hello受葛，迎來自己在簡書創(chuàng)作的第300篇文章遵岩，這一篇文章我們做一個(gè)單細(xì)胞空間組學(xué)運(yùn)用的總結(jié)薛训，參考文獻(xiàn)在High-Dimensional Single-Cell Transcriptomics in Melanoma and Cancer Immunotherapy，2021年10月發(fā)表的一篇review念搬，算是一種簡單的總結(jié)尚揣，我們回顧一下涌矢，溫故而知新，總結(jié)也是一種進(jìn)步快骗。
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Abstract
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的最新進(jìn)展極大地提高了對(duì)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄程序的了解娜庇，迅速擴(kuò)展了我們對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞表型和功能的了解。近年來已經(jīng)開發(fā)了幾種新的單細(xì)胞技術(shù)方篮，使人們能夠更深入地了解免疫療法（例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）所針對(duì)的mechanistic cells和生物學(xué)途徑名秀，這些療法現(xiàn)在通常用于高危早期或晚期患者的管理黑色素瘤。這些技術(shù)具有特定于方法的優(yōu)勢(shì)藕溅、劣勢(shì)和能力匕得，在利用它們來回答轉(zhuǎn)化研究問題時(shí)需要加以考慮。在這里巾表，我們通過審查當(dāng)前可用的實(shí)驗(yàn)和分析工作流程汁掠，為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析平臺(tái)的實(shí)施提供指導(dǎo)。然后集币，我們強(qiáng)調(diào)使用這些技術(shù)在接受免疫療法治療的癌癥患者的背景下剖析腫瘤微環(huán)境考阱。討論了單細(xì)胞分析在臨床環(huán)境中的戰(zhàn)略用途，并探索了潛在的未來機(jī)會(huì)惠猿，重點(diǎn)是它們用于使新型免疫治療藥物療法的設(shè)計(jì)合理化羔砾，最終改善癌癥患者的治療效果。
Introduction
腫瘤由增殖的惡性細(xì)胞偶妖、免疫細(xì)胞、血管和腫瘤基質(zhì)的復(fù)雜混合物組成（下圖）政溃。促腫瘤和抗腫瘤信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤微環(huán)境中相互作用以調(diào)節(jié)腫瘤生長并影響治療反應(yīng)趾访。基于免疫檢查點(diǎn)的免疫療法 (ICI)董虱，例如針對(duì)免疫調(diào)節(jié)受體扼鞋、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4 (CTLA-4)、程序性細(xì)胞死亡蛋白 1 (PD-1) 或其配體愤诱、程序性死亡配體的抗體1 (PD-L1)云头，徹底改變了包括黑色素瘤在內(nèi)的多種癌癥類型的治療。與歷史數(shù)據(jù)相比淫半，基于現(xiàn)代抗 PD-1 免疫療法的 IV 期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的 5 年總生存率 (OS) 從不到 10% 提高到 50%溃槐。盡管有這些改善，約 30-40% 的患者沒有反應(yīng)科吭，還有約 20-30% 的患者最終復(fù)發(fā)昏滴，50% 的患者死于疾病猴鲫。盡管大量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為治療反應(yīng)的生物學(xué)過程提供了有價(jià)值的見解，但對(duì)數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的信號(hào)進(jìn)行平均會(huì)丟失關(guān)于可能對(duì)確定疾病生物學(xué)至關(guān)重要的罕見和獨(dú)特細(xì)胞亞型的信息谣殊。單細(xì)胞分析可以提供獨(dú)特的機(jī)會(huì)來更深入地了解驅(qū)動(dòng)免疫治療反應(yīng)和抵抗的腫瘤內(nèi)在和外在機(jī)制
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- 注：Single cell sequencing facilitates the dissection of the tumour microenvironment. The tumour microenvironment (TME), including malignant cells, immune cells and stromal cells, regulates a range of cellular and molecular signals. Such signals influence the cell states, tumour proliferation, host immunity and response to systemic therapies. Single cell technologies are providing unique opportunities for dissecting the orchestration of the TME and understanding the tumour-intrinsic and -extrinsic mechanisms of immunotherapy response and resistance.
目前使用免疫組織化學(xué)拂共、原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分析的方法已成為在實(shí)驗(yàn)室和臨床中檢測(cè)非惡性細(xì)胞和癌細(xì)胞之間差異的重要工具。 這些傳統(tǒng)方法檢查單個(gè)細(xì)胞并解剖腫瘤中不同的細(xì)胞亞型姻几，并補(bǔ)充基于批量的基因組分析宜狐。 然而，這種經(jīng)典方法通常只能檢測(cè)到有限數(shù)量的分析物蛇捌，這降低了表征 TME 中細(xì)胞亞型和分子狀態(tài)多樣性的能力.
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使在許多細(xì)胞內(nèi)以單細(xì)胞分辨率以越來越經(jīng)濟(jì)的方式無偏見地檢測(cè)成百上千種分析物成為可能肌厨。同樣，高度發(fā)達(dá)的生物信息學(xué)工具數(shù)量的持續(xù)增長使研究人員有機(jī)會(huì)利用單細(xì)胞技術(shù)來充分表征不同細(xì)胞類型和細(xì)胞間相互作用的多樣性豁陆。分析工作流程包括減少高維數(shù)據(jù)柑爸、鄰域聚類、系統(tǒng)發(fā)育推斷盒音、譜系追蹤表鳍、偽時(shí)間排序、RNA 速度祥诽、配體-受體相互作用和多數(shù)據(jù)集成譬圣。此外，基于測(cè)序的 mRNA 分子可以通過組織學(xué)染色來補(bǔ)充雄坪，以進(jìn)一步整合細(xì)胞位置和形態(tài)特征厘熟。最近對(duì)黑色素瘤和其他癌癥類型中腫瘤細(xì)胞和 TME 的單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)了新的細(xì)胞亞群、獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序以及更多關(guān)于“腫瘤內(nèi)”和“腫瘤間”異質(zhì)性的證據(jù)维哈，所有這些都影響了我們的研究绳姨。了解治療反應(yīng)和耐藥性。例如阔挠，已經(jīng)積累了先天免疫抑制細(xì)胞（如骨髓源性抑制子亞群）的晚期黑色素瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)很差飘庄。此外，功能失調(diào)的 T 細(xì)胞亞群的不同浸潤表現(xiàn)出不同水平的抗腫瘤反應(yīng)购撼。單細(xì)胞方法為回答癌癥研究中持續(xù)存在的許多臨床和生物學(xué)重要問題提供了巨大的潛力跪削，包括：TME 和腫瘤異質(zhì)性對(duì)逃避抗腫瘤反應(yīng)的貢獻(xiàn)；治療過程中T細(xì)胞克隆型與腫瘤細(xì)胞的時(shí)間關(guān)系迂求； TME中免疫檢查點(diǎn)分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)碾盐；以及腫瘤細(xì)胞亞型和免疫細(xì)胞之間的功能作用和空間關(guān)系。在此揩局，我們專注于單細(xì)胞技術(shù)如何有潛力促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用以及對(duì)抗癌免疫療法的反應(yīng)和抵抗的理解
