hello千所，大家好碉京，上一篇文章空間轉(zhuǎn)錄組檢測靶點(diǎn)定量技術(shù)----Digital Spatial Profiler（DSP）中分享了DSP的技術(shù)原理以及簡單的文獻(xiàn)分享情妖，但是我們真正了解這個技術(shù)的實(shí)際運(yùn)用，還是要多看看高分文獻(xiàn)的使用方法以及結(jié)果解讀忧额，今天呢泌神，我們就來分享一下DSP的實(shí)際運(yùn)用的文獻(xiàn)，幫助我們深入理解數(shù)字化空間

今天分享的文獻(xiàn)是Visualizing in deceased COVID-19 patients how SARS-CoV-2 attacks the respiratory and olfactory mucosae but spares the olfactory bulb舞虱，2021年11月3號被cell接收欢际，頂級期刊，這樣級別的文章運(yùn)用矾兜，值得我們的好好研究损趋。

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SUMMARY

Anosmia，即嗅覺喪失椅寺，是 COVID-19 的常見癥狀浑槽，而且通常是其唯一癥狀蒋失。 導(dǎo)致嗅覺功能障礙的一系列病理生物學(xué)事件的發(fā)生仍然不清楚。 在這里桐玻，作者開發(fā)了一種死后床邊外科手術(shù)篙挽，以通過內(nèi)窺鏡采集呼吸和嗅覺粘膜以及整個嗅球的樣本。 作者的 85 例病例隊(duì)列包括在感染 SARS-CoV-2 幾天后死亡的 COVID-19 患者镊靴，這使能夠在病毒仍在復(fù)制時捕獲它铣卡。 研究發(fā)現(xiàn)sustentacular cells是嗅粘膜中的主要靶細(xì)胞類型。 研究未能找到嗅覺感覺神經(jīng)元感染的證據(jù)偏竟，嗅球的實(shí)質(zhì)也幸免于難煮落。 因此，SARS-CoV-2 似乎不是嗜神經(jīng)病毒踊谋。 研究假設(shè)來自sustentacular cells的短暫支持不足會在 COVID-19 中引發(fā)短暫的嗅覺功能障礙蝉仇。 嗅覺感覺神經(jīng)元會受到影響而不會被感染。

INTRODUCTION

嗅覺功能障礙在 COVID-19 大流行的早期就被發(fā)現(xiàn)殖蚕，并且是與 COVID-19 檢測呈陽性相關(guān)的強(qiáng)烈且一致的癥狀轿衔。 進(jìn)入大流行的第二年，對于 SARS-CoV-2 如何mutes或改變嗅覺嫌褪，尚無任何解釋呀枢。 一個懸而未決的問題是嗅覺神經(jīng)是否可以為 SARS-CoV-2 提供進(jìn)入大腦的途徑。

在 SARS-CoV-2 進(jìn)入scene后不久笼痛，病毒細(xì)胞侵入基因 ACE2 和 TMPRSS2 在人和小鼠嗅覺系統(tǒng)中的表達(dá)模式就得到了表征裙秋。 得出的推論是sustentacular cells而不是嗅覺感覺神經(jīng)元 (OSN) 可能是嗅覺上皮 (OE) 中的易感細(xì)胞類型。 但是缨伊，令人費(fèi)解的是摘刑，其他六種冠狀病毒中的兩種，SARS-CoV 和地方性 HCoV-NL63刻坊，也使用 ACE2基因進(jìn)入細(xì)胞枷恕，但通常不會引起嗅覺功能障礙。 SARS-CoV-2 在 COVID-19 患者的sustentacular cells中的復(fù)制仍有待證明谭胚。

Historically徐块，對正常和患病人類嗅覺粘膜 (OM) 和嗅球 (OB) 的組織學(xué)和分子研究很少。從在世和已故的患者身上采集質(zhì)量合適且身份明確的樣本已被證明是有問題的灾而。宏觀上不能將 OM 與呼吸道粘膜 (RM) 區(qū)分開來胡控。從解剖學(xué)上講湃番，OM 由一系列大小不一的islands組成隘庄，這些islands散布在 RM 中澡谭，位于嗅覺裂隙內(nèi)鼻腔的高處。與實(shí)驗(yàn)室嚙齒動物的 OM 相比膀捷，人類 OM 不是一個uniform sensory sheet栗涂。在人類 OE 中依啰，Patches of aneuronal epithelium are intercalated with patches containing abundant OSNs in human OE奋献。 OM 由 OE 和固有層 (LP) 組成，這兩層由基底層緊密結(jié)合在一起凡傅。簡單地說辟狈，不可能采集到純?nèi)祟?OM 的樣本，更不用說純?nèi)祟?OE 的樣本了像捶。 此外上陕，由于顱內(nèi)位置和干預(yù)的虛弱后果，不能從活著的患者身上進(jìn)行 OB 活檢拓春。在傳統(tǒng)的尸檢環(huán)境中采集 OM 和 OB 通常只有在長時間的尸檢間隔 (PMI) 后才可行释簿，尤其是在可能仍具有傳染性的 COVID-19 患者中。長期 PMI 后采集的樣品分析因細(xì)胞和組織自溶導(dǎo)致的限制而變得模糊不清硼莽。

作者推斷庶溶，為了大幅降低 PMI，最好在死后不久在床邊進(jìn)行組織采集懂鸵。 進(jìn)一步推斷偏螺，為了研究導(dǎo)致嗅覺功能障礙的病理生物學(xué)事件序列是如何開始的，研究設(shè)計(jì)必須考慮將患者納入感染的急性期匆光，使我們能夠在病毒襲擊時捕捉到病毒套像。

