hello发乔，大家好垄惧，今天給大家分享一個新的空間轉錄組技術---Digital Spatial Profiler（DSP）遏片，目前公司打算引進，我們來看看這個空間技術又有什么樣獨特的角度顽爹。

技術背景纤泵，組織的空間異質性，不同區(qū)域的表達基因的差異

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技術發(fā)展镜粤，bulk是統(tǒng)一體捏题，單細胞精度高，但是我們的組織是一個有序的組織肉渴，細胞類型在空間位置上是不可能割裂的存在公荧，那么，新的空間技術同规，就強調細胞與細胞之間的作用稚矿。

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組織異質性的空間體現(xiàn)庸诱，不同區(qū)域的表達特征差異明顯

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技術原理

探針設計，這個長度大家要注意晤揣，二代測序。

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GeoMx Digital Spatial Profiler 采用獨家專利技術在抗體或者 RNA 上偶聯(lián) DNA Oligo朱灿。每個 DNAOligo 對應一個靶標昧识，最高可達 96 個蛋白靶標或>1000 個 RNA 靶標（二代測序輸出）。當抗體或 RNA 與組織上的靶標結合后盗扒，GeoMx DigitalSpatial Profiler 利用激光切斷 DNA oligo 與抗體或 RNA 之間的連接物跪楞，從而釋放出 DNA Oligo 以進行下一步定量。

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產(chǎn)品特點

多靶標

Nanostring 生物技術的 GeoMx Digital Spatial Profiler 一天之內可以處理多達 20 個組織切片樣本侣灶。每個樣本可以包含多達 96 個蛋白和>1000 個 RNA 靶物甸祭。

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多組學

如何在同一組織樣本中實現(xiàn)多組學研究向來是臨床醫(yī)學的棘手問題。目前市面上現(xiàn)有平臺受制于技術褥影，只能進行 RNA 或者蛋白測定池户。而 GeoMx Digital Spatial Profiler 則正好填補了這一空白。它不僅可以一次性測定多達 96 個蛋白凡怎，而且還可以同時進行多過 1000 個 RNA 靶物的測定校焦，完美實現(xiàn)多組學研究。

高精度

激光激活的精度范圍最小為 10 微米统倒，可達到單細胞水平寨典。因此研究人員可以對極其稀有的細胞群體進行捕獲。（這個地方大家要注意房匆，還是無法真正做到單細胞水準）耸成。

樣本無損

整個操作過程于樣本無接觸無損傷。同一樣本可以重復使用并用于其他實驗浴鸿。

彈性選擇感興趣區(qū)域（ROI）

由于不同組織的獨有特點井氢，研究人員往往在單一載玻片上可能對某一區(qū)域特別感興趣。在保留組織樣本完整性的情況下赚楚，GeoMx DigitalSpatial Profiler 可以允許使用者在單張載玻片上根據(jù)組織輪廓選取感興趣區(qū)域（Region Of Interest, ROI）毙沾，甚至選取稀有細胞群體進行分析。

區(qū)域選擇宠页，下圖中的組織形態(tài)位置左胞，大家可能對不同研究區(qū)域進行分區(qū)研究（示例用圓圈選擇ROI）

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面對這樣的選擇，還是不夠精細举户，這個時候需要根據(jù)熒光顏色信號再次進行分選烤宙，精細切割（segments）

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當然，有很多情況復雜的腫瘤組織

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目前在挑選ROI的時候呢俭嘁，可以對一個ROI區(qū)域依據(jù)熒光信號進一步劃分躺枕，總體來說，在marker抗體染片的時候是比較重要的。

使用簡單

GeoMx Digital Spatial Profiler 操作簡單拐云。數(shù)據(jù)分析不需要額外的生物信息分析支持罢猪，有利于生物標志物的快速發(fā)現(xiàn)。研究人員可以根據(jù)實驗需要采取自動挑選或者手動挑選結合的方式叉瘩。

