hello称龙，大家好没卸，又是周一，新的開始沪停，今天我們要繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容煤辨，增進(jìn)自己的理解，參考文章在Epithelial Plasticity and Innate Immune Activation Promote Lung Tissue Remodeling following Respiratory Viral Infection牙甫，利用單細(xì)胞空間技術(shù)來解析肺上皮細(xì)胞的可塑性掷酗，我們來看看具體如何運(yùn)用的。

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Summary

在干細(xì)胞遺傳耗竭后的小鼠肺中已經(jīng)提出上皮可塑性窟哺，但其生理相關(guān)性未知泻轰。病毒感染和慢性肺病具有相似的病理特征，如肺泡干細(xì)胞丟失且轨、小氣道基底細(xì)胞 (BC) 增生和先天免疫激活浮声，這些都會(huì)導(dǎo)致上皮重塑和肺功能喪失虚婿。分析展示了一種新的遠(yuǎn)端氣道分泌細(xì)胞譜系，即葉內(nèi)漿液 (IS) 細(xì)胞泳挥，在流感病毒感染后被激活以承擔(dān) BC 的命運(yùn)然痊。新生 BC 通過 IL-22ra1 的高表達(dá)與預(yù)先存在的 BC 不同，并進(jìn)行 IL-22 依賴性擴(kuò)增以定植受傷的肺泡（這個(gè)地方就需要空間的分析技術(shù)）屉符。病毒引起的炎癥消退導(dǎo)致重新填充的肺泡中 BC>IS 重新分化剧浸，并增加了抗菌因子的局部表達(dá)，但未能取代正常的肺泡上皮矗钟。因此唆香，上皮可塑性可以防止急性呼吸道病毒感染導(dǎo)致的死亡，但會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)端肺重塑和肺功能喪失吨艇。

Introduction

干細(xì)胞可塑性有助于組織再生躬它，并包括一系列過程，如特化祖細(xì)胞的譜系轉(zhuǎn)換和去分化东涡。盡管從譜系追蹤和靶向細(xì)胞ablation研究中推斷出肺修復(fù)中的上皮細(xì)胞可塑性冯吓，但肺疾病的生理相關(guān)性尚不清楚。The epithelial linings of airways and alveoli are maintained by distinct regional facultative stem/progenitor cells whose progeny include both self-renewing and differentiating subsets疮跑。分化后代命運(yùn)的區(qū)域差異允許維持局部特化的上皮功能组贺，例如傳導(dǎo)氣道中的粘液纖毛清除和宿主防御以及遠(yuǎn)端respiratory units中的氣體交換。在穩(wěn)態(tài)組織維持期間祸挪，將祖細(xì)胞及其分化后代限制在不同的解剖區(qū)锣披，對(duì)于沿近遠(yuǎn)軸的這些compartments的功能整合和正常生理肺功能的保存是必要的。然而贿条，急性肺損傷和慢性肺病會(huì)破壞正常的祖細(xì)胞compartmentalization雹仿，導(dǎo)致異常的組織重塑和肺功能下降。在感染甲型 H1N1 流感病毒或 SARS-CoV2 等呼吸道病毒以及慢性肺病如特發(fā)性肺纖維化 (IPF) 后就是這種情況整以。在這種情況下胧辽，氣道中的 basal cell (BC) 增生導(dǎo)致這些細(xì)胞募集和定植到受傷的肺泡區(qū)域，并且遠(yuǎn)端肺組織的這種近端化可能導(dǎo)致肺泡擴(kuò)散能力喪失公黑，危及生命邑商。然而，導(dǎo)致遠(yuǎn)端肺組織近端化的上皮祖細(xì)胞的身份以及在組織重塑過程中調(diào)節(jié)其命運(yùn)的機(jī)制仍不清楚凡蚜。

Mirroring what occurs in injured or injected human lungs, acute lung injury in mice infected with a mouse-adapted Puerto Rico 8 (PR8) variant of H1N1 influenza virus is accompanied by BC expansion in airways that ultimately replaces the injured epithelium of the alveolar gas-exchange region人断。盡管基底細(xì)胞和棒狀細(xì)胞分別用作維持近端氣道假復(fù)層上皮和遠(yuǎn)端氣道立方上皮的干細(xì)胞，但譜系追蹤研究表明朝蜘，PR8 感染小鼠遠(yuǎn)端肺組織中出現(xiàn)的增生性 BC這些典型的干細(xì)胞群恶迈。相反，PR8 引發(fā)的 BC（在此稱為新生 BC）源自替代的小氣道祖細(xì)胞谱醇，這些祖細(xì)胞可以根據(jù) Sox2 或 p63 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)行譜系追蹤暇仲。類似地步做，在近端氣道中，黏膜下腺 (SMG) 表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白的肌上皮細(xì)胞或表達(dá) SSEA4 的基底細(xì)胞分泌細(xì)胞后代可以在損傷后補(bǔ)充基底干細(xì)胞。然而，SMG 的上皮祖細(xì)胞或可替代局部基底干細(xì)胞的上呼吸道表面上皮細(xì)胞與 PR8 感染后在小氣道中產(chǎn)生擴(kuò)大的 BC 細(xì)胞之間的分子和功能關(guān)系仍有待確定题造。