在這篇綜述中毫玖，總結(jié)了癌癥研究中常用的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的前景，同時(shí)討論了它們?cè)诓东@效率、細(xì)胞限制孕豹、空間分辨率和分析支持方面的優(yōu)缺點(diǎn)涩盾。 接下來，描述了單細(xì)胞技術(shù)在新型生物標(biāo)志物和治療開發(fā)方面的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)和潛在應(yīng)用励背。 最后春霍，討論了在醫(yī)療保健和臨床研究中使用單細(xì)胞技術(shù)取得的進(jìn)展。
Single-Cell Transcriptomic Technologies
近年來叶眉，出現(xiàn)了一系列廣泛的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)址儒，并在黑色素瘤和癌癥免疫治療中獲得了一系列生物學(xué)和臨床應(yīng)用，證明了以無偏見的方式精確表征罕見細(xì)胞表型和特定細(xì)胞反應(yīng)的能力衅疙。最近的幾項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在識(shí)別新的潛在分子靶點(diǎn)方面的影響以及檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和 TME 的影響莲趣。這些研究充分表征了 TME、T 細(xì)胞和免疫抑制細(xì)胞狀態(tài)饱溢、轉(zhuǎn)錄程序和與疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)相關(guān)的檢查點(diǎn)的細(xì)胞組成和功能喧伞。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)按其各自的細(xì)胞分離方法大致分類（下表）； (i) 液滴封裝绩郎，(ii) 微孔封裝潘鲫，和 (iii) 熒光激活細(xì)胞分選 (FACS)。在本節(jié)中肋杖，概述了以下單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)溉仑，包括 10x Chromium、Fluidigm C1 和 SMART-seq2状植，這些平臺(tái)已廣泛應(yīng)用于癌癥研究領(lǐng)域浊竟，從而提供一個(gè)總結(jié)指南，可以幫助廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究人員為他們的單細(xì)胞研究做出明智的決定津畸。
Table 1. Specifications of common single-cell sequencing technologies.
| Platform | Company/Academic | Method of Single-Cell Capture | Capture Efficiency | Doublet Rate | Number of Captured Cells | Cell Size Restrictions | Analytical Tool | Advantages | Relative Limitations |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Chromium | 10x Genomics | Droplet encapsulation | 65% | 0.90% | 100–80,000 | Independent of cell size, but generally up to 50 μm | 10x analysis suite including Cell Ranger and Loupe Browser; Seurat R package | Easy to operate; cost effective; intensive support for end-to-end solution; flexible options for multiple applications | High concentration of viable cells required; Little control over cell input |
| DropSeq (Nadia) | Dolomite-bio | Droplet encapsulation | 10% | 1.80–11.3% | 103–104 | None for mammalian cells | Open platform | High throughput; low cost | High concentration of viable cells required; low cell capture efficiency; skills required to operate; minimal support for data processing and analysis. |
| C1 | Fluidigm | Microwell encapsulation | 39% | 3–30% | 96 or 800 | 5–10, 10–17, or 17–25 μm | Fluidigm Singular Analysis Toolset Software | Full-length transcript; customisable workflow (able to exclude empty wells and doublets) | Limited cell capture; low throughput (up to 96 or 800 cells); high cost of cartridges; relatively long preparation time (two runs per day); fresh tissue or cells required |
| ddSeq | Illumina/Bio-Rad | Microwell encapsulation | 3–4% | 5.80% | 103–104 | None for mammalian cells | Illumina BaseSpace or ddSeeker R package | Easy to operate; flexibility of kits for different number of cells; intensive support for end-to-end solution | High concentration of viable cells required; no users modification; single application (RNA-seq) |
| ICell8 | Takara-Bio | Microwell encapsulation | 37% | 1.3–4% | 1800 | 5–100 μm | CELLSTUDIO software | Easy to operate; full-length transcript; customisable workflow (able to exclude empty wells and doublets) | Specialised bioinformatic tools required; single application (RNA-seq) |
| Rhapsody | BD Biosciences | Microwell encapsulation | 65% | 2–10% | 100–40,000 | 5 to 30 μm | BD Rhapsody | Easy to operate; intensive support for end-to-end solution; simultaneously measure protein and mRNA expression; optimise costs based on subsampling and targeted panels | Low sequencing throughput; custom panel of up to 500 targets |
| Smart-Seq2 | Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2,Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types | FACS | 80% | 1% | No limitation | None for mammalian cells | Open platform | No limitations of cell size, shape or homogeneity; simultaneously measure DNA and RNA; high practicality (uses off the shelf reagents); full-length transcript | No options for barcoding and UMI (no multiplexing and gene quantification of samples); laborious worflow due to numerous pipetting steps |