操作流程

1. 多靶標抗體染色

2. 根據(jù)熒光抗體染色圖像挑選感興趣區(qū)域（Region of Interest, ROI）

3. 對每個 ROI 進行 UV 照射膳帕，切割下 Oligo

4. 毛細管吸取僅限于 ROI 的 Oligo, 全程與樣本無直接接觸

5. 吸取的 Oligo 轉移至 96 孔板中。

6. 步驟 3-5 會重復直至所有 ROI 的 Oligo 都收集完畢

7. 所有 ROI 中的 Oligo 分別收取完后薇缅，將在 NanoString 生物技術的 nCounter 上進行定量

*熒光抗體及靶標抗體在同一步驟染色危彩，無需重復加樣和染色

*步驟 4-6 為全自動操作，無需研究人員操作泳桦。

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數(shù)據(jù)分析

在 Oligo 定量結束后汤徽，研究人員可以在 GeoMx Digital Spatial Profiler 的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)上整合形態(tài)學圖像以及數(shù)字化定量的數(shù)據(jù)，把 ROI 在組織上的空間位置以及區(qū)域內所有靶標的表達水平相互關聯(lián)起來灸撰，以達到在單一操作界面上同時觀察空間定位谒府，細胞形態(tài)和靶標表達的相關性。

對于我們生物信息而言梧奢，還是用代碼處理

數(shù)據(jù)展示

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當然了狱掂，肯定會有很多個性化的分析點，值得我們深入研究亲轨。

我們看看文獻中的運用

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單細胞數(shù)據(jù)DSP的聯(lián)合分析趋惨，ROI區(qū)域的細胞組成

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最后看看在新冠中的運用

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由 SARS-CoV-2 病毒引發(fā)的惦蚊，其感染程度可以由無癥狀感染發(fā)展到重癥新冠肺炎甚至死亡器虾。導致新冠肺炎病人死亡的主要原因是急性肺損傷和急性呼吸綜合征，或者是多器官衰竭的直接并發(fā)癥蹦锋。然而到目前為止兆沙，對于 COVID-19 患者各器官的分子生物學和細胞生物學層面的了解還不太深入。

接下來莉掂，分享近期Nature 雜志在線報道的一篇來自由Broad Institute葛圃、Massachusetts General Hospital、Brigham and Women's Hospital憎妙、Beth Israel Deaconess Medical Center库正、Massachusetts Institute of Technology、Harvard Medical School等多家研究機構合作完成的題為 “ COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets ” 的文章厘唾。該研究綜合應用單細胞測序技術和DSP空間轉錄組技術全面構建了新冠患者的肺褥符、肝、腸等各個器官組織的單細胞圖譜以及空間圖譜抚垃，并分析了其基因表達特征喷楣。

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研究思路

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• 圖1：研究思路

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• 圖2：實驗及分析流程

主要研究結果

01

COVID-19患者肺的細胞圖譜

利用自動細胞類型識別工具趟大，作者在 COVID-19 患者的肺部組織單細胞（核）圖譜中注釋了28種細胞類群，包括實質細胞铣焊、內皮細胞和免疫細胞等逊朽。與正常肺部細胞組成相比，COVID-19 患者肺部的II型肺泡細胞（AT2）數(shù)量顯著減少曲伊，而樹突狀細胞惋耙、巨噬細胞、自然殺傷細胞熊昌、成纖維細胞以及內皮細胞數(shù)量都有所上升。COVID-19 患者的II型肺泡細胞中大量與宿主病原體反應相關的基因上調湿酸，而預防肺部纖維化的肺表面活性物質基因出現(xiàn)下調婿屹。新冠肺炎患者的肺細胞中存在更多的 PATS（Pre-alveolar type 1 transitional cell state）基因表達，且一部分PATS同時表達了KRT8 / CLDN4 / CDKN1A 和KRT5 / TP63 / KRT17 基因推溃，這些PATS細胞有可能是TP63+肺內基底樣組細胞（Intrapulmonary basal-like progenitor cells昂利，IPBLP），用于肺泡嚴重受損時的緊急細胞儲備铁坎》浼椋基于這些結果，作者提出了肺泡表皮細胞再生的模型：（1）健康肺泡中的II型肺泡細胞會自我再生并且能通過轉分化的過程轉化成I型肺泡細胞硬萍。（2）在 COVID-19 患者的肺泡中扩所，II型肺泡細胞的自我再生和向I型肺泡細胞的轉化均被抑制，導致PATS細胞的累積朴乖，在遠端呼吸道的 IPBLP 細胞開始向肺泡遷徙祖屏。

