介紹一篇文獻(xiàn)：Single-cell analysis reveals new evolutionary complexity in uveal melanoma审孽，2020年發(fā)表于Nature Communications壮锻，DOI號(hào)：https://www.nature.com/articles/s41467-019-14256-1找筝。
葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma, UM）相比于皮膚黑色素瘤，是一種高度轉(zhuǎn)移性的癌癥骚秦，檢查點(diǎn)免疫療法在很大程度上無(wú)響應(yīng)甲馋。UM根據(jù)基因表達(dá)譜分為 class 1（中、低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)）和 class 2（高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)）若贮。 “BSE”突變指BAP1, SF3B1, EIF1AX三個(gè)基因的突變省有，突變近乎相互排斥，分別關(guān)聯(lián)于高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)（class 2）谴麦、中轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)（class 1B）蠢沿、低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)（class 1A）。PRAME可作為UM轉(zhuǎn)移的獨(dú)立biomarker匾效，提示有轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加舷蟀。
單細(xì)胞RNA測(cè)序分析
對(duì)8個(gè)原發(fā)性腫瘤+3個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤，共59,915個(gè)單細(xì)胞面哼，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序野宜。tSNE降維揭示了腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞類型多樣性。
單細(xì)胞CNV分析
利用inferCNV對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞CNV的推斷魔策，scDNA-seq加以驗(yàn)證匈子。采用隱馬爾可夫和貝葉斯?jié)撛诨旌夏Ｐ蛠?lái)確定亞克隆CNV事件，并去除低置信度CNV calls闯袒。先前的研究表明旬牲，典型基因組改變?cè)?UM 早期出現(xiàn)，并產(chǎn)生與特征驅(qū)動(dòng)突變相關(guān)的三個(gè)主要進(jìn)化軌跡之一 —— class 1 A 中的 EIF1AX搁吓、class 1B 中的 SF3B1 和其他剪接突變、class 2 中的 BAP1吭历，然而堕仔，本研究目前單細(xì)胞分辨率的結(jié)果表明，這些腫瘤隨著迄今未被廣泛識(shí)別的非典型 CNV 亞克隆的發(fā)展會(huì)繼續(xù)發(fā)生進(jìn)化晌区。
轉(zhuǎn)錄軌跡分析
利用SCENIC分析scRNA-seq數(shù)據(jù)摩骨，識(shí)別潛在的共表達(dá)模塊，以及與之關(guān)聯(lián)的順式作用元件朗若。癌蛋白 MYC 和 JUN恼五，以及 bHLH-PAS 缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 ARNT，所對(duì)應(yīng)的 motifs 過(guò)表達(dá)哭懈，在 class 2 腫瘤細(xì)胞中顯著富集灾馒。
利用Monocle 2推斷轉(zhuǎn)錄軌跡，所有腫瘤細(xì)胞的偽時(shí)序產(chǎn)生總共 16 個(gè)狀態(tài)遣总，分為兩個(gè)主要分支睬罗。然后分別分析每個(gè)樣本的軌跡，使用分支表達(dá)分析模型（BEAM）和層次聚類來(lái)識(shí)別不同狀態(tài)所富集的基因旭斥。在各樣本中識(shí)別到 HLA class I 基因容达、黑色素細(xì)胞分化（PMEL）、TNF-alpha/NF-kB signaling（FOS, FOSB, JUN, JUNB, EGR1）的富集垂券，與轉(zhuǎn)錄狀態(tài)不同程度的相關(guān)花盐。并且各樣本的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)分布在不同的亞克隆和細(xì)胞周期階段，印證了表型可塑性（phenotypic plasticity）。
免疫細(xì)胞和V(D)J免疫組庫(kù)分析
腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄狀態(tài)之間的適應(yīng)性可塑由TME信號(hào)驅(qū)動(dòng)算芯。針對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)化分析柒昏，進(jìn)行tSNE降維，并根據(jù)每個(gè)cluster的基因平均表達(dá)水平聚類也祠。T和B細(xì)胞受體的V(D)J重組分析顯示昙楚，只有三個(gè)樣本存在T細(xì)胞克隆擴(kuò)增，是原發(fā) class 2 樣本诈嘿，但它們是耗竭性T細(xì)胞克隆擴(kuò)增堪旧。
CD8+ T 細(xì)胞表達(dá)的與耗竭相關(guān)的免疫檢查點(diǎn)分子， LAG3 表達(dá)最高奖亚，TIGIT表達(dá)多變淳梦，PDCD1 (PD1)、CTLA4昔字、HAVCR2 (TIM3) 和 TNFRSF9 表達(dá)極低爆袍。多色免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。與此同時(shí)作郭，腫瘤細(xì)胞低表達(dá) PD-L1 和 PD-L2陨囊。這可能部分解釋了CTLA4 和 PD1阻斷在轉(zhuǎn)移性UM中的失效，且提示 LAG3 可能在T細(xì)胞衰竭中發(fā)揮作用夹攒。
討論
- 推測(cè) class 1 UM 的長(zhǎng)潛伏期和低轉(zhuǎn)移率可能是由于免疫監(jiān)視蜘醋，至少部分是由于EIF1AX和SF3B1突變產(chǎn)生的新抗原。這種可能性可能具有臨床意義咏尝，并值得進(jìn)一步研究压语。
- 相比之下，推測(cè) class 2 UM 腫瘤的典型基因組改變和整體上的非整倍體增加引起了免疫抑制性微環(huán)境编检，進(jìn)而通過(guò)免疫逃逸促進(jìn)轉(zhuǎn)移胎食。
- scRNA-seq V(D)J 分析顯示在 UM 樣本中存在克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞和/或漿細(xì)胞，表明腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞能夠產(chǎn)生響應(yīng)允懂，低突變負(fù)荷并不是其對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑響應(yīng)差的唯一解釋厕怜。
- LAG3 作為UM中主要的耗竭marker，可以解釋（至少部分解釋）之前針對(duì)CTLA4和PD1的檢查點(diǎn)阻斷的失敗蕾总。LAG3是第三種免疫抑制受體酣倾，與PD1有相當(dāng)大的協(xié)同作用，不僅在CD8+ T細(xì)胞上表達(dá)谤专，還在NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上表達(dá)躁锡，具有獨(dú)特的特性，可以顯著擴(kuò)大檢查點(diǎn)抑制劑治療的療效置侍。
最后的最后映之，重溫一下Abstract：
【針對(duì)討論的前兩點(diǎn)拦焚，有些許疑問(wèn)，實(shí)際上根據(jù)文獻(xiàn)杠输，我們可以得到各個(gè)樣本各種免疫細(xì)胞的占比赎败， class 2 中 CD8+ cytotoxic T cells 和 CD8+ T effector memory cells 的占比明顯比 class 1 高出很多，如果是根源上的基因組aneuploidy的原因蠢甲，按情況應(yīng)該是產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)“冷”的腫瘤微環(huán)境僵刮，而非現(xiàn)在所展現(xiàn)的landscape。這種情況大概率是由于抗原的持續(xù)存在與刺激鹦牛，在多種調(diào)控因子的作用下致使T細(xì)胞逐漸耗竭搞糕，進(jìn)而抑制性受體 LAG3 表達(dá)增高（LAG3的表達(dá)的確近乎均分布在 class 2 樣本中），屬于動(dòng)態(tài)的微環(huán)境變化曼追，相關(guān)線索應(yīng)該多從轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組著手窍仰，個(gè)人淺見(jiàn)】。