在這里，作者開發(fā)了一種死后床邊外科手術(shù)终息，改編自顱底手術(shù)的內(nèi)窺鏡技術(shù)夺巩，以采集 RM 和 OM 組織樣本和整個 OB。 通過將超靈敏單分子熒光原位 RNA 雜交的 RNAscope 平臺與熒光免疫組織化學(xué) (IHC) 相結(jié)合周崭，可視化了 SARS-CoV-2 如何攻擊嗅覺系統(tǒng)柳譬。 將 RM 中的纖毛細(xì)胞和 OM 中的sustentacular cells鑒定為鼻粘膜中 SARS-CoV-2 復(fù)制的主要靶細(xì)胞類型。 一部分病例顯示在 OB 周圍的軟腦膜層中存在病毒 RNA续镇，但 OB 實(shí)質(zhì)不受感染美澳。 缺乏 OSN 和 OB 神經(jīng)元感染的證據(jù)表明 SARS-CoV-2 不是嗜神經(jīng)病毒。 文章假設(shè)受感染的sustentacular cells短暫地為 OSN摸航、結(jié)構(gòu)和/或生理提供了不足的支持制跟。

RESULTS

Postmortem bedside surgical procedure

我們設(shè)計(jì)了一個 24/7 工作流程，由重癥監(jiān)護(hù)病房 (ICU) 或病房的醫(yī)護(hù)人員在 COVID-19 患者死亡后不久致電耳鼻喉 (ENT) 醫(yī)生團(tuán)隊(duì)發(fā)起

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耳鼻喉科團(tuán)隊(duì)穿著個人防護(hù)設(shè)備酱虎，在死者的床上使用由監(jiān)視器凫岖、光源、相機(jī)和內(nèi)窺鏡設(shè)備組成的預(yù)組裝移動裝置進(jìn)行內(nèi)窺鏡手術(shù)逢净。 這個概念是一項(xiàng)名為 ANOSMIC-19 的臨床研究的基礎(chǔ)，分析 COVID-19 中的嗅覺障礙機(jī)制。 我們納入了 68 名在 2020 年 5 月至 2021 年 4 月期間在魯汶大學(xué)醫(yī)院或 Sint-Jan Brugge-Oostende AV 綜合醫(yī)院死于或死于 COVID-19 的患者隊(duì)列爹土。同時甥雕，我們納入了 15 名對照患者和 2 名康復(fù)期 COVID-19 患者，他們在康復(fù)幾個月后在醫(yī)院死亡胀茵。 我們的 COVID-19 病例隊(duì)列代表了已故 COVID-19 患者相當(dāng)統(tǒng)一的表型：主要是患有多種合并癥的男性社露，最常見的是肥胖或超重、2 型糖尿病和高血壓琼娘。

We adapted the postmortem bedside surgical procedure from the endoscopic endonasal transcribriform approach in skull base surgery峭弟。 簡而言之，為了采集 RM 的樣本脱拼，用 Heymann 鼻剪刀分別切除了鼻腔的下瞒瘸、中和上鼻甲骨。

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接下來熄浓，為了采集 OM 的樣本情臭，dissected the lining of the olfactory cleft including the superior part of the septum and the cribriform plate with a sickle knife, while transecting the fila olfactoria

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隨后，用錘子和鑿子代替鉆頭去除了前顱底的骨性部分赌蔑，避免在這些患者中形成氣溶膠俯在，其中一些患者可能仍然具有傳染性。 在對硬腦膜進(jìn)行縱向切口后娃惯，使用球形探針將 OB 從大腦的上覆部分分離跷乐，確保組織的無損傷去除，并盡可能向后從嗅束中橫切 OB趾浅。

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We performed the procedure on the left and right nasal cavity, and the identical procedure on control patients.

總之愕提，我們大幅降低了 PMI：COVID-19 ICU 患者的中位數(shù)為 67 分鐘，COVID-19 病房患者為 85 分鐘潮孽，對照患者為 89 分鐘揪荣。（這取樣過程真的是相當(dāng)復(fù)雜，難度極高往史，也很有危險性）仗颈。

Combining ultrasensitive in situ RNA hybridization with immunohistochemistry

研究推斷，RNA 病毒的靶細(xì)胞類型的可視化應(yīng)該首先通過 RNA 原位雜交進(jìn)行椎例。 選擇了 RNAscope 技術(shù)挨决，它將單個 RNA 分子可視化為一個點(diǎn)或“punctum”，復(fù)數(shù)“puncta”订歪。 熒光 RNAscope 可與熒光 IHC 結(jié)合使用脖祈，后者將抗原可視化為免疫反應(yīng) (IR) 信號。 IR 信號通常會漫漫地填充細(xì)胞刷晋，從而勾勒出其輪廓盖高，便于細(xì)胞類型識別慎陵。

下圖顯示了對照患者中 RM、OM 和 OB 的冷凍切片圖像喻奥。 通過結(jié)合 RNA（斜體名稱）和蛋白質(zhì)（羅馬名稱）標(biāo)記的表達(dá)席纽、它們的形態(tài)和它們在組織中的位置來識別細(xì)胞類型。 RM 排列在鼻腔的大部分內(nèi)表面(下圖A)

