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標(biāo)題：秀麗隱桿線蟲全身的單細(xì)胞精度轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)圖譜
英文標(biāo)題：A full-body transcription factor expression atlas with completely resolved cell identities in C. elegans
一句話簡介：作者開發(fā)了一種自動注釋秀麗隱桿線蟲L1期幼蟲三維圖像堆棧中細(xì)胞類型的方法蒜鸡，并分析了每個細(xì)胞中620種轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)告基因表達(dá)袋哼。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-42677-6
背景：
（1）細(xì)胞分型依賴于細(xì)胞表型（如分子浑侥、形態(tài)潦嘶、功能、生理或者發(fā)育）志电，但細(xì)胞RNA測序采用無監(jiān)督或者M(jìn)arker 基因引導(dǎo)聚類講細(xì)胞組織成具有生物學(xué)意義的組正在改變我們對細(xì)胞類型的定義和看法驯鳖。基于分子特征定義的細(xì)胞類型的意義有賴于其轉(zhuǎn)錄程序和細(xì)胞表型相關(guān)性的建立和驗(yàn)證竭望。
（2）秀麗隱桿線蟲的表型已經(jīng)在單細(xì)胞分辨率下得到了很好的表征：包括整個發(fā)育過程中不變的細(xì)胞譜系、基于功能和形態(tài)的細(xì)胞類型的完整圖譜裕菠。然而通過轉(zhuǎn)錄譜準(zhǔn)確咬清、全面的確定全身單個細(xì)胞的身份是一項(xiàng)長期的挑戰(zhàn)。
（3）然而奴潘，從另一個角度出發(fā)旧烧，有望利用圖像分析工具和報(bào)告基因表達(dá)技術(shù)，開發(fā)出在3D圖像堆棧中準(zhǔn)確識別秀麗隱桿線蟲給定細(xì)胞類型和分析感興趣基因表達(dá)的方法萤彩。
因此粪滤，作者在這項(xiàng)工作中斧拍，開發(fā)了一種應(yīng)用拓?fù)浔Ａ羝ヅ淠Ｐ蛠碜詣幼⑨孡1期幼蟲3D圖像堆棧中所有558個細(xì)胞的方法雀扶，并使用圖像分析解析了620個轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)告基因表達(dá)。
結(jié)果
1. L1期幼蟲3D圖像棧中的自動細(xì)胞注釋
為了開發(fā)一種自動化注釋3D圖像中細(xì)胞類型的方法，作者首先收集了100張使用confocal 顯微鏡拍攝的L1期幼蟲DAPI染色的3D圖像（S1A）愚墓，并且手動注釋了每個圖像中所有細(xì)胞核的細(xì)胞身份作為訓(xùn)練集(S1B,C)予权。然后利用這些數(shù)據(jù)創(chuàng)建了一個最佳的數(shù)字模板。
然后浪册，他們開發(fā)了基于穩(wěn)健點(diǎn)匹配和分段仿射的細(xì)胞注釋(RAPCAT)扫腺，自動將新3D圖像中的558個細(xì)胞與最佳數(shù)字模板進(jìn)行匹配，并完成細(xì)胞類型注釋和注釋度打分村象。在手動整理標(biāo)記細(xì)胞之后笆环，RAPCAT 重新分配細(xì)胞身份的平均準(zhǔn)確率是 97%。
總之厚者，作者開發(fā)了RAPCAT工具躁劣，可以高精度，自動注釋L1期幼蟲3D圖像棧中所有細(xì)胞的身份库菲。
- Fig 1. RAPCAT算法自動進(jìn)行細(xì)胞注釋
2. 具有單細(xì)胞分辨率的原位TF表達(dá)譜
作者獲得了涵蓋秀麗隱桿線蟲657個轉(zhuǎn)錄因子的熒光蛋白報(bào)告株（234來自饋贈 + 452 自行構(gòu)建）账忘，其中620個TF的報(bào)告基因在剛孵化的L1幼蟲中表現(xiàn)出了可檢測的熒光活性。這些報(bào)告基因株采用不同的技術(shù)構(gòu)建熙宇，包括864個由微粒轟擊法產(chǎn)生的品系鳖擒，14個由mos1介導(dǎo)的單拷貝整合法產(chǎn)生的品系，以及41個fosmid轉(zhuǎn)基因TF融合蛋白報(bào)告株和23個Cas9介導(dǎo)的TF敲入株烫止。這些品系通過DAPI染色和共聚焦掃描蒋荚，共生成了1055個3D圖像，他們結(jié)合手動注釋和RAPCAT注釋了所有圖像中的細(xì)胞馆蠕。然后使用VANO 軟件生成了每個圖像中報(bào)告基因的表達(dá)信號數(shù)據(jù)圆裕，最后整合生成所有 558個細(xì)胞中每個TF的表達(dá)譜（Fig2A）(對于有多個類型報(bào)告基因株的TF，則選擇忠實(shí)度更高的報(bào)告基因類型)荆几。
- Fig 2. 單細(xì)胞分辨率的全身TF表達(dá)譜