| MARS-Seq | A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications | FACS | 92% | 2% | No limitation | None for mammalian cells | Open platform | Automated process; suitable for rare cell sorting; No limitations of cell size, shape or homogeneity | Specialised bioinformatic tools required |
Droplet Encapsulation Technologies
液滴封裝技術(shù)振定、10x Genomics Chromium 和 Dolomite-Bio Nadia 的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒋罅考?xì)胞分選成液滴內(nèi)的少量單細(xì)胞，從而提供高通量和相對(duì)低成本的單細(xì)胞分析洼畅。樣品和試劑效率吩案。 Chromium 系統(tǒng)利用 GEM（Gel Bead-in-emulsion）技術(shù)，其中凝膠珠的高度多樣性池帝簇，每個(gè)凝膠珠都涂有獨(dú)特的寡核苷酸條形碼序列，與逆轉(zhuǎn)錄 (RT) 試劑和油環(huán)境中的細(xì)胞混合形成數(shù)以千計(jì)的單個(gè)細(xì)胞乳液液滴靠益。這種基于 GEM 的 Chromium 儀器可以達(dá)到 65% 的細(xì)胞捕獲效率（即捕獲用于下游分析的輸入細(xì)胞的比例）丧肴，而雙峰率相對(duì)較低，僅為 0.9%（兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞組合）胧后。此外芋浮，在微流控芯片中處理多達(dá) 8 個(gè)樣本，可在 10-20 分鐘內(nèi)捕獲 100-80,000 個(gè)細(xì)胞，并將隨后的條形碼庫匯集起來用于下游測(cè)序纸巷。除了 10x Chromium 外镇草，還可以使用 Dolomite-Bio Nadia 系統(tǒng)用包被有包含獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符 (UMI) 序列的寡核苷酸的珠子包裹單個(gè)細(xì)胞。與基于 GEM 的 Chromium 系統(tǒng)不同瘤旨，Nadia 系統(tǒng)在從芯片收集液滴后將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA梯啤，在降低 RT 抑制風(fēng)險(xiǎn)方面具有優(yōu)勢(shì)。 Nadia 系統(tǒng)還提供帶有集成攪拌器的芯片存哲，以確保細(xì)胞和珠子在整個(gè)運(yùn)行過程中均勻分布（每次運(yùn)行 2-8 個(gè)芯片中的樣品）因宇。然而，與 10x Chromium 系統(tǒng)相比祟偷，細(xì)胞捕獲效率較低察滑，并且 Nadia 儀器需要訓(xùn)練有素的人員來操作運(yùn)行。這些技術(shù)的廣泛采用可能會(huì)受到測(cè)序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)的限制修肠，因此這些公司現(xiàn)在正在為之前沒有生物信息學(xué)經(jīng)驗(yàn)的生物學(xué)家提供端到端的解決方案來處理贺辰、分析和可視化單個(gè)-細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)。
Nadia 平臺(tái)不提供用于數(shù)據(jù)處理和可視化的軟件嵌施，并要求用戶使用公開可用的管道進(jìn)行分析饲化。 這可能是生物學(xué)家廣泛使用和吸收的障礙，因?yàn)楣_可用的管道需要 R 或 Unix 中的計(jì)算技能艰管。 對(duì)于 Chromium 和 Nadia 系統(tǒng)滓侍，應(yīng)該考慮對(duì)高濃度活細(xì)胞的要求，以最大限度地提高液滴中單個(gè)細(xì)胞的封裝吞吐量牲芋。 在所有單細(xì)胞儀器中撩笆，10x Chromium 系統(tǒng)是目前癌癥免疫治療中最流行的單細(xì)胞分析平臺(tái)。
Microwell Encapsulation Platforms
常用的微孔封裝平臺(tái)有 Fluidigm C1缸浦、Illumina/Bio-Rad ddSeq夕冲、Takara-Bio ICell8 和 BD Rhapsody。在所有微孔技術(shù)中裂逐，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)是最早的一代歹鱼，被認(rèn)為是單細(xì)胞領(lǐng)域的奠基人。 C1 系統(tǒng)于 2012 年發(fā)布卜高，是第一臺(tái)允許研究人員分離弥姻、選擇、表型和分選單個(gè)細(xì)胞的機(jī)器掺涛，不僅用于全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序庭敦，還用于靶向 DNA 或 RNA 測(cè)序、全基因組或外顯子組測(cè)序薪缆、small RNA 分析秧廉、和表觀基因組學(xué)。 C1 系統(tǒng)利用集成微流控芯片 (IFC) 將單個(gè)細(xì)胞隔離到單獨(dú)的微通道中，從而實(shí)現(xiàn) 39% 的細(xì)胞捕獲效率疼电。盡管包括手動(dòng)移液和取出細(xì)胞在內(nèi)的工作流程很繁瑣嚼锄，但 C1 儀器允許研究人員在顯微鏡下目視檢查捕獲的細(xì)胞，將雙倍率降低到 3%蔽豺。由于 IFC 的范圍為 5–10区丑、10–17 和 17–25 μm，因此墨盒和試劑的成本可能會(huì)大幅增加茫虽，尤其是在腫瘤免疫學(xué)研究中刊苍，因?yàn)椴煌?xì)胞群的細(xì)胞大小不同。
與 C1 系統(tǒng)相比濒析，Takara-Bio ICell8 平臺(tái)在免疫腫瘤學(xué)研究中可能更實(shí)用正什，因?yàn)?ICell8 使用納米孔芯片來捕獲大小為 5 到 100 μm 的細(xì)胞（捕獲效率為 37%）。 ICell8 還提供可定制的工作流程号杏，用戶可以在其中直觀地控制空孔或雙聯(lián)體婴氮，并為下游轉(zhuǎn)錄組工作選擇感興趣的細(xì)胞。 ICell8 應(yīng)用試劑盒方案提供了不同測(cè)序試劑盒（包括 Oxford Nanopore Library Preparation Kit 和 Illumina 全長轉(zhuǎn)錄組試劑盒）的靈活性盾致，并兼容使用條形碼和 UMI 進(jìn)行文庫構(gòu)建主经。
另一個(gè)為單細(xì)胞工作流程提供靈活性的平臺(tái)是 Illumina/Bio-Rad ddSeq 儀器。 ddSeq 可擴(kuò)展試劑盒適用于兩種樣本量實(shí)驗(yàn)庭惜，其中一個(gè)試劑盒的格式可以處理成百上千個(gè)細(xì)胞罩驻，而另一個(gè)試劑盒設(shè)計(jì)用于處理數(shù)萬個(gè)細(xì)胞。 ddSeq 的協(xié)議很簡單护赊，捕獲的細(xì)胞被封裝到液滴中惠遏，用于 cDNA 合成和文庫制備以進(jìn)行測(cè)序。 提供了對(duì)端到端工作流程的支持骏啰，包括生物信息學(xué)和用戶友好的可視化工具节吮，對(duì)于沒有經(jīng)驗(yàn)的用戶幫助他們分析和解釋單細(xì)胞數(shù)據(jù)很有用。
最近判耕，BD Biosciences 生產(chǎn)的基于微孔的最新儀器 Rhapsody 聲稱其系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高達(dá) 80% 的高單線態(tài)捕獲效率透绩，具體取決于細(xì)胞類型和用戶處理。然而壁熄，一些研究表明帚豪，總體細(xì)胞捕獲率為 65%，尤其是具有不同細(xì)胞類型和大小的樣本草丧。 Rhapsody 平臺(tái)使用 UMI 條形碼磁珠在 200,000 個(gè)微孔陣列上捕獲多達(dá) 40,000 個(gè)單細(xì)胞志鞍，并且是一個(gè)類似于 Microwell-seq 的基于孔的系統(tǒng)。 Rhapsody 的協(xié)議提供對(duì)墨盒和微孔的目視檢查方仿，以確保樣品的質(zhì)量足以進(jìn)行下游分析鸟废。該工作流程的另一個(gè)特點(diǎn)是可以保留剩余的珠子以備后用蚌吸，從而允許將子樣品珠子用于多個(gè)文庫制備，從而降低測(cè)序成本。 Rhapsody 平臺(tái)可與 BD AbSeq 結(jié)合使用港准，以提供單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和 mRNA 表達(dá)水平的絕對(duì)定量。