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假復(fù)層呼吸上皮 (RE) 由厚的基底層從 LP 劃定撞蚕。 RE的主要細(xì)胞類型包括纖毛細(xì)胞润梯、杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞。 FOXJ1 編碼一種參與纖毛發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子甥厦，是纖毛細(xì)胞的標(biāo)志物纺铭，纖毛不斷將覆蓋的粘液掃到鼻咽部。 EPCAM 是一種細(xì)胞粘附分子刀疙，可標(biāo)記 RE 中的纖毛細(xì)胞和 LP 中產(chǎn)生粘液的腺體及其導(dǎo)管舶赔。 粘蛋白 MUC5AC 是一種保護(hù) RM 的凝膠形成糖蛋白，是杯狀細(xì)胞的標(biāo)志物庙洼，并且 MUC5AC-IR 信號還可以識別分泌的粘液團(tuán)塊顿痪。 OM 是鼻粘膜的次要成分 （上圖B）。假復(fù)層 OE 的主要細(xì)胞類型是處于不同成熟階段的 OSN油够、非神經(jīng)元支持細(xì)胞或支持細(xì)胞蚁袭，以及基底細(xì)胞，它們是在個體的整個生命過程中再生 OSN 和支持細(xì)胞的干細(xì)胞石咬。在頂端揩悄，成熟的 OSN 長出纖毛，而支持細(xì)胞則長有微絨毛鬼悠。支持細(xì)胞可以通過包括細(xì)胞角蛋白 KRT8 在內(nèi)的幾種標(biāo)記來識別删性，它們的形態(tài)和在 OE 中的位置是特征性的：它們跨越 OE 的頂端 - 基底寬度，它們在頂端形成一個沒有細(xì)胞核的層焕窝，并且在底部它們逐漸變細(xì)并延伸足部加工到薄的基底層蹬挺，從 LP 描繪 OE。成熟 OSN 的經(jīng)典標(biāo)記是嗅覺標(biāo)記蛋白 (OMP)它掂。成熟的 OSN 被認(rèn)為僅表達(dá) 389 個基因庫中的一個完整的氣味受體 (OR) 基因巴帮。圖中顯示一個 OSN 帶有 OR5A1 的斑點(diǎn)，它是 β-紫羅蘭酮的主要受體虐秋，是食品和飲料中的一種關(guān)鍵香氣榕茧。 OR 基因的斑點(diǎn)呈現(xiàn)出類似于櫻桃形狀的特征模式。

OB 位于顱腔內(nèi)（上圖C）客给。它接收來自fila olfactoria 的同側(cè)輸入用押，這是一束OSN 軸突，它們穿過篩狀篩板上的幾十個孔靶剑。 TUBB3 是微管的組成部分蜻拨，是神經(jīng)元和軸突的經(jīng)典標(biāo)志物池充。 TUBB3-IR OSN 軸突在 OB 中合并成腎小球。 OB 的表面被軟腦膜緊密覆蓋缎讼，軟腦膜薄層是 SSTR2A 的 IR纵菌，生長抑素受體 2。另一個軟腦膜層是蛛網(wǎng)膜休涤，一種蜘蛛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與硬腦膜相連笛辟，硬腦膜是堅(jiān)硬的外層 靠近顱骨的腦膜層功氨。 腦脊液在軟腦膜和蛛網(wǎng)膜之間不斷循環(huán)。

In summary, our rapid approach of tissue sample procurement allowed us to generate, from 100% of cases, high-quality confocal images combining RNAscope with IHC.

Viral RNAscope probes and antibody

SARS-CoV-2 是一種正鏈單鏈 RNA 病毒手幢。 在病毒生命周期中產(chǎn)生負(fù)義全長復(fù)制中間體和多個負(fù)義亞基因組 RNA捷凄。 負(fù)義 RNA 反映了正在進(jìn)行的病毒復(fù)制，并且不存在于病毒粒子中围来。 使用了一組七個 RNAscope 探針：SARS-CoV-2-N（核衣殼跺涤，以下簡稱為 N puncta）、SARS-CoV-2-S（尖峰监透；S puncta）桶错、SARS-CoV-2- M（膜；M puncta）胀蛮、SARS-CoV-2-orf1ab（開放閱讀框1a和1b院刁；orf1ab puncta）、SARS-CoV-2-N-sense（N-sense puncta）粪狼、SARS-CoV-2-S -sense (S-sense puncta) 和 SARS-CoV-2-orf1ab-sense (orf1ab-sense)退腥。 有義探針檢測負(fù)義 RNA，在核周出現(xiàn)斑點(diǎn)再榄。 我們還使用針對核衣殼的抗體進(jìn)行了 IHC狡刘。

SARS-CoV-2 infects ciliated cells in the respiratory epithelium（SARS-CoV-2感染呼吸道上皮的纖毛細(xì)胞 ）

為了為檢查嗅裂黏膜樣本提供合適的背景，首先檢查了 RM 樣本

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在 68 例 (44%) COVID-19 病例中的 30 例 RM 中檢測到病毒存在困鸥。 此后嗅蔬，將此subset稱為“信息性”案例。 他們在通過逆轉(zhuǎn)錄窝革、定量聚合酶鏈反應(yīng)（以下簡稱 PCR）診斷出 COVID-19 后 16 天內(nèi)死亡购城，但 COVID #29 除外，后者是實(shí)體器官移植的免疫抑制受體虐译，在診斷后 29 天死亡.沒有在其他 38 個（“非信息性”）COVID-19 病例瘪板、兩個康復(fù)期 COVID-19 病例和 15 個對照病例的 RM、OM 或 OB 中檢測到 SARS-CoV-2 puncta漆诽。 對于 COVID #9 至 #70侮攀，我們對手術(shù)前通過內(nèi)窺鏡檢查的鼻咽 (NP) 拭子進(jìn)行了快速抗原測試（視頻 S1 于 0’31”）锣枝，發(fā)現(xiàn)與 RNAscope 數(shù)據(jù)高度一致。 對于 11 例 COVID-19 病例兰英，我們在術(shù)前采集的第二個 NP 拭子上獲得了 PCR 數(shù)據(jù)撇叁。

我們在 30 個 (90%) 信息豐富的病例中的 27 個 RM 中將纖毛細(xì)胞確定為 SARS-CoV-2 的主要靶細(xì)胞類型，在 4 個 (13%) 中確定了 LP 中襯里腺管的細(xì)胞畦贸。

下圖顯示了控制案例 #12 的 RM 部分的共焦圖像陨闹。 纖毛細(xì)胞彌漫著 KRT7-IR 信號并帶有 FOXJ1 斑點(diǎn)，而細(xì)胞角蛋白 KRT5/6 的 IR 信號標(biāo)記細(xì)胞的基底層薄坏，從 LP 中勾勒出 RE趋厉，EPCAM-IR 標(biāo)記上皮細(xì)胞，MUC5AC-IR 信號標(biāo)記產(chǎn)生粘蛋白的細(xì)胞并識別粘液斑點(diǎn)胶坠。 ACE2-IR 信號在 RE 的管腔表面形成不連續(xù)的薄帶君账，并且整個 RE 中 TMPRSS2 的斑點(diǎn)比比皆是。