盡管對(duì)regulate the renewal and fate of BC within pseudostratified airways的機(jī)制知之甚少，但對(duì) PR8 感染小鼠肺泡上皮中出現(xiàn)的增生性 BC 的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚将鸵。局部缺氧和伴隨 PR8 感染改變的炎癥環(huán)境的作用的證據(jù)表明先天免疫激活作為 BC 命運(yùn)和上皮重塑的調(diào)節(jié)劑的潛在作用。上皮免疫串?dāng)_是肺中跌、腸道和皮膚等多個(gè)器官中祖細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑咨堤。在這里菇篡，分析表明 PR8 感染引起的新生 BC 的獨(dú)特起源和分子表型允許它們對(duì)激活的先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)反應(yīng)漩符。源自局部活化的γδT細(xì)胞的白細(xì)胞介素22促進(jìn)肺泡上皮內(nèi)BC的自我更新和增生，在PR8引起的炎癥反應(yīng)消退期間驱还，這些細(xì)胞最終在先前受傷的區(qū)域呈現(xiàn)serous cell fates嗜暴。這種對(duì)呼吸道病毒感染的重塑反應(yīng)允許有效更換受損肺泡上皮中暴露的基底膜，并在局部產(chǎn)生抗菌分泌物以防止繼發(fā)性細(xì)菌感染议蟆。

Results

Activation and expansion of intralobular serous (IS) cells precedes BC hyperplasia following influenza-induced acute lung injury

BC 增生發(fā)生在慢性肺病患者的氣道和死于急性呼吸道病毒感染（如 H1N1 流感病毒或 COVID-19）的患者的肺組織中闷沥。根據(jù)譜系追蹤研究，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷而獲得 BC 命運(yùn)的小鼠肺中的大多數(shù)細(xì)胞來自未成熟的 P63⁺Krt5^-基礎(chǔ)祖細(xì)胞咐容。然而舆逃，在受傷期間看到的大部分新生 BC 未能保留 P63 譜系標(biāo)簽，表明存在其他有貢獻(xiàn)的非基礎(chǔ)祖細(xì)胞戳粒。分析試圖通過評(píng)估上皮細(xì)胞群響應(yīng)流感引起的急性肺損傷的動(dòng)態(tài)變化來query非經(jīng)典祖細(xì)胞的存在路狮。為從對(duì)照 C57Bl/6 小鼠（第 0 天）的氣管、肺外支氣管蔚约、肺葉內(nèi)氣道和肺泡區(qū)域分離的上皮細(xì)胞以及感染 H1N1 流感病毒 PR8 株并從中恢復(fù)的小鼠生成了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的綜合概況（第 3-240 天）奄妨。顯示為統(tǒng)一流形近似和投影 (UMAP) 二維圖的結(jié)果顯示了八個(gè)主要細(xì)胞cluster，這些細(xì)胞cluster根據(jù)已知的肺上皮細(xì)胞類型根據(jù)其獨(dú)特的基因表達(dá)特征進(jìn)行分類苹祟。盡管在從所有對(duì)照和暴露后時(shí)間點(diǎn)采樣的上皮細(xì)胞中都觀察到了每種主要細(xì)胞類型砸抛，但它們?cè)诳偛蓸由掀ぜ?xì)胞中的相對(duì)比例顯示出顯著的變化。