蛋白質(zhì)和 mRNA 表達(dá)的測(cè)量對(duì)于理解細(xì)胞的復(fù)雜調(diào)控至關(guān)重要氮昧，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)胞表面標(biāo)志物（如 T 細(xì)胞中的 CD4）每個(gè)細(xì)胞具有數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)分子蓄愁，但僅由少量 mRNA 轉(zhuǎn)錄物驅(qū)動(dòng)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)常見問題是 mRNA 表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍贾节。高表達(dá)的基因如核糖體基因?qū)⒃跍y(cè)序運(yùn)行中主導(dǎo)reads汁汗，而低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本包括免疫基因?qū)⑾∈瑁瑥亩绊憸?zhǔn)確定量并導(dǎo)致不必要的測(cè)序成本栗涂。 BD Rhapsody 工作流程為用戶提供了一個(gè)選項(xiàng)來選擇特定的 mRNA 面板（例如知牌，BD Rhapsody 免疫反應(yīng)面板），并允許富集目標(biāo)以提供更高的靈敏度斤程，以檢測(cè)在全轉(zhuǎn)錄組分析中可能會(huì)遺漏的稀有分子角寸。建議將靶向 RNA 方法用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，而不是用于發(fā)現(xiàn)研究忿墅。
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
除了前面描述的現(xiàn)代單細(xì)胞分離技術(shù)外扁藕，傳統(tǒng)的基于 FACS 的單細(xì)胞方法，如 SMART-seq2 和 MARS-seq疚脐，是實(shí)驗(yàn)室中一種成熟且標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)亿柑。 SMART-seq2 和 MARS-seq 都將目標(biāo)群體中的單個(gè)細(xì)胞分選到含有裂解緩沖液的 96 孔或 394 孔板中，并且在測(cè)序前這些板可以保存很長時(shí)間棍弄。這些技術(shù)不受細(xì)胞大小或形態(tài)或細(xì)胞總數(shù)的限制望薄，有助于對(duì)非常稀有的目標(biāo)細(xì)胞群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雖然 MARS-seq 的單細(xì)胞協(xié)議是自動(dòng)化的照卦，但 SMART-seq2 中的檢測(cè)需要手動(dòng)移液到單個(gè)孔中式矫，從而使其更加繁瑣，并增加了技術(shù)可變性役耕。 SMART-seq2 不適合需要數(shù)千個(gè)單獨(dú)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)采转，除非將液體處理機(jī)器人納入工作流程以減少移液問題。 SMART-seq2 和 MARS-seq 之間的另一個(gè)明顯區(qū)別是 cDNA 合成的長度瞬痘。 SMART-seq2 生成全長 cDNA 并在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中產(chǎn)生更高的測(cè)序覆蓋率故慈，而 MARS-seq 采用 3' 端單細(xì)胞 RNA 測(cè)序方法，其中部分 cDNA 在逆轉(zhuǎn)錄步驟中用條形碼和 UMI 標(biāo)記框全。與 3' 末端計(jì)數(shù) mRNA 相比察绷，全長轉(zhuǎn)錄本測(cè)序在檢測(cè)低表達(dá)基因和亞型方面具有優(yōu)勢(shì)，并允許進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析津辩。在實(shí)驗(yàn)中采用 SMART-seq2 或 MARS-seq 時(shí)拆撼，用戶應(yīng)注意容劳，基于 FACS 的方法既不提供細(xì)胞質(zhì)量的視覺成像檢查，也不提供選擇細(xì)胞進(jìn)行下游測(cè)序的選項(xiàng)闸度。由于這兩種技術(shù)通常都需要預(yù)先定義的標(biāo)記竭贩，因此稀有亞群的表型需要多種組合的多種不同標(biāo)記，這有助于更好地識(shí)別亞群和下游分析策略莺禁。
Spatially Resolved RNA Technologies
繪制完整組織切片中 RNA 分子的亞細(xì)胞位置是使用單細(xì)胞技術(shù)捕捉細(xì)胞內(nèi)功能和生物信號(hào)的重要步驟留量。 這有助于更深入地了解數(shù)據(jù)和腫瘤生物學(xué)，例如了解腫瘤進(jìn)展和治療耐藥性哟冬。 表 2 總結(jié)了幾種新的高維空間解析 RNA 技術(shù)楼熄，包括 STARmap、seqFISH浩峡、MERFISH可岂、FISSEQ、Slide-seq红符、Nanostring GeoMx青柄、10x Visium/Spatial 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和高清空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (HDST)。 有不同的方法可用 對(duì)于空間重新解析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法预侯，每種方法的比較已在其他地方進(jìn)行了廣泛的審查致开。 因此，本節(jié)重點(diǎn)介紹這些基于原位捕獲的平臺(tái)的一個(gè)子集萎馅，這些平臺(tái)對(duì)于癌癥研究中的生物標(biāo)志物和治療研究變得越來越重要和廣泛使用双戳。
NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)
NanoString GeoMx DSP 平臺(tái)允許在單個(gè)點(diǎn)以 10–600 μm 分辨率對(duì) RNA 和/或蛋白質(zhì)進(jìn)行多重分析。該儀器使用標(biāo)有寡核苷酸條形碼的抗體糜芳，探針在空間上帶有不同 RNA 種類的標(biāo)簽飒货，以從樣本組織區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。 GeoMx DSP 依靠熒光標(biāo)記來視覺引導(dǎo)選定區(qū)域峭竣，揭示形態(tài)（細(xì)胞大小和形狀）和/或感興趣的轉(zhuǎn)錄物塘辅。可以使用 GeoMx 數(shù)據(jù)中心軟件處理皆撩、分析和可視化收集到的數(shù)據(jù)扣墩。由于工作流程的穩(wěn)健性以及對(duì)數(shù)據(jù)可視化和分析的支持，GeoMx DSP 迄今為止已獲得更廣泛的采用扛吞。該技術(shù)的另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是呻惕，與傳統(tǒng)的激光捕獲顯微切割不同，GeoMx 不會(huì)導(dǎo)致組織破壞滥比，因此可以重新分析一系列組織切片中的 RNA亚脆。由于 GeoMx 旨在在單細(xì)胞水平的組織切片中分析用戶定義的感興趣區(qū)域 (ROI) 內(nèi)的綜合 RNA 面板的空間表達(dá)，因此該平臺(tái)需要對(duì)目標(biāo)（多達(dá) 18,000 個(gè)基因）及其相關(guān)的先驗(yàn)知識(shí)盲泛。靈敏度將 ROI 的分辨率限制在 20-200 個(gè)細(xì)胞的水平濒持。盡管選擇 ROI 的工作流程在很大程度上是自動(dòng)化的键耕，但對(duì)整個(gè)組織切片的分析是不可行的，這使得無偏的區(qū)域分析變得困難弥喉。
10x Genomics Visium
10x Genomics Visium 空間基因表達(dá)系統(tǒng)采用了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST) 概念郁竟，將福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 或新鮮冷凍組織成像與高通量測(cè)序相結(jié)合。該公司通過減少條碼間距并將空間分辨率提高到 55 μm 來改進(jìn) ST 技術(shù)由境。 Visium 由一個(gè)玻璃病理載玻片組成，其中嵌入了帶有空間 UMI 和 poly(dT) 錨的探針蓖议，允許在透化后在固體表面上結(jié)合 poly(A) 尾的 mRNA 分子虏杰。逆轉(zhuǎn)錄直接在載玻片上原位進(jìn)行，隨后提取 cDNA 復(fù)合物用于文庫生成和測(cè)序勒虾。值得注意的是纺阔，Visium 檢測(cè)目前提供用于基因鑒定的 3' RNA 測(cè)序。類似于 NanoString GeoMx 平臺(tái)修然，用戶友好的圖形界面軟件 (Space Ranger) 可用于數(shù)據(jù)分析和可視化笛钝。 Visium 還允許免疫熒光蛋白與全轉(zhuǎn)錄組空間分析的共同檢測(cè)。盡管 Visium 提供了空間解析的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)愕宋，但當(dāng)前直徑為 55 μm 的條形碼區(qū)域可能包含 1 到 10 個(gè)細(xì)胞玻靡。與 NanoString GeoMx 技術(shù)類似，Visium 將檢測(cè)范圍限制在給定區(qū)域內(nèi)的幾個(gè)到數(shù)百個(gè)細(xì)胞中贝。用戶應(yīng)該注意囤捻，這可能會(huì)在分析 TME 的某些區(qū)域時(shí)造成一些困難，因?yàn)榘┘?xì)胞經(jīng)常與免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的組合相鄰邻寿。