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在 COVID #7 的 RE 中沈善，核衣殼-IR 信號彌漫地填充一排不間斷的頂端細(xì)胞（下圖）

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該患者的感染時間線非常明確乡数，他在診斷后 78 小時死亡，之前 3 天和 6 天采集的 NP 拭子的兩個 PCR 結(jié)果呈陰性闻牡。 與感染的急性期一致净赴，核衣殼-IR 細(xì)胞具有核周 orf1ab 感點(diǎn)。 COVID#7（下圖F）中核衣殼 IR 細(xì)胞中具有 orf1ab 感點(diǎn)的核周 N 感點(diǎn)cluster和 COVID #27 中密集排列的 orf1ab 點(diǎn)（下圖G）澈侠。 在 COVID #51 中劫侧，具有 M 和 FOXJ1 斑點(diǎn)的核周 Nsense 斑點(diǎn)cluster（下圖H）。 在 COVID #39 中哨啃，單個纖毛細(xì)胞內(nèi)具有 FOXJ1 點(diǎn)的核周 orf1ab 感點(diǎn)cluster(下圖I)

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COVID#7 中 KRT7-IR 細(xì)胞中具有 FOXJ1 點(diǎn)的核周 S 感點(diǎn)cluster（下圖J）烧栋。在 30 個提供信息的病例中，有 4 個病例感染了 LP 腺管內(nèi)襯的細(xì)胞拳球。 在 COVID #29审姓、#63 和 #67 中，只有導(dǎo)管被感染祝峻，而在 COVID #60 中魔吐，RE 和導(dǎo)管都被感染。 LP 腺管內(nèi)襯的 KRT8-IR 細(xì)胞在 COVID#29（下圖K）和 COVID#63（下圖L）中含有密集的 N 點(diǎn)和 orf1ab 感點(diǎn)莱找。

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最初將 COVID #63 作為對照病例酬姆，在死亡前 82 小時采集的 NP 拭子的 PCR 結(jié)果為陰性，但在我們死后采集的拭子上檢測為 PCR 陽性奥溺。 在我們的隊(duì)列中辞色，COVID #63 從診斷到死亡的時間最短。

In summary, the RM is a major site of infection for SARS-CoV-2 and represents a vast area of cells susceptible to virus entry and replication.Ciliated cells are the major target cell type in the RE, and in a subset of patients, cells lining gland ducts in the LP are infected.

Post-hoc scoring of infection with B.1.1.7/Alpha vs non-B.1.1.7/non-Alpha

In late 2020, Variant of Concern B.1.1.7 made its entry into the SARS-CoV-2 landscape in Belgium, and rapidly took over to become the dominant lineage during the third wave of the COVID-19 pandemic in Belgium. Later known as the Alpha variant, B.1.1.7 is characterized by a higher transmissibility and higher viral load. A 6-nucleotide deletion in S encoding the amino acids HV is specific for the Alpha variant, and a 9-nucleotide deletion in orf1ab encoding SGF of the non-structural protein nsp6 is present in the Alpha, Beta, and Gamma variants. We designed a chromogenic assay with custom probes for BaseScope, a version of the RNAscope platform specific for subtle mutations.

我們獲得了 35 個 COVID-19 病例的關(guān)注變體特異性 PCR 或序列數(shù)據(jù)浮定，其中包括 COVID #60（感染了非 Alpha 譜系）和 COVID #68（感染了 Alpha）相满。 在 COVID #60（診斷后 40 小時死亡的患有活動性腫瘤疾病的患者）的 RE 中层亿，一小部分含有 FOXJ1 斑點(diǎn)的細(xì)胞被核衣殼-IR 信號彌散填充，并且這些細(xì)胞中的大部分含有核周 orf1ab 感斑點(diǎn)立美。 在 COVID #68（診斷后 5 天死亡的患有活動性腫瘤疾病的患者）的 RE 中匿又，核衣殼-IR 細(xì)胞中具有 FOXJ1 點(diǎn)的核周 S 感點(diǎn)cluster

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針對 S 的野生型或缺失形式的兩種 BaseScope 探針的混合分別在 COVID #60 或 COVID #68 的 RE 中產(chǎn)生了藍(lán)綠色或紅色沉淀物。 用于 orf1ab 的野生型或缺失形式的兩個 BaseScope 探針的混合支持這種二元基因分型建蹄。

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In summary, we have developed a post-hoc assay for differential diagnosis of infection with Alpha vs. non-Alpha lineages in fixed tissue samples.

SARS-CoV-2 infects sustentacular cells in the olfactory epithelium

接下來碌更，我們分析了來自嗅裂黏膜的樣本。 我們面臨的挑戰(zhàn)是 OM 島分散在 RM 中并包含 OSN 稀疏甚至不存在的 OE 區(qū)域洞慎。 我們通過神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)嚴(yán)格定義了“OM”针贬，包括 ANO2、CNGA2拢蛋、GNAL、GNG13蔫巩、OMP 和 OR 基因的斑點(diǎn)以及 TUBB3-IR 信號谆棱。 我們在 30 個（20%）信息豐富的病例中的 6 個的 OM 中檢測到 SARS-CoV-2 斑點(diǎn)和核衣殼-IR 信號。 我們將支持細(xì)胞確定為 OE 中的主要靶細(xì)胞類型圆仔，但未能找到 OSN 感染的證據(jù)垃瞧。

下圖A 和 下圖B 顯示了控制案例 #4 的 OM。 支持細(xì)胞彌漫地充滿 KRT8-IR 信號并帶有 TMPRSS2 斑點(diǎn)坪郭，四個相鄰的 OSN 帶有斑點(diǎn)个从，用于 OR 基因 OR5A1、OR5AN1歪沃、OR7C1 和 OR11A1 的探針池（圖 5A）嗦锐。 ACE2-IR 冠狀條紋覆蓋了一系列相互交織的 KRT8-IR 支持細(xì)胞和 TUBB3-IR OSN