BC 在從對(duì)照小鼠或 PR8 感染后 3-9 天的小鼠的lobes中取樣的上皮細(xì)胞中很少見树枫，但此后表現(xiàn)出逐漸增加直焙。Serous cells是幼稚小鼠肺葉中唯一的其他罕見上皮細(xì)胞類型，其豐度在 PR8 感染后增加砂轻。然而奔誓，在整個(gè)時(shí)間過程中采樣的上皮細(xì)胞中，representation of serous cells的增加先于 BC representation的增加舔清。此外丝里，與在幼稚小鼠氣道中觀察到的Serous cells相比曲初，在暴露于 PR8 的肺中觀察到的Serous cells包括在所有暴露后恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)具有 BC 標(biāo)記基因 Trp63、Krt14 和 Krt5 異位表達(dá)的一個(gè)subsets杯聚。有趣的是臼婆，在 PR8 感染后的恢復(fù)過程中觀察到的Serous cells群在遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞類型中是獨(dú)一無二的，它們表達(dá)了參與抗微生物宿主防御的基因幌绍，例如 Ifitm1颁褂、Ifitm3、Bpifa1 和 Ltf傀广。在從 PR8 暴露恢復(fù)期間颁独，這種Serous cells群的擴(kuò)展以及獲得與新生氣道 BC 具有相似性的轉(zhuǎn)錄組，使我們推測稀有氣道Serous cells代表了在氣道和肺泡上皮中觀察到的新生 BC 的祖細(xì)胞來源受感染的老鼠伪冰。

因?yàn)閟erous cells 在 PR8 感染反應(yīng)的早期階段在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出增加的epresentation誓酒，我們推測epresentation代表了新生 BC 的祖細(xì)胞類型。為了進(jìn)一步探索在氣道對(duì) PR8 感染的反應(yīng)早期出現(xiàn)的serous cells的分子表型贮聂，我們利用我們的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集來識(shí)別候選差異表達(dá)基因 (DEG)靠柑，這些基因在傳導(dǎo)氣道中將漿液細(xì)胞與其他上皮細(xì)胞類型區(qū)分開來。盡管club and serous cells之間的基因表達(dá)特征有許多相似之處吓懈，但這些上皮細(xì)胞群的無監(jiān)督聚類不受細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響歼冰。我們發(fā)現(xiàn)serous cells表達(dá)高水平的 Scgb3a2，club細(xì)胞也是如此耻警，但與俱club細(xì)胞不同的是隔嫡，它們?nèi)狈?Scgb1a1 的表達(dá)。Furthermore, antimicrobial factors, such as Bpifa1 and Ltf, whose expression defines serous cells of proximal airways and submucosal glands, were significantly elevated in serous cells compared to club cells of the PR8 injured lung甘穿。免疫熒光標(biāo)記顯示腮恩，一小部分小葉內(nèi) Scgb3a2 陽性細(xì)胞對(duì) Msln 和 Bpifa1 也呈陽性，表明下呼吸道內(nèi)存在serous cells 群扒磁，在此稱為 intralobular serous (IS) 細(xì)胞庆揪。

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• 注：Feature plot comparing expression of selected club and serous cell-specific genes between cell types。

Transcriptome analysis predicts IS>basal plasticity during recovery from PR8 infection.

為了進(jìn)一步檢查 IS 細(xì)胞作為原始 BC 擴(kuò)增祖細(xì)胞的潛力妨托，我們使用基因集富集來鑒定 PR8 感染后不同時(shí)間這些上皮細(xì)胞cluster中的 DEG（富集分析說的這么清新脫俗）缸榛。 在感染后 5 天和 7 天觀察到與細(xì)胞周期相關(guān)的基因組的顯著誘導(dǎo)，同時(shí)在體內(nèi)觀察到增殖的conducting airway epithelium的出現(xiàn)兰伤。 然而内颗，在這些時(shí)間點(diǎn)僅在serous和 BC 中觀察到細(xì)胞周期基因集的富集，而在conducting airway的其他主要細(xì)胞類型中這些基因集幾乎沒有富集敦腔。

使用我們的 scRNAseq 數(shù)據(jù)集來詢問 BC均澳、IS 細(xì)胞和其他氣道分泌細(xì)胞群之間的譜系關(guān)系。 通過 Velocyto 評(píng)估轉(zhuǎn)錄本剪接，以預(yù)測在對(duì) PR8 感染的早期（初始第 11 天）和晚期（第 14 天第 240 天）反應(yīng)期間 IS 細(xì)胞找前、club細(xì)胞和新生 BC 之間的分化軌跡糟袁。 細(xì)胞命運(yùn)動(dòng)力學(xué)的計(jì)算分析預(yù)測了一個(gè)過程，即 IS 細(xì)胞在 PR8 感染后的早期時(shí)間點(diǎn)去分化為 BC躺盛。 相比之下项戴，軌跡分析預(yù)測 BC 在后期恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)變回 IS 細(xì)胞。