Slide-Seq
Slide-seq 是最近建立的基于非商業(yè)捕獲的技術(shù)蝎土，提供了類似于 10x Genomics Visium 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，但具有更高的 10 μm 細(xì)胞分辨率绣否。 Slide-seq 方法使用一個(gè)玻璃蓋玻片誊涯，其中包含隨機(jī)疊加的唯一條形碼 10 μm 珠子。在樣品制備程序之前蒜撮，通過連接測(cè)序原位解碼帶條形碼的珠子的位置暴构。 Slide-seq 技術(shù)可用于分析大型組織切片，因?yàn)檫@種方法不受 ROI 的限制淀弹。從 Slide-seq 生成的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)需要用于計(jì)算處理和數(shù)據(jù)解釋的開源工具丹壕，因此它需要專門的分析和數(shù)據(jù)分析專業(yè)知識(shí)。 Slide-seq 的一個(gè)關(guān)鍵限制是薇溃，從組織透化到 cDNA 提取用于文庫制備的實(shí)驗(yàn)過程相對(duì)耗時(shí)菌赖，這導(dǎo)致由于混雜效應(yīng)而丟失基因表達(dá)信息。敏感性降低會(huì)影響檢測(cè)低表達(dá)基因的能力沐序，這可能會(huì)影響可以研究的生物學(xué)問題琉用，特別是與腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性堕绩、罕見免疫亞群以及它們對(duì)免疫治療抗性和腫瘤復(fù)發(fā)的貢獻(xiàn)有關(guān)的問題。
High-Definition Spatial Transcriptomics (HDST)
HDST 具有與 Slide-seq 類似的策略邑时，但使用尺寸為 2 μm 的高清空間條形碼珠奴紧。 每個(gè)珠子都包含帶條形碼的 mRNA 捕獲引物，這些珠子使用拆分池方法隨機(jī)放置在有序的高密度珠子陣列中晶丘。 HDST 使用比 Slide-seq 更小的珠子黍氮，因此與 Slide-seq 相比具有更好的空間分辨率，從 10 μm 到 2 μm浅浮。 HDST 樣品制備前的初始方案類似于 Slide-seq沫浆，其中珠子的位置通過順序雜交進(jìn)行解碼。 HDST 的缺點(diǎn)類似于 Slide-seq滚秩，包括需要專門的分析和生物信息學(xué)專業(yè)知識(shí)以及 mRNA 捕獲的低靈敏度专执。
Table 2. Specifications of in situ capture spatial transcriptomic technologies.
| Platform | Company/Academic | Detection Efficiency | Resolution | Number of Captured Cells | Sample Type | Analytical Tool | Advantages | Relative Limitations | References |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| GeoMx | NanoString | Not reported | 10–600 μm | 20–200 cells per ROI | Fresh-frozen or FFPE | GeoMx Data Centre Software | Easy to operate (high level of automation); intensive support for end-to-end solution; Ability to profile protein/RNA; single-cell level | Low efficiency of cell capture when using smaller ROIs; Require user-defined ROIs | Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue |
| Slide-seq | Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells | 0.30% | 10 μm | ~70,000 | Fresh-frozen | Open platform or Seurat R package | Relatively high resolution; scalability; spatial resolution for large tissue volumes | Low sensitivity; minimal support for data processing and analysis | Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution |
| Visium | 10x Genomics | >6.9% | 55 μm | 1–10 cells per ROI | Fresh-frozen or FFPE | 10x Space Ranger | Intensive support for end-to-end solution; coverage across a large area of tissue | User-defined regions contain multiple cells | Method of the Year: Spatially resolved transcriptomics |
| High-definition spatial transcriptomics | Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ | 1.30% | 2 μm | ~160,000 | Fresh-frozen | Open platform | High resolution | Low sensitivity; minimal support for data processing and analysis | High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling |
Dissecting the Tumour Immune Microenvironment Using Single-Cell Approaches
癌癥通常始于基因組中的錯(cuò)誤，導(dǎo)致正常細(xì)胞行為失調(diào)并促進(jìn)惡性表型郁油。不同的轉(zhuǎn)錄程序和細(xì)胞命運(yùn)的不同階段有助于建立腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 (ITH)本股，其中同一患者的腫瘤細(xì)胞亞群出現(xiàn)在腫瘤的不同區(qū)域之間或獲得克隆優(yōu)勢(shì)并隨著時(shí)間的推移進(jìn)化以轉(zhuǎn)移和出現(xiàn)免疫逃逸變異[101]。在轉(zhuǎn)移過程中和在全身治療的選擇壓力下桐腌，進(jìn)一步的復(fù)雜性被引入到進(jìn)化過程中拄显。腫瘤必須建立具有脈管系統(tǒng)和基質(zhì)框架的 TME 以支持其生長，同時(shí)通過異常的細(xì)胞間和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)募集調(diào)節(jié)和免疫抑制細(xì)胞以逃避免疫系統(tǒng)哩掺。選擇壓力不僅決定了 TME 的基質(zhì)和免疫環(huán)境凿叠，還引發(fā)了對(duì)腫瘤的選擇壓力，從而減輕了全身治療的影響嚼吞。為了充分了解腫瘤發(fā)生盒件、癌癥進(jìn)展和對(duì)癌癥治療的反應(yīng)的生物學(xué)，需要研究腫瘤和 TME 進(jìn)化的動(dòng)力學(xué)及其相互作用舱禽。單細(xì)胞技術(shù)在免疫腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用展示了表征影響黑色素瘤和其他癌癥類型免疫治療反應(yīng)和耐藥性的 TME 特征的潛力炒刁，如下表：
Table 3. Translational insights of immuno-oncology in melanoma from single-cell analyses.