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COVID #22 的圖像在診斷后 26 天死亡，并且在任何組織樣本中都沒有檢測到 SARS-CoV-2 斑點(diǎn)沪曙，展示了 OE 的三種主要細(xì)胞類型

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GPX3 的 Puncta 編碼谷胱甘肽過氧化物酶奕污，標(biāo)記 LP 中從頂端到基底和鮑曼腺細(xì)胞的支持細(xì)胞。 ANO2 的 Puncta 編碼嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的氯通道液走，標(biāo)記 OSN 的中間層碳默。 KRT5/6-IR 信號標(biāo)記細(xì)胞的基底層。

一個信息量很大的案例是 COVID #8缘眶，他在診斷后四天死亡嘱根。 TUBB3-IR 細(xì)胞 (OSN) 不包含核衣殼-IR 信號，并且支持細(xì)胞具有 UGT2A1 斑點(diǎn)巷懈。 N puncta 彌漫性地填充了許多從頂端到基部的 OE 寬度的支持細(xì)胞该抒；有趣的是，KRT8-IR 信號識別了一塊未感染的支持細(xì)胞砸喻，而受感染的支持細(xì)胞對 KRT8-IR 信號來說是低的或陰性的柔逼。 N 淚點(diǎn)密集地堆積在細(xì)胞中蒋譬，具有典型的支持細(xì)胞形狀（類似于酒杯，帶有扭曲的莖接觸基底層）愉适，受感染的支持細(xì)胞的較寬頂端部分與含有 UGT2A1 點(diǎn)和未感染的支持細(xì)胞的那些混合在一起犯助。 ERMN 的 IR 信號為上限，ERMN 是一種支持細(xì)胞標(biāo)記物维咸。對于給定標(biāo)記物剂买，受感染的支持細(xì)胞的斑點(diǎn)或 IR 信號低或呈陰性，這與 SARSCoV-2 引起的宿主 mRNA 衰變和宿主蛋白質(zhì)翻譯的抑制一致癌蓖。這種多管齊下的病毒接管可以通過單個受感染的支持細(xì)胞在未感染的支持細(xì)胞中脫穎而出來說明：該細(xì)胞沒有 GPX3 點(diǎn)瞬哼，從頂端到基底彌漫性地充滿核衣殼-IR 信號，并含有核周 orf1ab 感點(diǎn)租副。

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我們詳盡地搜索了 OSN 中 puncta和核衣殼-IR 信號的存在坐慰，但未能找到。 作為否定證據(jù)的例子用僧，S-sense puncta 與 KRT8-IR 信號一起出現(xiàn)在頂端層结胀，而四個 OR 基因探針池的 puncta 出現(xiàn)在中間層。 高倍放大圖像顯示责循，帶有探針池點(diǎn)的 OSN 不包含核周 S 感點(diǎn)糟港。 含有 S-sense puncta 并含有 KRT8-IR 信號的頂端層與含有探針池的 puncta 的 OSN 的中間層是相互排斥的。 帶有 OR 基因 OR7C1 斑點(diǎn)的單個 OSN 及其周圍的幾個 TUBB3-IR 細(xì)胞不含有 S-sense puncta院仿。

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我們在另一個案例 COVID #7 中證實(shí)了這些觀察結(jié)果秸抚。 我們確定了具有 CNGA2 斑點(diǎn)和 TUBB3-IR 信號或 GNAL 斑點(diǎn)的 OSN。 在含有 SOX2 斑點(diǎn)的幾個未感染的支持細(xì)胞中歹垫，有兩個細(xì)胞含有核周 orf1ab 感斑點(diǎn)剥汤。 由于 KRT18-IR 信號的消耗，含有密集 N 點(diǎn)的支持細(xì)胞脫穎而出排惨。 在 COVID #57 和 COVID #25 中秀姐，受感染的 OE 受損，大量組織脫落若贮； 它很可能處于脫屑的邊緣省有。

In summary, sustentacular cells are the major target cell type in the olfactory mucosa. We failed to find evidence for infection of OSNs. The pattern of infection of the OM is patchy.

Spatial whole-transcriptome profiling of the olfactory epithelium of COVID #8(說了這么老半天才到DSP)

在感染的急性期，sustentacular cells的感染是否會對 OSN 中的 OR 基因表達(dá)產(chǎn)生間接影響谴麦？ 為了解決這個假設(shè)蠢沿，我們利用 GeoMx 數(shù)字空間分析（DSP）和整個轉(zhuǎn)錄組圖譜 (WTA) 來獲取 18,318 個人類轉(zhuǎn)錄本。

由于大量成熟的 OSN匾效、幾毫米長的 OE 連續(xù)延伸以及感染斑塊的幾何特征舷蟀，COVID #8 最適合此分析。 我們分析了一張載玻片與 COVID #8 的 OM 的六個相鄰切片。載玻片用 RNAscope 探針對 S 和 IHC 進(jìn)行熒光染色野宜，用于 KRT8/18 和 pan-KRT扫步。 然后將載玻片與 WTA 探針和 orf1ab 和 S 的spike-ins 雜交。根據(jù)來自 S puncta 的熒光信號強(qiáng)度的視覺引導(dǎo)匈子，我們在 OE 中選擇了 17 個感興趣區(qū)域 (AOI)：10 個具有高病毒載量（ ORF1ab 高）和 7 病毒載量低（ORF1ab 低）

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放大顯示了兩個 AOI：AOI 13 在 25,741 μm² 的區(qū)域內(nèi)包含 414 個原子核河胎，AOI 7 在 38,994 μm²的區(qū)域內(nèi)包含 420 個原子核.