接下來使用 Visium 空間 RNA-Seq 來定義 PR8 感染 14 天后肺組織內(nèi)新生 BC 和 IS 細(xì)胞之間的關(guān)系槽惫。 無監(jiān)督聚類揭示了 7 個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的基因特征周叮，這些基因特征被投影到采樣組織切片的空間圖上。 將 scRNAseq 生成的細(xì)胞類型特征評(píng)分應(yīng)用于空間 RNAseq 數(shù)據(jù)以共定位細(xì)胞類型界斜。 正如通過 RNA 速度分析預(yù)測的這些細(xì)胞類型之間的譜系關(guān)系所表明的那樣仿耽，由此產(chǎn)生的細(xì)胞類型空間圖證明了新生 BC 和 IS 細(xì)胞之間的密切空間關(guān)聯(lián)，但不是新生 BC 和club細(xì)胞各薇。 分析證實(shí)了從空間轉(zhuǎn)錄組分析預(yù)測的新生 BC 和 IS 細(xì)胞的緊密空間定位通過 Scgb3a2 的免疫熒光定位到 PR8 感染小鼠肺泡上皮重塑區(qū)域內(nèi)的 Krt5 免疫反應(yīng)性區(qū)域项贺。

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Scgb3a2^posScgb1a1^neg IS cells demonstrate serous-basal-serous plasticity during repair following PR8

作者開發(fā)了一種譜系追蹤方法來獨(dú)立定義 PR8 感染后 IS 細(xì)胞和club細(xì)胞對(duì) BC 擴(kuò)增的貢獻(xiàn)。單細(xì)胞和空間 RNAseq 數(shù)據(jù)表明 IS 細(xì)胞和club細(xì)胞都表達(dá) Scgb3a2得糜，但只有club細(xì)胞表達(dá) Scgb1a1敬扛。基于這些數(shù)據(jù)朝抖，生成了雙重重組酶 (DR) 小鼠，它們含有 Dre/Cre 報(bào)告基因等位基因以及 Scgb1a1-CreER 和 Scgb3a2-DreER 重組酶驅(qū)動(dòng)等位基因谍珊。這些小鼠的Tamoxifen (TM) exposure導(dǎo)致 Dre 介導(dǎo)的表達(dá) Scgb3a2 的 IS 和club細(xì)胞內(nèi)的聚 A 信號(hào) (STOP) 切除治宣，隨后 Cre 介導(dǎo)的 Scgb1a1 表達(dá)club細(xì)胞內(nèi)的 tdT-STOP 切除。這些重組事件的結(jié)果是通過 tdT (Lin^3a2) 的表達(dá)追蹤 Scgb3a2⁺/Scgb1a1^-IS 細(xì)胞砌滞，通過 eGFP 的表達(dá)追蹤 Scgb3a2⁺/Scgb1a1⁺ club細(xì)胞（Lin^3a2/1a1）侮邀。amoxifen exposure后是 9 天的清除期，然后對(duì)naive小鼠肺中的譜系追蹤進(jìn)行分析贝润。 Scgb3a2免疫反應(yīng)細(xì)胞在幼稚小鼠氣道中的譜系標(biāo)記被確定為75.2±3.06％绊茧，其中Lin^3a2 IS細(xì)胞（總譜系標(biāo)記細(xì)胞的16.8％）散布在Lin^{3a2 / 1a1}俱樂部細(xì)胞（總譜系的83.2％）中 -標(biāo)記的細(xì)胞）。僅在 tdT 譜系追蹤細(xì)胞中檢測到serous cell 標(biāo)志物 Bpifa1 的表達(dá)打掘，這些細(xì)胞對(duì)naive小鼠氣道中纖毛和 BC 類型的標(biāo)志物呈陰性华畏。

接下來試圖評(píng)估 Lin^3a2 細(xì)胞對(duì) PR8 感染后上皮重塑和 BC 擴(kuò)張的貢獻(xiàn)。 用 TM 處理的 3a2/1a1 DR 小鼠感染 PR8 流感病毒并在第 7尊蚁、14 或 21 天進(jìn)行檢查亡笑。 在 PR8 感染后 7 天，在氣道中發(fā)現(xiàn)了不斷擴(kuò)大的 Krt5⁺ BC populations横朋。 譜系報(bào)告基因和 BC 標(biāo)記 Krt5 的雙重免疫熒光顯示basal-like cells仑乌，包括Lin^3a2-positive/high, -positive/low and - negative subset。 盡管檢測到 Lin^3a2/1a1 陽性上皮細(xì)胞，但在 eGFP 和 Krt5 之間未觀察到免疫熒光共定位晰甚。 這些觀察結(jié)果與其他人和我們的報(bào)告一致衙传，即club細(xì)胞對(duì)肺損傷或感染引起的 BC pool的擴(kuò)大沒有顯著貢獻(xiàn) 。