| Key Findings | Single-Cell Platforms | Identified Cell Types |
|---|---|---|
| CD8 T cells associated with TCF7 transcription factor were predictive of immunotherapy response; exhausted T cells with abnormal activation of metabolic pathways are correlated with unfavourable prognosis | Smart-Seq2 | CD8+ T cell subtypes (exhausted, na?ve and cytotoxic) |
| Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative compartment within human melanoma; the abundance of dysfunctional T cells is associated with tumour recognition | MARS-Seq | Intratumoural CD4 and CD8 T cells |
| B cells and tertiary lymphoid structures promote ICB response and improve patient survival | Smart-Seq2 | B cells |
| Monocyte-derived APCs are central to the response of PD-1 checkpoint blockade and anti-CD40 is a potential novel treatment | Smart-Seq2 | Monocyte-derived dendritic cells |
| Macrophage and γδ T cell subtypes are overrepresented in non-responders to immunotherapy; gene expression signature of these innate cells can help predict treatment response. | Smart-Seq2 and 10x Genomics Chromium | TREM-high macrophages and γδ T cells |
| A cancer-associated transcriptional program promotes T cell exclusion and resistance to checkpoint immunotherapies | Smart-Seq2 | Melanoma cell (resistance signature associated with T cell exclusion and immune evasion) |
| Genetic heterogeneity in Stage III melanoma; coexistence of multiple melanoma signatures within a single tumour region | 10x Genomics Visium | Gene expression profiles of melanoma and lymphoid cells |
| Seven major subpopulations of CD8+ T cells are identified, of which, the exhausted T cell subpopulation is associated with unfavourable prognosis and increased in later-stage melanoma samples, while favourable na?ve/memory and cytotoxic subpopulation cells are decreased | 10x Genomics Chromium | 7 representative subpopulations of CD8+ T cells |
Table 4. Translational insights of immuno-oncology of other cancer types from single-cell analyses.
| Cancer Type | Key Findings | Single-Cell Platforms | Identified Cell Types |
|---|---|---|---|
| Breast | Trajectory analysis on longitudinal samples demonstrated distinct T cell states associated with activation, hypoxia and terminal differentiation | 10x Genomics Chromium | CD45+ immune cells (Clusters of T cell, myeloid cell, B cell and NK cell) |
| Tumours with high TILs contained CD8+ T cells with features of TRM T cell differentiation and these CD8+ TRM cells expressed high levels of immune checkpoint molecules and effector proteins; CD8+ TRM gene signature significantly associated with improved patient survival | 10x Genomics Chromium | TREM-specific CD8+ T cells | |
| Cancer associated fibroblast clusters are linked to immunotherapy resistance, promote cancer cell differentiation and T cell exclusion | 10x Genomics Chromium | Cancer-associated fibroblast subsets | |
| Ovarian | Immune-desert tumours demonstrated low antigen presentation and enrichment of monocytes and immature macrophages; immune-infiltrated and -excluded tumours differ markedly in their T cell composition and fibroblast subsets; chemokine-receptor interactions were identified as potential mechanisms mediating immune cell infiltration | 10x Genomics Chromium | Tumour, stromal and immune cells |
| Lung | A high ratio of tumour-infiltrating “pre-exhausted” T cells to exhausted T cells was associated with better prognosis; a gene signature of activated tumour Tregs correlated with poor prognosis in lung adenocarcinoma | Smart-Seq2 | Peripheral blood, peritumoural and intratumoural T cells |
| Liver | Tumour-associated macrophages suppress T cell infiltration in hepatocellular carcinoma and TIGIT-NECTIN2 interaction regulates the immunosuppressive environment; transition of immune cells towards a more immunosuppressive and exhaustive status exemplifies the overall cancer-promoting immune landscape | 10x Genomics Chromium | Tumour and immune cells |
Dissecting Intra-Tumoural Heterogeneity (ITH)