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兩種類型的 AOI 之間的核數(shù)沒有顯著差異

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每個 AOI 都單獨(dú)進(jìn)行紫外線照射，以光裂解 WTA 探針以進(jìn)行收集和測序虎敦。 ORF1ab 高與 ORF1ab 低 AOI 中 orf1ab 的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)計(jì)數(shù)與我們對共聚焦掃描的視覺判斷非常吻合

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The S and orf1ab counts have a Pearson’s correlation coefficient of 0.998

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在至少 20% 的 AOI 中檢測到的 9,262 個基因的差異表達(dá)模型顯示游岳，在 ORF1ab 高 AOI 中，支持細(xì)胞標(biāo)記 GPX3其徙、KRT8 和 KRT18 的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)計(jì)數(shù)顯著減少胚迫，而 OSN 標(biāo)記 ANO2 和 GNG13 的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)計(jì)數(shù)顯著增加

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當(dāng)包括富含 ORF1ab 高 AOI 但具有較大 p 值的標(biāo)記基因時，八個sustentacular 細(xì)胞標(biāo)記（-0.80唾那，SD = 0.30）和八個 OSN 細(xì)胞標(biāo)記（0.69访锻，SD = 0.26）的 log2 倍數(shù)變化 (FC) 的平均值 大小相同但方向相反

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After flipping the sign of the FCs for sustentacular cell markers，沒有拒絕與 OSN 標(biāo)記的 FC 的大小沒有差異的零假設(shè)（t 檢驗(yàn)：t = -0.84闹获，df = 13.7朗若，p 值 < 0.4154）。 換句話說昌罩，AOI 的兩種主要細(xì)胞類型的 FC 值是反相關(guān)的。 檢測到的 26 個 OR 基因的 log2 FC 的平均值 (0.66, SD=0.64) 與 8 個 OSN 細(xì)胞標(biāo)記的 log2 FC 的平均值沒有顯著差異（t 檢驗(yàn)：t = -0.14灾馒，df = 29.321茎用，p 值 < 0.89）

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Reassuringly, the four OR genes OR5A1, OR5AN1, OR7C1, and OR11A1 for which we had identified numerous cells in adjacent sections by RNAscope were among the 26 OR genes detected by WTA profiling.

In summary, the intra-slide approach of spatial whole-transcriptome profiling revealed no changes in OR gene expression levels in OE patches of high vs. low viral load in COVID #8.

SARS-CoV-2 can make it to the leptomeningeal layers surrounding the olfactory bulb but spares its parenchyma

與缺乏 OSN 感染的證據(jù)一致，我們未能找到病毒侵入 OB 實(shí)質(zhì)的證據(jù)睬罗。 令人驚訝的是轨功，我們在 30 個 (37%) 信息豐富的病例中的 11 個中發(fā)現(xiàn)了圍繞 OB 的軟腦膜層內(nèi)的病毒 RNA

在 COVID #16（患有活動性腫瘤疾病，診斷后 8.5 天死亡的患者）中容达，整個 OB 矢狀切面的平鋪共聚焦圖像顯示標(biāo)記軟腦膜和蛛網(wǎng)膜的 SSTR2A-IR 信號和 TUBB3-IR 信號 標(biāo)記傳入的 OSN 軸突和 OB 神經(jīng)元

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高倍放大圖像顯示軟腦膜靠近 OB 的一側(cè)有 N puncta

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在同一 OB 的相鄰部分古涧，在軟腦膜的一段內(nèi)出現(xiàn)密集的 N 點(diǎn)，并伴有豐富的核衣殼-IR 信號花盐，這種組合可能反映游離病毒粒子羡滑，但不在 OB 實(shí)質(zhì)中

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在另一部分中，S puncta出現(xiàn)在由內(nèi)皮細(xì)胞中的 PECAM1 點(diǎn)定義的斜切血管內(nèi)

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在 COVID #7 中算芯，N puncta出現(xiàn)在部分分離的 SSTR2A-IR 軟腦膜中柒昏，但不在 OB 實(shí)質(zhì)中

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在 COVID #27（診斷后 93 小時死亡）中，密集的 M puncta出現(xiàn)在覆蓋 OB 的軟腦膜和含有 PECAM1 點(diǎn)的血管范圍外熙揍，但不在 OB 實(shí)質(zhì)中

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在 COVID #60（診斷后 40 小時死亡的患有活動性腫瘤疾病的患者）中职祷，靠近 OB 的軟腦膜樣本，包括到硬腦膜的過渡區(qū)，含有豐富的 N 和 S puncta散布在 SSTR2A-IR 信號中

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In summary, SARS-CoV-2 does not appear to be a neurotropic virus, in the sense that it does not infect OSNs and OB neurons.

DISCUSSION

從 SARS-CoV-2 急性攻擊人類嗅覺系統(tǒng)的角度來看有梆，我們在這里對 COVID-19 采取了病毒中心論的觀點(diǎn)是尖。 我們將支持細(xì)胞鑒定為 OM 中的主要靶細(xì)胞類型，未能找到 OSN 和 OB 實(shí)質(zhì)感染的證據(jù)泥耀，并在 OB 周圍的軟腦膜層中發(fā)現(xiàn)了病毒 RNA饺汹。

Catching SARS-CoV-2 in the act of attacking the nasal mucosa

Our cohort consisted of patients who died from or with COVID-19 in two major hospitals over a period of 12 months spanning the first three waves of the pandemic in Belgium. We consistently kept the PMI at approximately one hour. None of the 85 cases had to be excluded because of poor staining quality. As the onset of symptoms is not always clear or even known and is subject to patient recall, we chose to report the period until death starting from the time the NP swab was taken that led to the diagnosis.