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• 圖3：COVID-19 患者肺部單細胞（核）圖譜

02

肺細胞中富集SARS-CoV-2病毒RNA

與之前的研究結果一致，研究者發(fā)現(xiàn)新冠病毒載量（Viral load）與患者出現(xiàn)癥狀到死亡的天數(shù)呈負相關买羞。在肺部的不同細胞類型中袁勺，髓細胞（Myeloid cells），特別是 CD14high CD16high 炎性單核細胞和 LDB2high OSMRhigh YAP1high巨噬細胞含有更多的 SARS-CoV-2 病毒RNA畜普。值得注意的是期丰，這些表達 SARS-CoV-2 病毒RNA的細胞并不同時表達 ACE2 ，TMPRSS2 等病毒進入因子吃挑。

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• 圖4：吞噬細胞和內皮細胞富集 SARS-CoV-2 病毒的RNA

03

COVID-19 患者肺部的空間圖譜

研究者采用 NanoString GeoMx 數(shù)字空間分析（Digital Spatial Profiling钝荡，DSP）技術構建了尸檢樣本肺部細胞的空間轉錄組學圖譜。結果顯示上皮細胞（PanCK⁺）區(qū)域中I型肺泡細胞和II型肺泡細胞占主導地位儒鹿。在非上皮細胞（PanCK^-）區(qū)域中化撕，新冠患者比非新冠患者（D22-D24）有更多的成纖維細胞和肌成纖維細胞。

比較 COVID-19 患者和非 COVID-19 患者肺部對應的AOIs區(qū)域约炎，發(fā)現(xiàn)在新冠患者肺部的interferon-α 和 γ 響應基因及氧化磷酸化相關基因表達顯著提升植阴，而 TNFα蟹瘾、IL2-STAT5 和TGF 信號通路、頂端交界和缺氧通路相關基因表達顯著下降掠手。

相同尸檢樣本中發(fā)炎和未發(fā)炎的 AOIs 比較憾朴，發(fā)現(xiàn)發(fā)炎 AOIs 區(qū)域中與先天免疫和發(fā)炎相關的基因表達量有顯著增加。相應地喷鸽，Claudins 和緊密連接通路相關基因表達下降众雷。

另外，對比 COVID-19 患者中 SARS-CoV-2 病毒含量高的 AOIs 區(qū)域與 SARS-CoV-2 病毒含量低的 AOIs 區(qū)域做祝，發(fā)現(xiàn)病毒基因ORF1ab砾省、S 基因被誘導，趨化因子基因（CXCL2 和CXCL3 ） 的表達量有顯著上升混槐。而值得注意的是，NT5C 基因的表達量在 SARS-CoV-2 高的 AOIs 區(qū)域中也有顯著提升狠鸳，目前還不清楚這個基因在肺損傷中的作用悯嗓，其具體作用需要進一步研究件舵。

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• 圖5：COVID-19 患者肺和正常肺，COVID-19 患者肺感染區(qū)和非感染區(qū)細胞組成和基因表達比較

04

COVID-19影響心臟脯厨，腎臟和肝臟的細胞組成

COVID-19 新冠肺炎尸檢樣本肝臟铅祸、心臟和腎臟的單細胞核圖譜中發(fā)現(xiàn)少量 SARS-CoV-2 病毒RNA，這可能和單細胞核RNA有關俄认，后續(xù)可以通過 NanoString DSP 和 RNAscope 驗證。比較 COVID-19 患者的心臟和正常心臟組織的單細胞核圖譜夜焦，研究者發(fā)現(xiàn) COVID-19 患者的心肌細胞和周細胞比例顯著降低岂贩，而血管內皮細胞比例顯著增加茫经。在心肌細胞、周細胞或成纖維細胞中的基因上調包括PLCG2 和AFDN萎津。周細胞卸伞、心肌細胞和成纖維細胞中锉屈，上調的通路包括氧化應激誘導的細胞凋亡通路荤傲、細胞粘附和免疫通路、細胞分化通路颈渊。

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• 圖6：COVID-19 患者心臟遂黍、肝臟腎臟單細胞（核）圖譜

結論

綜上所述终佛，在本研究中作者綜合單細胞測序技術及 DSP 空間轉錄組測序技術全面構建了 COVID-19 患者肺、腎雾家、肝和心臟組織的單細胞（核）圖譜以及肺的空間圖譜铃彰，并基于COVID-19 GWAS 找到了具體的細胞類型與新冠肺炎的遺傳風險之間的關聯(lián)，這些單細胞及空間圖譜為揭示新冠肺炎病毒導致人體器官衰竭以及最終死亡的病理提供了重要依據(jù)芯咧。

看來DSP空間轉錄組技術還是值得信賴的

生活很好牙捉，有你更好