)現(xiàn)有不少人多功能干細(xì)胞在基因編輯后死亡，這就引起了作者的好奇：緣何死亡狐肢，機(jī)制為何添吗？</u>因此他們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)并最終找到了原因。
3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和主要結(jié)果：
3.1 CRISPR-Cas9可導(dǎo)致人多功能干細(xì)胞（hPSC）死亡
在以往研究中份名，由于基因編輯效率很低碟联，因此沒(méi)有觀測(cè)到CRISPR明顯的細(xì)胞毒性。而當(dāng)作者將編輯效率增加至80%以上以后僵腺，觀測(cè)到了明顯的細(xì)胞毒性現(xiàn)象鲤孵。如下圖所示，（e）在圖e中辰如，通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)Cas9表達(dá)普监，并結(jié)合sgRNA對(duì)MAPT基因進(jìn)行編輯。MAPT基因并不是人多能干細(xì)胞生存所必須的基因琉兜，換言之凯正，敲除該基因不應(yīng)該對(duì)細(xì)胞的生存造成影響。而結(jié)果卻顯示豌蟋，對(duì)MAPT基因編輯的同時(shí)廊散，細(xì)胞團(tuán)塊縮小，證明有大量細(xì)胞死亡梧疲。（h）在圖h中允睹，一樣觀測(cè)到了類似的現(xiàn)象。當(dāng)然還有很多其他證據(jù)支持幌氮，最終文章的結(jié)論為擂找，CRISPR-Cas9基因編輯會(huì)導(dǎo)致hPSC細(xì)胞的死亡。<u>那么CRISPR-Cas9基因編輯導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因到底為何浩销？</u>
3.2 CRISPR-Cas9誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞（hPSC）死亡與Cas9造成的DSB相關(guān)
為了驗(yàn)證CRISPR-Cas9誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞（hPSC）與Cas9誘導(dǎo)的DSB之間的no bias關(guān)系贯涎，而非特定基因編輯導(dǎo)致的死亡。作者對(duì)hPSC進(jìn)行CRISPR文庫(kù)篩選慢洋，通過(guò)查看CRISPR文庫(kù)內(nèi)的sgRNA分布變化查看CRISPR-Cas9與hPSC死亡的關(guān)系塘雳。
注意：下圖中出現(xiàn)的ddCas9是Cas9的一種變體，當(dāng)沒(méi)有Shield1的時(shí)候普筹，ddCas9蛋白降解败明，無(wú)法行使其功能，只有在Shield1存在時(shí)ddCas9才能穩(wěn)定行使功能太防。
如下圖c-d所示：（1）在沒(méi)有基因編輯發(fā)生的H1妻顶，iCas9+Dox組中酸员，無(wú)論是target到目的基因的sgRNA還是沒(méi)有target gene的sgRNA，在12天的篩選之后都沒(méi)有出現(xiàn)sgRNA分布的差異讳嘱。（2）當(dāng)外加Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)幔嗦，或者外加Shield1誘導(dǎo)ddCas9穩(wěn)定之后，CRISPR-Cas9基因編輯的發(fā)生導(dǎo)致了有target的sgRNA分布出現(xiàn)了差異沥潭，證明有 一部分targeting sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞已經(jīng)在基因編輯過(guò)程中死亡邀泉。同時(shí)non-targeting sgRNA比例的增加，反向證實(shí)了一部分targeting sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的消失钝鸽。以上結(jié)果證明了全基因組性的基因編輯導(dǎo)致細(xì)胞死亡汇恤，其原因可能是Cas9導(dǎo)致的基因毒性，而非特定的基因缺失導(dǎo)致的死亡拔恰。
而圖e結(jié)果表示因谎，這種對(duì)于CRISPR-Cas9毒性的敏感性主要表現(xiàn)在干細(xì)胞中，而常見(jiàn)的工具細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞并沒(méi)有這種現(xiàn)象颜懊。
3.3 P53參與 CRISPR-Cas9誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞（hPSC）死亡過(guò)程
以上結(jié)果雖證實(shí)了CRISPR-Cas9編輯過(guò)程造成hPSC死亡的因果關(guān)系财岔，但沒(méi)辦法把P53牽扯進(jìn)來(lái)。思路很簡(jiǎn)單饭冬，就把前面做的MAPT gene editing的細(xì)胞送RNA-seq，看一下差異基因（左圖a）揪阶。差異基因自然有許多昌抠，但P21作為P53的下游赫然在列，而且變化倍數(shù)非常大鲁僚。當(dāng)然為了排除MAPT基因的影響炊苫，還對(duì)其他基因編輯細(xì)胞進(jìn)行了P21表達(dá)鑒定(右圖d-g)，進(jìn)一步證實(shí)P21的變化冰沙，而P53作為P21的直接上游侨艾，應(yīng)也是參與了這個(gè)過(guò)程。