30 個提供信息的病例在診斷后的中位時間為 8.8 天（Q1-Q3：4-12），而 38 個非信息案例的死亡時間為 21.1 天（Q1-Q3：11-37）（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)爆袍， U=144首繁，z=-5.26，p<0.001）陨囊。 兩名康復(fù)期的 COVID-19 患者在康復(fù)幾個月后死亡弦疮，在組織樣本中沒有檢測到病毒 RNA 或核衣殼-IR。 其中之一蜘醋，COVID #3胁塞，是成功進(jìn)行雙側(cè)肺移植的捐贈者。 我們在 COVID #3 的死后肺活檢中檢測到 N 和 S 點(diǎn)压语，但在 RM啸罢、OM 和 OB 中未檢測到。

在 30 個提供信息的案例中胎食，9 個（30%）在死亡時顯示出持續(xù)的病毒復(fù)制扰才，根據(jù)感覺點(diǎn)的存在來判斷：COVID #7、#8厕怜、#27衩匣、#39、#51粥航、#60琅捏、# 63、#67 和 #68递雀。 這些患者在診斷后 8.5 天內(nèi)死亡柄延。 我們的七個 RNAscope 探針和核衣殼抗體組合代表了評估病毒復(fù)制的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。 由于支持細(xì)胞具有吞噬活性缀程，因此支持細(xì)胞中核衣殼-IR（或尖峰-IR 信號）的單純證明不足以將這些細(xì)胞稱為感染：該信號可能反映了來自感染細(xì)胞的碎片的吞噬作用搜吧。

Infection of sustentacular cells

RM 中的主要目標(biāo)細(xì)胞類型是纖毛細(xì)胞。 我們對 RM 樣本進(jìn)行廣泛檢查的目的是為檢查嗅裂粘膜樣本提供合適的背景杨凑，鑒于 OM 作為 RMocean中的archipelago of islands的分散分布赎败。 感染的不均勻性疊加在 OM 的分散分布上。 在 OM island中具有病毒 RNA 和核衣殼-IR 信號且明顯包含 OSN 的六個 COVID-19 病例中蠢甲，我們還在 RM 樣本中檢測到病毒 RNA 和核衣殼-IR 信號僵刮。

OM 中的主要靶細(xì)胞類型是sustentacular cells。這些非神經(jīng)元細(xì)胞具有類似神經(jīng)膠質(zhì)的特性，并且在整個生命周期中都可以從 OE 中的干細(xì)胞再生搞糕。由于關(guān)于人類支持細(xì)胞的文獻(xiàn)稀缺勇吊，目前尚不清楚實(shí)驗(yàn)室嚙齒動物支持細(xì)胞的特性在多大程度上與人類相似。嚙齒動物的支持細(xì)胞被賦予了無數(shù)的角色窍仰，統(tǒng)稱為“支持”：吸收汉规、解毒、代謝驹吮、滋養(yǎng)针史、吞噬、物理碟狞、分泌啄枕、結(jié)構(gòu)。一種大鼠模型提出族沃，支持細(xì)胞從 LP 的血管中吸收葡萄糖频祝，并將其分泌到頂端的粘液中，為 OSN 纖毛提供燃料脆淹。對大鼠的細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究表明常空，單個支持細(xì)胞的頂半部內(nèi)包裹著多個 OSN 樹突。在人類中盖溺，帶狀連接復(fù)合體連接相鄰的支持細(xì)胞和 OSN漓糙。鑒于這些密切關(guān)聯(lián)，當(dāng)支持細(xì)胞被 SARS-CoV-2 感染時烘嘱，如果 OSN 在結(jié)構(gòu)和/或生理上受到影響也就不足為奇了

從 ACE2 和 TMPRSS2 的表達(dá)可以推斷昆禽，支持細(xì)胞可能對 SARS-CoV-2 感染敏感。 我們的發(fā)現(xiàn)與這些推論一致拙友。 另一方面，人類冠狀病毒 SARS-CoV 和 HCoV-NL63 也將 ACE2 作為進(jìn)入受體歼郭，但不會引起嗅覺障礙遗契，但 SARSCoV 除外。 有趣的是病曾，盡管器官趨向性非常不同牍蜂，但所有冠狀病毒小鼠肝炎病毒株都使用相同的細(xì)胞進(jìn)入受體。 受體的表達(dá)模式可以預(yù)測哪些細(xì)胞可以被感染泰涂，但并不意味著所有表達(dá)該受體的細(xì)胞甚至表達(dá)水平最高的細(xì)胞都是主要目標(biāo)鲫竞。 ACE2 的一種分泌形式可以解釋其中的一些差異。 嗅覺上皮細(xì)胞中的 Neuropilin-1 表達(dá)已被用作促進(jìn) SARS-CoV-2 細(xì)胞進(jìn)入和感染的輔助因子

Absence of evidence for infection of OSNs

同樣逼蒙，人類 OSN 不表達(dá) ACE2 和 TMPRSS2 的流行解釋是从绘，OSN 可能不易受 SARS-CoV-2 感染。 盡管如此，在活著的和已故的 COVID-19 患者中已經(jīng)提出了散發(fā)性 OSN 的感染僵井。 但是受感染的 OSN 的比例極低陕截，因此這些零星事件會導(dǎo)致嗅覺喪失是難以置信的。 不幸的是批什，在兩項(xiàng)尸檢研究中使用的唯一 SARS-CoV-2-S 抗體 3A2 可能會結(jié)合特定的非 SARS-CoV-2 抗原农曲。 SARS-CoV-2 在 COVID-19 患者的 OSN 中的復(fù)制尚未得到證實(shí)。

我們將空間全轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用于 COVID #8 的 OE驻债，以定量解決對 OR 基因表達(dá)的間接影響的假設(shè)乳规。這種方法與 RNAscope 分析是互補(bǔ)和正交的。我們采用了患者內(nèi)合呐、載玻片內(nèi)分析的分析方法暮的，并在 OE 內(nèi)詢問了多個 AOI。我們對 GeoMx WTA 數(shù)據(jù)的解釋是合砂，在高病毒載量與低病毒載量的 AOI 中青扔，來自受感染細(xì)胞亞群的 RNA 的相對貢獻(xiàn)降低。 SARS-CoV-2 的非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp1 引起宿主 mRNA 的快速衰變翩伪，這與我們的觀察結(jié)果一致微猖，即受感染的支持細(xì)胞對于標(biāo)記基因（如 UGT2A1、GPX3 和 SOX2）的斑點(diǎn)很少或沒有斑點(diǎn)缘屹。 AOI 可以被視為數(shù)百個細(xì)胞的微小凛剥、定向活檢，并且來自 AOI 的 RNA 表達(dá)計(jì)數(shù)被標(biāo)準(zhǔn)化轻姿。因此犁珠，OSN 標(biāo)記基因標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)計(jì)數(shù)的反相關(guān)增加并不反映 OSN 中基因表達(dá)的上調(diào)，而是受感染的支持細(xì)胞中的 mRNA 衰減互亮。 OR 基因的基因表達(dá)不會發(fā)生變化——既不下降也不上升犁享。為了證實(shí)和擴(kuò)展這些發(fā)現(xiàn)，有必要調(diào)查在診斷后死亡但仍然感染 OE 的病例豹休。

Admittedly, the absence of evidence for infection of OSNs does not constitute evidence of absence. We leave the possibility open that OSNs may become infected and support viral replication in a subset of patients, or in certain disease courses or phases.