在 PR8 感染后 14 天厕九，Lin^3a2-high 和-low 上皮細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增明顯粪牲，此時(shí)還在損傷肺泡上皮內(nèi)的基底增生區(qū)域中觀察到 Lin^3a2-low/Krt5 雙陽性上皮細(xì)胞。新生的 Krt5 免疫反應(yīng)性basal-like cells在恢復(fù)第 14 天及以后顯示出 Lin^3a2 -low表型止剖，而 Lin^3a2-high上皮細(xì)胞主要是 Krt5 陰性免疫表型腺阳，并占據(jù)修復(fù)氣道上皮內(nèi)的suprabasal/luminal location。Expanding Lin^3a2-high 細(xì)胞顯示出 IS 細(xì)胞的特征穿香，并且隨著 PR8 感染后恢復(fù)的時(shí)間顯示增加的豐度亭引，這驗(yàn)證了 scRNAseq 的觀察結(jié)果。有趣的是皮获，在感染后第 14 天被basal-like Krt5 陽性/Lin^3a2 低細(xì)胞重新填充的受損肺泡區(qū)域在恢復(fù)第 21 天顯示出更大的異質(zhì)性焙蚓。到恢復(fù)第 21 天，占據(jù)肺泡區(qū)域的 Lin^3a2 陽性細(xì)胞包括 Krt5-陽性/Lin^3a2-low 和 Krt5-negative/Lin^3a2-high 斑塊洒宝，一些斑塊似乎顯示出暗示細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡表型购公。這些數(shù)據(jù)與 scRNAseq 數(shù)據(jù)的軌跡分析一致，表明 PR8 感染后擴(kuò)增的新生basal-like 細(xì)胞最終轉(zhuǎn)變回 IS 細(xì)胞雁歌。 Scgb3a2 的免疫熒光染色證實(shí)了肺泡 Krt5 陰性/Lin3a2 高細(xì)胞的 IS 細(xì)胞表型宏浩。我們來自雙譜系追蹤的數(shù)據(jù)證實(shí)了基于 scRNAseq 數(shù)據(jù)的細(xì)胞軌跡預(yù)測，并表明修復(fù)上皮是高度動(dòng)態(tài)的靠瞎。 PR8 損傷肺的環(huán)境變化有助于從氣道 IS 祖細(xì)胞中鑒定新生 BC比庄，然后它們?cè)跉獾篮褪軗p肺泡區(qū)域分化回 IS 細(xì)胞.

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Regulatory gene networks involved in immune-epithelial crosstalk are activated in nascent basal but not in IS cells.

接下來，defined調(diào)節(jié)在 PR8 感染小鼠肺部擴(kuò)張的新生 BC 命運(yùn)的機(jī)制乏盐。為了進(jìn)一步了解調(diào)節(jié) IS 或 BC 行為的途徑佳窑，使用 Bigscale2(這個(gè)軟件也是一個(gè)處理單細(xì)胞分析的軟件，同時(shí)可以進(jìn)行軌跡分析) 評(píng)估了 PR8 感染和恢復(fù)過程中調(diào)節(jié)基因的變化父能。 PR8 感染后 11-17 天的 ScRNAseq 數(shù)據(jù)按細(xì)胞類型排序神凑，以產(chǎn)生四個(gè)調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò) (GRN)。然后將感染后時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞類型特異性 GRN 與其各自的初始細(xì)胞對(duì)照進(jìn)行比較何吝，以標(biāo)準(zhǔn)化節(jié)點(diǎn)和邊緣值溉委。生成了前 300 個(gè) delta 度節(jié)點(diǎn)中心的基因列表，并用于通過基于 Panther 的過度表示測試來識(shí)別豐富的基因本體 (GO) terms岔霸。下圖 C 中顯示的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)證明了 BC 之間發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化薛躬，但對(duì)于初始和感染后時(shí)間點(diǎn)之間的 IS 細(xì)胞則較少〈粝福基礎(chǔ)群體中高度豐富的 GO terms包括涉及細(xì)胞增殖的途徑型宝，例如典型 Wnt 信號(hào)的激活八匠，與觀察到的 BC 增殖和伴隨 PR8 感染恢復(fù)的相關(guān)增生一致。與細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)和上皮細(xì)胞先天免疫刺激相關(guān)的通路在 BC 中也顯著上調(diào)趴酣，在從 PR8 感染的肺中分離的 IS 細(xì)胞中的調(diào)節(jié)程度較小梨树。

