我們在構建一些大的基因片段時艘狭，由于基因片段過大挎扰，會導致單純做PCR擴增時沒法擴增出全長來。因此需要對基因做分段巢音，PCR處理遵倦，這種情況有兩種常用方法，一種是純PCR官撼，另一種是分段PCR后連接梧躺。在這里主要介紹分段+酶切的方法。
一.分段PCR+酶切法
原理：酶切位點1-A片段-酶切位點2-B片段-酶切位點3-C片段-酶切位點4傲绣。
其中掠哥，“A片段-酶切位點2-B片段-酶切位點3-C片段”這一段是目的序列，
酶切位點1-和-酶切位點4是為了能和bacbone相連秃诵，而引入的兩個粘性末端续搀。
優(yōu)點：可操作性強
缺點：目的基因上的酶切位點必須與載體上的酶切位點的順序一致，不是所有的基因都適用
下面是具體操作
1.查看目的基因（insert）上已有的酶切位點
這里以答主做的AFAP1-AS1基因為例(主要是一開始直接PCR菠净，沒擴出來禁舷，郁悶)彪杉，用的軟件是snapgene，具體軟件的操作可另外搜尋牵咙。
AFAP1-AS1基因上的酶切位點
2.查看所用載體（backbone）的酶切位點
這里使用慢病毒載體plvx-puro
載體plvx-puro上的酶切位點
3.對兩者的位點做比對
需要注意順序派近，骨架上的酶切位點順序要和目的基因上酶切位點的順序一致!!!
這里按照載體backbone上的酶切位點順序進行比對。
XhoI：無
BstBl：無
EcoRI：在insert的881bp處
Apal：在insert的91bp處
BamHI：在insert的6658bp處
XbaI：無
在這次比對中洁桌，Apal這個位點的順序不對渴丸，因此不做考慮。
因此战坤，理論上來說曙强，可以分成（XhoI或BstBl）1-881（EcoRI）882-6658（BamHI）6657-6810（XbaI）。但是其中的最長片段依然達到了6kb左右途茫，做直接擴增那一片段依然有困難碟嘴，因此不做考慮。