ITH 是導(dǎo)致治療耐藥和癌癥進(jìn)展的主要因素。 致癌性改變的亞克隆變異被假設(shè)是某些克隆治療逃避和隨后復(fù)發(fā)的主要原因之一誊稚。 例如翔始，在用激酶抑制劑治療后會(huì)積極選擇表達(dá)高水平 AXL（受體酪氨酸激酶）的罕見抗治療黑色素瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致耐藥性的發(fā)展里伯。 此外城瞎，少數(shù)高度特化的細(xì)胞，如類癌干細(xì)胞疾瓮，通常處于靜止細(xì)胞狀態(tài)脖镀，為腫瘤細(xì)胞維持腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和抵抗免疫和治療控制提供了有利的環(huán)境狼电。 干細(xì)胞樣腫瘤表型的特點(diǎn)是 CD133 和 CD44 的高表達(dá)蜒灰，這些細(xì)胞還可以通過 WNT 活性上調(diào) PD-L1 和 CD80 來逃避免疫監(jiān)視弦蹂，使其對(duì)基于免疫的療法產(chǎn)生抵抗力
單細(xì)胞 RNA-seq (scRNA-seq) 平臺(tái)能夠檢測(cè)腫瘤亞克隆并確定單個(gè)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和表型差異。 一個(gè)例子是葡萄膜黑色素瘤的 scRNA-seq 研究强窖，其中對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)行采樣凸椿，并通過液滴鉻系統(tǒng)處理單個(gè)細(xì)胞。 使用軌跡分析推斷腫瘤和免疫細(xì)胞進(jìn)化過程中的遺傳變化翅溺，重建轉(zhuǎn)錄克隆分支以識(shí)別能夠逃避免疫的倍性和轉(zhuǎn)錄程序的克隆選擇脑漫。 這些方法在理解治療選擇壓力下的免疫療法耐藥性方面具有很大的前景。 治療患者系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將允許鑒定賦予免疫療法抗性的不同細(xì)胞譜系
Diversity of the Tumour Immune Microenvironment
多組學(xué)異質(zhì)性不僅限于腫瘤細(xì)胞未巫。 事實(shí)上窿撬，作為一種免疫原性癌癥類型，各種免疫細(xì)胞構(gòu)成了黑色素瘤的 TME叙凡，這對(duì)腫瘤進(jìn)化施加了微環(huán)境選擇壓力，并介導(dǎo)了對(duì)某些全身治療的反應(yīng)密末。 通過基因測(cè)序?qū)?TME 進(jìn)行的無偏見探索越來越多地用于研究 TME 以及腫瘤中的細(xì)胞相互作用和分子變化握爷。
scRNA-seq 最常見的應(yīng)用之一是表征腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 (TIL) 的庫和數(shù)量。轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的 scRNA-seq 分析定義的不同 T 細(xì)胞亞群和 TIL 比例與免疫治療反應(yīng)和患者預(yù)后相關(guān)严里。值得注意的是新啼，代謝途徑異常激活的耗竭 T 細(xì)胞比例較高與預(yù)后不良相關(guān)，而幼稚/記憶細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞比例較高與預(yù)后良好相關(guān)刹碾。在另一項(xiàng)研究中燥撞，對(duì)來自接受免疫治療的 48 名黑色素瘤患者的 16,000 多個(gè)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜分析確定了兩種不同的 CD8+ T 細(xì)胞狀態(tài)。 CD8+ T 細(xì)胞與特定轉(zhuǎn)錄因子 TCF7 的關(guān)聯(lián)被確定為反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物迷帜。此外物舒，李等人。確定了黑色素瘤中功能失調(diào)的 T 細(xì)胞區(qū)室的形成戏锹，其中早期效應(yīng) CD8+ T 細(xì)胞在 TME 內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楹慕郀顟B(tài)冠胯，并且功能障礙特征的強(qiáng)度反映了腫瘤對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)性。相比之下锦针，B 細(xì)胞主導(dǎo)的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的形成被證明可以逆轉(zhuǎn) T 細(xì)胞耗竭并導(dǎo)致腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)性提高荠察。在乳腺癌、卵巢癌奈搜、肺癌和肝癌的 scRNA-seq 分析中也鑒定了預(yù)測(cè)性和預(yù)后性免疫效應(yīng)細(xì)胞群
最近的研究將免疫細(xì)胞異質(zhì)性的分析擴(kuò)展到 TME 中的髓源性群體悉盆。 發(fā)現(xiàn)腫瘤駐留的單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞在對(duì)抗 PD-1 有反應(yīng)的黑色素瘤患者中顯著富集。 在小鼠模型中用激動(dòng)劑抗 CD40 抗體靶向這種抗原呈遞細(xì)胞群導(dǎo)致效應(yīng) T 細(xì)胞的擴(kuò)增和抗腫瘤免疫的實(shí)施馋吗。 接受基于檢查點(diǎn)的免疫療法的黑色素瘤患者的 scRNA-seq 分析還檢測(cè)到無反應(yīng)者中 γδ T 細(xì)胞和 TREM2+ 巨噬細(xì)胞的上調(diào)焕盟。 通過表征先天免疫細(xì)胞，我們對(duì)指導(dǎo)抗腫瘤 T 細(xì)胞反應(yīng)的免疫啟動(dòng)有了更深入的了解耗美。
單細(xì)胞技術(shù)也可用于研究細(xì)胞相互作用京髓。 33 個(gè)黑色素瘤的 scRNA-seq 詢問了促進(jìn) T 細(xì)胞排斥的惡性細(xì)胞狀態(tài)航缀，并表征了與免疫治療反應(yīng)不佳相關(guān)的冷免疫生態(tài)位的基因組特征。對(duì)來自 19 名黑色素瘤患者（包括惡性堰怨、免疫芥玉、基質(zhì)和上皮細(xì)胞）的 4600 多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行的單細(xì)胞測(cè)序顯示，TME 極大地影響了黑色素瘤細(xì)胞的基因表達(dá)程序备图。對(duì)來自 15 個(gè)黑色素瘤樣本的 2000 個(gè) T 細(xì)胞的 T 細(xì)胞受體 (TCR) 序列的分析表明灿巧，共抑制受體的表達(dá)與 T 細(xì)胞活化相關(guān)，并且在擴(kuò)增的 T 細(xì)胞克隆中富集揽涮。該研究還確定了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF)抠藕、非惡性基質(zhì)細(xì)胞類型的豐度與腫瘤基因特征的表達(dá)之間的聯(lián)系。此外蒋困，發(fā)現(xiàn) CAF 表達(dá)的一部分基因會(huì)增加 CD4+FOXP3+ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs) 的比例盾似，從而形成免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而阻止腫瘤反應(yīng)性免疫反應(yīng)雪标。在乳腺癌中也觀察到由 CAF 亞型介導(dǎo)的免疫治療耐藥機(jī)制零院，其中 CAF 簇表現(xiàn)出 Treg 中檢查點(diǎn)的上調(diào)，進(jìn)而增加了 TME 內(nèi)其他潛在抑制性 CAF 亞型的豐度村刨「娉總之，這些研究強(qiáng)調(diào)了識(shí)別單細(xì)胞測(cè)序提供的新型免疫治療靶點(diǎn)的機(jī)會(huì)嵌牺。
Use of Single-Cell Analysis to Identifying Biomarkers of Response to Immunotherapies and Novel Drug Targets
研究已經(jīng)開始使用 scRNA-seq 探索免疫檢查點(diǎn)抑制劑的全身作用打洼，以獲得對(duì)其作用機(jī)制的更全面的了解，并確定治療反應(yīng)和抵抗的生物標(biāo)志物逆粹。
一種流行的方法是將單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和 TCR 測(cè)序配對(duì)募疮。循環(huán)和腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞的 scRNA-seq 允許定義 T 細(xì)胞表型，而 TCR 測(cè)序揭示了免疫療法治療后血液和 TME 中匹配克隆型的擴(kuò)展枯饿。這種方法已被用于鑒定與治療反應(yīng)和耐藥性相關(guān)的擴(kuò)增 T 細(xì)胞克隆酝锅。具體而言，在患者對(duì)免疫療法產(chǎn)生持久反應(yīng)后奢方，表達(dá)共享 TCR 序列的 T 細(xì)胞可以作為組織駐留 T 細(xì)胞 (Trm) 或效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (Tem) 存在至少 9 年搔扁。這種研究血液和腫瘤中匹配 T 細(xì)胞群的方法提供了對(duì)免疫治療反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制的新理解。然而蟋字，匹配克隆的擴(kuò)增提示循環(huán)T細(xì)胞在腫瘤部位外滲稿蹲，因此不能直接用這種方法識(shí)別腫瘤新抗原。