先天免疫激活通常是對(duì)呼吸道病毒感染的well-documented response的反應(yīng)，并且是導(dǎo)致氣道重塑和出生后對(duì)過敏性炎癥的易感性增加的上皮細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑岖寞。值得注意的是抡四，小鼠感染流感病毒后局部產(chǎn)生 TNFα 和 IL-1β 可促進(jìn)肺泡上皮的再生能力，而 IL-22 可提高 PR8 感染后的存活率并減少肺纖維化仗谆。為了進(jìn)一步探索細(xì)胞因子介導(dǎo)的上皮細(xì)胞命運(yùn)變化的潛在作用指巡，進(jìn)行了多重蛋白質(zhì)測定以量化流感病毒感染的 C57/Bl6 小鼠肺中的細(xì)胞因子反應(yīng)。我們觀察到干擾素 (Ifnγ) 和促炎細(xì)胞因子 IL-6隶垮、TNFα 和 IL-1β 顯著增加藻雪，這與已知的呼吸道病毒感染反應(yīng)一致。在 PR8 感染后第 5-11 天恢復(fù)期間狸吞，在小鼠的肺組織勻漿和/或支氣管肺泡灌洗液 (BAL) 中觀察到 17 型相關(guān)細(xì)胞因子（包括 IL-17α勉耀、IL-10 和 IL-22）的顯著誘導(dǎo)。 IL-22 的保護(hù)作用以及細(xì)胞因子產(chǎn)生增加與氣道和肺泡中 BC 擴(kuò)張的巧合使我們推測 IL-22 信號(hào)傳導(dǎo)在 PR8 感染后 BC 擴(kuò)張中起作用蹋偏。

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Renewal and differentiation of nascent BC is regulated by γσT-cell derived IL-22.

為了進(jìn)一步探索先天免疫激活和 IL-22 在調(diào)節(jié) PR8 exposed 小鼠氣道和肺泡上皮細(xì)胞中的作用便斥，使用 scRNAseq 來定義因感染引起的免疫細(xì)胞群的變化。從 PR8 感染后不同時(shí)間收集的 CD45⁺ 肺細(xì)胞ScRNAseq 數(shù)據(jù)威始。整合數(shù)據(jù)的 UMAP 降維發(fā)現(xiàn)三個(gè)主要免疫亞群（T枢纠、B 淋巴和骨髓）的可視化。由 SingleR 識(shí)別和注釋相似細(xì)胞的cluster字逗。試圖定義與恢復(fù)期間觀察到的新生 BC 相關(guān)的這些主要免疫亞群的空間context京郑。來自免疫富集 scRNAseq 數(shù)據(jù)集的基因特征用于推斷空間 RNAseq 數(shù)據(jù)中的細(xì)胞定位『簦空間基因表達(dá)分析表明，在肺組織恢復(fù)中跟狱，T 淋巴亞群與富含 BC 的區(qū)域優(yōu)先共定位俭厚，其中 17 型 γσT 細(xì)胞在 BC 增生期間顯示出豐度增加。這使我們考慮 T 淋巴細(xì)胞對(duì) BC 命運(yùn)的可能的調(diào)節(jié)影響驶臊。

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由于幾個(gè)免疫亞群可以分泌 IL-22挪挤，分析生成了攜帶 IL-22^Cre/ROSA-26-tdT 的小鼠，以在對(duì) PR8 感染的修復(fù)反應(yīng)期間繪制 IL-22 譜系免疫細(xì)胞的命運(yùn)圖关翎。 為了鑒定表達(dá) IL-22 的細(xì)胞類型扛门，我們對(duì) IL-22 譜系標(biāo)簽 (tdT) CD45+ 細(xì)胞進(jìn)行g(shù)ated以表達(dá)淋巴標(biāo)志物 CD3 和 CD4。 我們發(fā)現(xiàn) CD3+CD4-γδT 細(xì)胞亞群代表了響應(yīng) PR8 感染而引發(fā)的大部分 IL-22 系免疫細(xì)胞纵寝，CD3+CD4+ Th17 細(xì)胞的貢獻(xiàn)很小论寨。 有趣的是，非 T 淋巴樣 CD3 亞群對(duì) PR8 感染后表達(dá) IL-22 的譜系沒有貢獻(xiàn)。 免疫熒光分析表明 IL-22 免疫反應(yīng)性免疫細(xì)胞定位于新生的 BC 并在響應(yīng)急性肺損傷時(shí)被誘導(dǎo)葬凳。