Leptomeningeal viral RNA presence does not necessarily equal neuroinvasion

OSN 似乎沒有為 SARS-CoV-2 提供從鼻腔通過 OB 直接到達(dá)大腦的途徑炊昆。一個有趣的觀察結(jié)果是，我們在 30 個信息豐富的病例中的 11 個病例中威根，在 OB 周圍的軟腦膜層中發(fā)現(xiàn)了 SARS-CoV-2 斑點(diǎn)凤巨。我們推測這些斑點(diǎn)反映了游離細(xì)胞外病毒粒子內(nèi)的 RNA，而不是受感染細(xì)胞在出芽前合成的細(xì)胞內(nèi)病毒 RNA洛搀。感覺斑點(diǎn)的缺失反對在這些位點(diǎn)進(jìn)行病毒復(fù)制敢茁。這些病毒粒子可能通過腦脊液到達(dá)軟腦膜，腦脊液在蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)流動留美。畢竟彰檬，它們可能是通過嗅覺神經(jīng)到達(dá)顱腔的伸刃，但與其說是通過 OSN 軸突在細(xì)胞內(nèi)遷移，不如說是在細(xì)胞旁搭便車僧叉∞戎Γ或者，軟腦膜病毒粒子可能采取血行途徑并繼發(fā)于病毒血癥瓶堕，病毒粒子從腦膜血管溢出到腦脊液中隘道。一種具有較少病理意義的解釋是，病毒點(diǎn)僅僅反映了 RNA 血癥郎笆，即血液中漂浮的病毒 RNA 序列谭梗，無論是整個基因組還是其片段。這些病毒粒子可能主要留在細(xì)胞外宛蚓，不會引起炎癥激捏，這與關(guān)于 COVID-19 患者腦膜炎的臨床報(bào)告稀少一致。但它們可能會導(dǎo)致一部分患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，例如通過促使產(chǎn)生針對神經(jīng)抗原的自身抗體。人們很容易推測体箕，這種病毒 RNA 的存在可能會擾亂信號從 OB 到大腦皮層的嗅覺傳播，從而導(dǎo)致嗅覺功能障礙图柏。

Here too, the absence of evidence for invasion of the OB parenchyma does not equal evidence of absence of invasion. In any case, our data do not support the neurotropic properties and neuroinvasive capacity that have been attributed by some to SARS-CoV-2

A look ahead

COVID-19 嗅覺功能障礙的發(fā)病機(jī)制可能在患者中是多因素和異質(zhì)的。 不需要單一的機(jī)制來解釋所有的嗅覺功能障礙病例任连。 我們支持一種病理生物學(xué)機(jī)制蚤吹，即當(dāng)受感染的支持細(xì)胞不再為 OSN 提供足夠的結(jié)構(gòu)和/或生理支持時，最終使嗅覺減弱或改變的事件序列開始随抠。 它們甚至可能損害 OSN裁着，例如通過作為抗病毒反應(yīng)一部分分泌的趨化因子的旁分泌作用。 OE 是一個功能單元拱她，由神經(jīng)元成分 (OSN) 和非神經(jīng)元成分（支持細(xì)胞）組成二驰，這兩種成分在整個生命過程中都由干細(xì)胞（基底細(xì)胞）再生。 嗅覺功能障礙通常是短暫的秉沼，當(dāng)新產(chǎn)生的一組支持細(xì)胞恢復(fù)對 OSN 的支持時桶雀，嗅覺就會恢復(fù)

23andMe COVID-19 計(jì)劃報(bào)告了一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究，比較了近 70,000 名 SARS-CoV-2 檢測呈陽性的先證者的嗅覺或味覺喪失與嗅覺或味覺喪失的情況氧猬。確定了一個相關(guān)的基因座背犯，包括編碼 UDP 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的 UGT2A1 和 UGT2A2 基因坏瘩。在大鼠中盅抚，UGT2A1 參與氣味代謝，這有助于終止嗅覺信號倔矾。我們對 UGT2A1 斑點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)支持支持細(xì)胞在 COVID-19 相關(guān)嗅覺功能障礙中的作用妄均。鑒于支持細(xì)胞的表面位置柱锹，將 ACE2 受體呈遞給粘液內(nèi)的病毒粒子，粘膜免疫系統(tǒng)可能無法防止這些細(xì)胞的感染丰包。它可能不得不容忍在重新感染期間恢復(fù)期 COVID-19 患者或在突破性感染期間完全接種疫苗的個體的支持細(xì)胞中病毒復(fù)制的短暫階段禁熏。因此，在隨后接觸 SARS-CoV-2 時邑彪，先前的自然感染或疫苗接種可能無法完全防止嗅覺功能障礙瞧毙。

Conclusion

Understanding the mechanisms whereby human sustentacular cells normally support OSNs in countless ways may yield clues for therapeutic interventions aimed at preventing, alleviating, or curing olfactory dysfunction in COVID-19. The spotlight ought to be shone on the unsung heroes of the sense of smell – the humble sustentacular cells.

Method,關(guān)注一下DSP

RNAscope in situ hybridization

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Immunohistochemistry

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Spatial whole-transcriptome profiling

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生活很好，有你更好