通過將外周免疫細(xì)胞表型和臨床數(shù)據(jù)的患者特異性 scRNA-seq 分析相結(jié)合鹊奖，Griffith 等人苛聘。提出了一種用動(dòng)態(tài)數(shù)學(xué)模型估計(jì)抗腫瘤免疫攻擊程度和預(yù)測(cè)臨床反應(yīng)的方法。新模型提供了對(duì)免疫治療應(yīng)答者和非應(yīng)答者腫瘤生長的免疫調(diào)節(jié)的見解，證明了外周干擾素信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞分化的差異设哗，因此將它們識(shí)別為抗 PD-1 反應(yīng)的外周血指標(biāo)唱捣。該研究能夠通過使用來自具有相同治療方案和樣本檢索時(shí)間點(diǎn)的一組臨床試驗(yàn)患者的樣本，揭示治療期間患者特異性反應(yīng)的演變网梢。外周血樣本的時(shí)間分析顯示震缭，免疫治療無反應(yīng)者的 T 細(xì)胞豐度較低，治療后缺乏擴(kuò)增和效應(yīng)表型分化战虏。此外拣宰，根據(jù)宿主免疫系統(tǒng)需要時(shí)間來建立抗原識(shí)別和發(fā)展適應(yīng)性反應(yīng)的理論，作者觀察到與化學(xué)療法相比烦感，細(xì)胞對(duì)免疫療法的反應(yīng)延遲巡社，這表明發(fā)生免疫學(xué)變化所需的時(shí)間。這突出了時(shí)間點(diǎn)選擇對(duì)免疫治療研究的重要性手趣，并為未來的研究和臨床試驗(yàn)提供了信息晌该。
血液采樣是一種非侵入性來源，可用于探索免疫療法的潛在生物標(biāo)志物绿渣。血液的使用繞過了可能導(dǎo)致腫瘤間異質(zhì)性的大塊組織活檢的局限性气笙，同時(shí)提供了對(duì)全身免疫反應(yīng)的見解。接受伊匹單抗治療的黑色素瘤患者的初步報(bào)告顯示怯晕，總體生存期和無進(jìn)展生存期 (PFS) 的改善與基線常規(guī)血細(xì)胞計(jì)數(shù)的外周免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)，包括低調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞頻率和高淋巴細(xì)胞頻率缸棵；臨床獲益還與免疫檢查點(diǎn)治療期間血液標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)舟茶，包括調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞數(shù)量的減少和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加。最近使用液體活檢的單細(xì)胞基因組研究也揭示了外周 T 細(xì)胞亞型的擴(kuò)增與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)堵第；雖然黑色素瘤細(xì)胞的 scRNA-seq 確定了對(duì)細(xì)胞具有抗性的免疫療法具有轉(zhuǎn)化為 T 細(xì)胞排斥機(jī)制的突變程序吧凉，但一項(xiàng)單獨(dú)的研究確定了記憶 T 細(xì)胞群在對(duì)免疫療法有持久反應(yīng)的患者中持續(xù)了多年。這些研究顯示了在具有非侵入性組織來源的免疫治療應(yīng)答者中定義全身免疫特性和進(jìn)化的激動(dòng)人心的機(jī)會(huì)踏志。需要未來的前瞻性研究來驗(yàn)證更大隊(duì)列中臨床獲益的預(yù)測(cè)阀捅。
空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法已被用于研究和可視化黑色素瘤組織切片中 mRNA 的分布。這一新興領(lǐng)域提供了將感興趣的細(xì)胞表型置于其空間環(huán)境中的能力针余，從而可以分析細(xì)胞內(nèi)通訊和 TME 生態(tài)位饲鄙。 III 期淋巴結(jié)黑色素瘤轉(zhuǎn)移中轉(zhuǎn)錄景觀的可視化確定了不同組織學(xué)實(shí)體的獨(dú)特基因表達(dá)譜，特別是靠近腫瘤邊緣的淋巴細(xì)胞的特殊表達(dá)模式可能反映了黑色素瘤 TME 的遺傳譜圆雁。這項(xiàng)技術(shù)還提供了對(duì) B 細(xì)胞功能狀態(tài)的新見解忍级，表明三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)參與了免疫治療反應(yīng)。同樣伪朽，該技術(shù)可用于檢測(cè) TME 中配體和受體對(duì)的相互作用轴咱，隨著這些分析分辨率的提高，定位單個(gè)細(xì)胞及其配體 - 受體配對(duì)的能力可以為新型免疫原性的合理化提供重要信息代理。由于成本和吞吐量方面的考慮朴肺，這些空間技術(shù)尚未廣泛用于研究和臨床評(píng)估窖剑。盡管如此，最近的研究結(jié)果以及正在進(jìn)行的技術(shù)改進(jìn)為其未來的應(yīng)用提供了廣闊的前景戈稿。
Future Perspectives in Incorporating Single-Cell Analysis into Clinical Trials and Routine Care of Cancer Patients
在現(xiàn)代癌癥治療中西土，準(zhǔn)確的診斷和治療決策基于原發(fā)腫瘤的解剖起源及其具體特征。多年來器瘪，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)的單細(xì)胞分析已被用于對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行細(xì)分翠储。它們是實(shí)驗(yàn)室和臨床中區(qū)分非惡性細(xì)胞和癌細(xì)胞不可或缺的工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)提供了一種更強(qiáng)大的方法來廣泛表征活檢中細(xì)胞群的整個(gè)分子表型橡疼，這可以導(dǎo)致對(duì)患者疾病的更準(zhǔn)確的診斷和表型分析援所。例如，科恩等人欣除。采用 scRNA-seq (MARS-seq) 作為 KYDAR 試驗(yàn)（達(dá)雷妥尤單抗住拭、卡非佐米、來那度胺和地塞米松 (DARA-KRD) 的單臂前瞻性試驗(yàn)）的一部分历帚。合著者報(bào)告說滔岳，轉(zhuǎn)錄程序和抗性特征已確定MARS-seq 可以幫助預(yù)測(cè)耐藥性并根據(jù)患者疾病的特定表型指導(dǎo)治療選擇。盡管迄今為止單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)尚未用于黑色素瘤臨床試驗(yàn)挽牢，但 TME 譜和追蹤免疫細(xì)胞群將為優(yōu)化治療選擇和驗(yàn)證治療效果提供藍(lán)圖谱煤，可能會(huì)在未來改善患者管理。
在使這些單細(xì)胞平臺(tái)在臨床上更容易獲得之前禽拔，仍有一些障礙需要克服刘离。 首先，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間數(shù)據(jù)的高維性需要專門的團(tuán)隊(duì)來生成和執(zhí)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析睹栖。 其次硫惕，通常需要腫瘤分離的樣本收集，尤其是對(duì)于 scRNA-seq野来，通常是有限的并且在邏輯上具有挑戰(zhàn)性恼除。 然而，F(xiàn)FPE 樣本的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)正在改進(jìn)曼氛，這可以減輕這些限制豁辉。 第三，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中體細(xì)胞拷貝數(shù)變異的低水平基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄的能力仍然具有挑戰(zhàn)性搪锣。 最后秋忙，需要降低當(dāng)前技術(shù)的成本和周轉(zhuǎn)時(shí)間，以在臨床預(yù)期范圍內(nèi)運(yùn)行构舟。
Conclusions
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)了新的關(guān)鍵因素和表型改變灰追，它們不僅會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展堵幽，還會(huì)導(dǎo)致治療耐藥。 此外弹澎，通過單細(xì)胞分析鑒定罕見的細(xì)胞亞群朴下，為了解治療的反應(yīng)和抗性提供了有用的見解。 對(duì)于黑色素瘤和其他癌癥類型苦蒿，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法為發(fā)現(xiàn)與免疫治療反應(yīng)和耐藥性相關(guān)的多維生物標(biāo)志物特征鋪平了道路殴胧，并將有助于開發(fā)下一代免疫療法，從而改善生存結(jié)果 在癌癥患者中佩迟。
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