為了鑒定能夠響應(yīng) IL-22 信號(hào)傳導(dǎo)的上皮細(xì)胞類型绰垂，使用免疫熒光來鑒定哪些上皮亞群表達(dá) IL-22ra1，這是賦予 IL-22 配體特異性的異二聚體 IL-22 受體的亞基火焰。 值得注意的是劲装，在幼稚小鼠的傳導(dǎo)氣道內(nèi)，在有絲分裂后纖毛上皮細(xì)胞中觀察到最高水平的 IL-22ra1 免疫反應(yīng)性昌简，在club, basal or serous cell中幾乎沒有觀察到免疫反應(yīng)性占业。 然而，在 PR8 感染后的恢復(fù)過程中纯赎，在增生性肺泡 BC 中觀察到顯著水平的 IL-22ra1 表達(dá)谦疾。 有趣的是，IL-22ra1 染色的強(qiáng)度在the outer periphery of pod region的外圍內(nèi)最大址否，表明在損傷期間對(duì) IL-22 的基礎(chǔ)反應(yīng)性發(fā)生了變化餐蔬。 總之，我們的數(shù)據(jù)表明佑附，在調(diào)節(jié) BC 命運(yùn)的 PR8 損傷肺的新生基礎(chǔ)群體中樊诺，IL-22 反應(yīng)性改變的過程。

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IL-22 promotes self-renewal of nascent BC, allowing hyperplastic expansion in airways and injured alveoli.

為了研究 IL-22 在 PR8 感染后對(duì) BC 命運(yùn)調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)音同，我們使用 IL-22^Cre homozygou (IL-22-LOF) 和 IL-22ra1^fl/fl/Shh-Cre (IL-22ra1-cLOF) 小鼠分別調(diào)節(jié) IL-22 水平和信號(hào)词爬。與其相應(yīng)的 WT 對(duì)照組相比，IL-22-LOF 和 IL-22ra1-cLOF 小鼠在 PR8 感染后體重減輕权均、病毒基因表達(dá)或?qū)嵸|(zhì) Pdpn 免疫熒光喪失均未顯示顯著變化顿膨。Next, we assessed expansion of Krt5-immunoreactive BC as a function of damaged area in IL-22-LOF mice following PR8 infection。在檢查的所有時(shí)間點(diǎn)叽赊，與 WT 對(duì)照小鼠相比恋沃，在 IL-22-LOF 小鼠中觀察到 Krt5+ BC 增生減少，這在第 17 天恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性必指。這些數(shù)據(jù)通過評(píng)估在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分離的總肺 RNA 中的 Krt5 mRNA 含量得到證實(shí)囊咏，為此在 14 天和 17 天恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)觀察到 Krt5 mRNA 的統(tǒng)計(jì)顯著下降。在 PR8 感染后的 IL-22ra1-cLOF 小鼠中也觀察到了類似的 BC 擴(kuò)增減少的觀察結(jié)果塔橡。

類似地梅割，在其他組織和癌中，IL-22 調(diào)節(jié)上皮干祖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖潛力葛家。為了評(píng)估在 IL-22-LOF 小鼠中觀察到的 BC 增生減少是否與上皮增殖減少有關(guān)户辞，我們?cè)?PR8 感染后恢復(fù)期間通過 Ki67 和 Krt5 的免疫熒光測量了 BC 增殖指數(shù)。在 PR8 感染后 7 天觀察到的 BC 的 Ki67 標(biāo)記指數(shù)在 IL-22-LOF癞谒、IL-22ra1-cLOF 及其相應(yīng)的 WT 對(duì)照之間沒有差異底燎。這些數(shù)據(jù)表明刃榨，PR8 感染后早期時(shí)間點(diǎn)的 BC 擴(kuò)增以 IL-22 非依賴性方式發(fā)生，并且與觀察到的幼稚對(duì)照小鼠或小鼠在感染后早期時(shí)間點(diǎn)的氣道 BC 中缺乏 IL-22ra1 免疫反應(yīng)性一致书蚪。 PR8 感染喇澡。然而，在 PR8 感染后 14 天殊校，在 IL-22-LOF 和 IL-22ra1-cLOF 小鼠的氣道和肺泡區(qū)域內(nèi)觀察到的新生 BC 顯示晴玖，與其相應(yīng)的 WT 對(duì)照相比，Ki67 染色水平顯著降低为流。這些數(shù)據(jù)表明呕屎，在后期恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)，IL-22 促進(jìn) BC 擴(kuò)張和自我更新敬察，從而維持增殖潛力秀睛。所有基因型都顯示出降低的 BC Ki67 增殖指數(shù)，在 PR8 感染后 21 天莲祸，兩組之間沒有顯著差異蹂安。為了確定在從 PR8 感染恢復(fù)期間缺乏 IL-22 刺激是否影響肺泡 BC 的命運(yùn)，我們共染色了在 PR8 感染的 WT 和 IL-22 LOF 小鼠的實(shí)質(zhì)組織中觀察到的 BC 和 IS 標(biāo)記物的pods锐帜。有趣的是田盈，在 PR8 感染后 14 天，在 IL-22-LOF 或 IL-22ra1-cLOF 小鼠的肺中觀察到的 Krt5 免疫反應(yīng)豆莢顯示 Scgb3a2 表達(dá)的證據(jù)缴阎，而野生型對(duì)照小鼠的可比 Krt5 免疫反應(yīng)pods中不存在這種表達(dá)允瞧。顯示 Krt5 和 Scgb3a2 免疫熒光共定位的上皮細(xì)胞組成的pod structures 的出現(xiàn)與顯示 BC>IS 分化的早期數(shù)據(jù)一致，并支持殘余 Krt5 免疫反應(yīng)性反映分化 IS 細(xì)胞的 BC 起源的觀點(diǎn)蛮拔。為了進(jìn)一步檢查 IL-22 缺失對(duì) BC 成熟的影響述暂，在 PR8 感染 IL-22ra1-cLOF 小鼠或其相應(yīng)的 WT 對(duì)照后 21 天，為從肺中分離的上皮細(xì)胞生成了 scRNAseq 譜建炫。 UMAP 聚類證實(shí)了與 WT 對(duì)照小鼠相比畦韭，IL-22r1a-cLOF 小鼠肺中 BC 數(shù)量減少。與 WT 對(duì)照相比肛跌，在 IL-22r1a-cLOF 小鼠中觀察到表達(dá) BC 標(biāo)記基因 Trp63 和 Krt5 的上皮細(xì)胞豐度顯著降低廊驼。總的來說惋砂，我們的數(shù)據(jù)表明 IL-22 的作用是促進(jìn) BC 細(xì)胞的分化更新，并且在 PR8 感染后的后期時(shí)間點(diǎn)先天免疫反應(yīng)的下調(diào)與 IL-22 的相關(guān)減少绳锅，可作為促進(jìn) basal to serous cell分化的觸發(fā)因素.