3.4 P53突變可逆轉(zhuǎn)CRISPR-Cas9 induce DSB導(dǎo)致的hPSC死亡
上述所有結(jié)果都只是證明了P53與CRISPR-Cas9誘導(dǎo)的hPSC死亡相關(guān)拓挥，但還是不能證明P53是hPSC在CRISPR-Cas9基因編輯過(guò)程中死亡的原因唠梨。因此作者構(gòu)建了一個(gè)P53 mutant pool，這個(gè)pool中有一半以下是P53WT的細(xì)胞侥啤，一半以上是P53 mutant的細(xì)胞当叭。可以看到左圖（c）中顯示：（1）在control pool中激活CRISPR-Cas9基因編輯，細(xì)胞的融合度不斷下降盖灸，證明有細(xì)胞死亡蚁鳖；（2）而在P53 mutant pool中，CRISPR-Cas9的激活赁炎，雖相對(duì)未激活組（P53 mutant pool -Dox）醉箕，其融合度有所下降，但融合度相對(duì) control+Dox組有所上調(diào)。我們分析可知讥裤，融合度下降的原因在于P53WT細(xì)胞的死亡放棒，而融合度上升則在于P53 mutant細(xì)胞的死亡抵抗。右圖（e）中通過(guò)外加P53DD抑制野生型P53功能坞琴，細(xì)胞團(tuán)塊得到生長(zhǎng)哨查。
<u>以上結(jié)果均表明，在P53功能失活之后剧辐，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的死亡被抑制寒亥，因此證明了P53是CRISPR-Cas9介導(dǎo)hPSC死亡的原因。</u>
4. 小結(jié)
作者切入點(diǎn)看起來(lái)很簡(jiǎn)單荧关，但卻也很巧妙溉奕。CRISPR-Cas9作為誘導(dǎo)DSB的因素，常理來(lái)說(shuō)一定會(huì)誘導(dǎo)P53的激活忍啤，而P53激活則會(huì)介導(dǎo)下游相關(guān)功能的體現(xiàn)（細(xì)胞周期阻滯加勤、細(xì)胞衰老甚至死亡），這是一個(gè)很清晰明了的思路同波，但我們很多人都沒(méi)有想過(guò)鳄梅。且據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，人多功能干細(xì)胞常規(guī)的P53-P21表達(dá)水平非常低未檩，WB和免疫熒光幾乎無(wú)法檢測(cè)到戴尸。但該類細(xì)胞對(duì)外界刺激非常敏感，如人胚胎干細(xì)胞只需要給予1-2 Gy的X光即可造成死亡冤狡。而成纖維細(xì)胞孙蒙、間充質(zhì)干細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞，給予10-30 Gy X光還無(wú)動(dòng)于衷悲雳。由此可見(jiàn)挎峦，人多功能干細(xì)胞對(duì)DSB激活P53更為敏感，更易死亡合瓢。正是因?yàn)檫@種敏感的機(jī)制坦胶，才能使得人多功能干細(xì)胞的基因組一直比別的細(xì)胞更為穩(wěn)定。雖然人多功能干細(xì)胞更為敏感晴楔，但不代表這種機(jī)制在其他常見(jiàn)細(xì)胞中不會(huì)發(fā)生迁央。
由于P53 WT細(xì)胞可應(yīng)對(duì)CRISPR-Cas9誘導(dǎo)的DSB，更易死亡滥崩，而P53 mutant細(xì)胞可以抵抗.岖圈。因此CRISPR-Cas9則成為了一個(gè)P53 mutant細(xì)胞的篩選因子，長(zhǎng)此以往钙皮，細(xì)胞群落中P53 mutant的比例越來(lái)越高蜂科，其風(fēng)險(xiǎn)不言而喻顽决。
這篇文章我在19年初就已讀過(guò)，以為文章解讀會(huì)寫得比較容易导匣，但當(dāng)提筆寫的時(shí)候發(fā)現(xiàn)有很多細(xì)節(jié)當(dāng)時(shí)根本沒(méi)有注意才菠。比如這篇文章純熟的運(yùn)用了CRISPR技術(shù)的多種手段，從普通敲除到inducible knockout贡定，而且它的inducible還有多種方式（Cas9的誘導(dǎo)表達(dá)赋访，Cas9的誘導(dǎo)穩(wěn)定以及Cas9的誘導(dǎo)失活）；從單個(gè)基因的驗(yàn)證到全基因組的文庫(kù)篩選缓待。因此我覺(jué)得這篇文章不僅僅是闡明CRISPR技術(shù)的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)一篇重要文章蚓耽，同時(shí)也是我們?nèi)鎸W(xué)習(xí)CIRSPR技術(shù)的良好案例。文章非常棒旋炒， 值得回到原文好好細(xì)讀步悠。
本來(lái)這次推文還想解讀兩篇文獻(xiàn)，考慮到篇幅只能將另一篇文獻(xiàn)放在下一篇文章中了瘫镇。寫的時(shí)候還擔(dān)心寫簡(jiǎn)單了不夠深入鼎兽、寫復(fù)雜了太過(guò)枯燥，內(nèi)容是一展再展又一刪再刪铣除。希望經(jīng)過(guò)整修之后谚咬，內(nèi)容不那么枯燥，還能有所幫助尚粘，感謝閱讀并期回饋交流~