Discussion

Basal cell (BC) 增生和受損肺泡氣體交換區(qū)的定植是嚴(yán)重呼吸道病毒感染患者組織重塑和發(fā)病率的重要決定因素西饵，并且與間質(zhì)性肺病患者的遠(yuǎn)端肺重塑具有共同的特征。在這里鳞芙，我們顯示由 H1N1 流感病毒（PR8 株）感染小鼠呼吸道引起的新生 BC 主要來自肺葉內(nèi)serous cell subset of intralobar secretory cells眷柔。新生 BC 與預(yù)先存在的 BC 的區(qū)別在于它們相對(duì)不成熟的分子表型和 IL-22ra1 的表達(dá)期虾。先天免疫激活和 IL-22 的相關(guān)分泌促進(jìn)了氣道中新生 BC 的自我更新以及在受損肺泡內(nèi)增生病灶的建立。上皮細(xì)胞內(nèi) IL-22 的種系缺失或 IL-22ra1 表達(dá)的條件缺失驯嘱，限制了擴(kuò)增并促進(jìn)了新生 BC 過早分化為 serous cells镶苞。這些發(fā)現(xiàn)建立了一種新的機(jī)制，可以促進(jìn) serous cells的擴(kuò)張及其在受損肺泡上皮的定植鞠评，導(dǎo)致上皮重塑和呼吸道病毒感染后正常肺泡上皮的喪失

提供證據(jù)證明在小鼠肺的葉內(nèi)氣道內(nèi)存在兩個(gè)獨(dú)立的分泌細(xì)胞譜系茂蚓，club細(xì)胞和intralobar serous (IS) 細(xì)胞。先前的譜系追蹤研究表明剃幌，表達(dá) Scgb1a1 的club細(xì)胞能夠無限地自我更新和替換小鼠細(xì)支氣管氣道的特化上皮細(xì)胞類型聋涨。然而，PR8 感染小鼠肺部上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致非典型上皮祖細(xì)胞激活负乡，導(dǎo)致 BC 增生牍白。在嚴(yán)重呼吸道病毒感染的情況下，只有分泌細(xì)胞的 IS subsets可以承擔(dān) BC 的命運(yùn)抖棘，這表明 IS 細(xì)胞作為儲(chǔ)備上皮祖細(xì)胞發(fā)揮作用茂腥，如果對(duì)遠(yuǎn)端氣道的穩(wěn)態(tài)上皮維持有任何貢獻(xiàn)，則不太可能發(fā)揮重要作用切省。流感病毒感染后 IS 細(xì)胞的擴(kuò)增及其向新生 BC 的表型轉(zhuǎn)化表明 IS 細(xì)胞在嚴(yán)重?fù)p傷后的上皮維持和修復(fù)中發(fā)揮著未被重視的作用最岗。

單細(xì)胞空間聯(lián)合的方法還是Seurat的方法，看來Seurat的方法還是最被大家認(rèn)可

生活很好数尿，有你更好