作者接下來比較了相同品系和不同品系間報(bào)告基因表達(dá)的相關(guān)性吓妆，發(fā)現(xiàn)同一品系間報(bào)告基因的表達(dá)模式是高度正相關(guān)的，R>0.81,說明細(xì)胞核注釋準(zhǔn)確吨铸，并且報(bào)告基因表達(dá)是可重復(fù)的行拢。然而，不同品系間同一TF的報(bào)告基因表達(dá)的相關(guān)性要略低于品系內(nèi)的相關(guān)性诞吱，說明不同線蟲品系之間轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的差異可能導(dǎo)致基因表達(dá)模式的差異（Fig 2B）舟奠。由于啟動子融合報(bào)告基因可能并不總是能完全重現(xiàn)其相應(yīng)基因的表達(dá)模式，因此作者通過與此前發(fā)表的成蟲數(shù)據(jù)中共有的84個TF的表達(dá)譜進(jìn)行比較房维，來分析它們的影響程度沼瘫。這些數(shù)據(jù)中包括了58個啟動子融合報(bào)告基因、22個基于fosmid的報(bào)告基因和4個敲入報(bào)告基因咙俩，其中fosmid和敲入報(bào)告基因作為黃金標(biāo)準(zhǔn)耿戚。
然后他們將靶基因分為四類：（1）上游基因間序列>7kb, 上游基因間序列 < 1kb, 含有 > 1kb 內(nèi)含子基因和所有其他基因（無明顯長度特征湿故，但被認(rèn)為包含驅(qū)動其表達(dá)所需的必要和充分的調(diào)控元件，稱為高上下文啟動子報(bào)告基因）膜蛔。 分析結(jié)果顯示：高上下文啟動子報(bào)告基因的表達(dá)與成蟲TF譜中的表達(dá)具有很強(qiáng)的相關(guān)性（ROCAUC=0.92）坛猪，類似于金標(biāo)準(zhǔn)fosmid/knock in 報(bào)告基因與成蟲TF譜之間觀察到的相關(guān)性(Fig 2C)。在他們整個的研究中皂股，296個TF是高上下文啟動子報(bào)告基因墅茉，263個TF為與成蟲TF譜相關(guān)性較弱的低語境啟動子報(bào)告基因。
接下來作者他們將報(bào)告基因表達(dá)譜與之前發(fā)表的晚期胚胎和L2幼蟲的scRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比較呜呐，表明胚胎scRNA-seq譜與新孵化的L1期幼蟲的報(bào)告基因表達(dá)譜的相關(guān)性高于與L2期幼蟲scRNA-seq譜的相關(guān)性（Fig2D）就斤。在他們的報(bào)告基因篩選中，發(fā)現(xiàn)了16個在體壁肌束前后方向呈現(xiàn)差異表達(dá)的TF, 其中75%(12個) 在scRNA-seq數(shù)據(jù)中也顯示出前后表達(dá)模式蘑辑，兩者保持一致(Fig2E-H)战转。這些結(jié)果說明原位報(bào)告基因表達(dá)譜與相鄰發(fā)育階段的scRNA-seq數(shù)據(jù)非常匹配，但細(xì)胞身份完全確定以躯。-- 疑問：為什么不進(jìn)行相應(yīng)的 L1期幼蟲的scRNA-seq 來比較與原位報(bào)告表達(dá)的異同 ?
3. 細(xì)胞分類中的表型與TF分析
為了進(jìn)一步分析細(xì)胞表型分類和TF之間的關(guān)系槐秧，作者通過將上一部分獲得的轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告基因表達(dá)譜對556個體細(xì)胞進(jìn)行了層次聚類，并將聚類結(jié)果與基于表型的細(xì)胞分類結(jié)果進(jìn)行了比較（Fig3）忧设。
- Fig3. 根據(jù)報(bào)告基因表達(dá)對556個體細(xì)胞進(jìn)行層次聚類
- 上圖從內(nèi)往外總共分為五層刁标，最內(nèi)圈是TF表達(dá)譜的層次聚類樹狀圖，往外又可以分為兩部分址晕，第二三層代表基于表型粗的細(xì)胞類型分類注釋膀懈，第四五層代表精細(xì)的細(xì)胞類型分類注釋。
如果基于分子的聚類可以完全區(qū)分不同表型的細(xì)胞類型谨垃，那么不同表型的細(xì)胞類型應(yīng)該是在聚類圖中呈現(xiàn)單獨(dú)的進(jìn)化枝启搂。然而結(jié)果顯示，在144種精細(xì)表型細(xì)胞類型中刘陶，有76%是分布為單個進(jìn)化枝胳赌，F(xiàn)ig3 圖中最外圈標(biāo)注出了這些細(xì)胞類型，這說明表型和分子模式之間是存在高度一致性的匙隔。同時疑苫，我們在第四層可以看到同一進(jìn)化枝中包含多種表型細(xì)胞類型的情況存在，這也說明基于表型的分類與分子聚類之間存在差異纷责。
為了研究轉(zhuǎn)錄分化細(xì)胞如何共享相似的表型捍掺，作者他們在多進(jìn)化枝細(xì)胞類型中進(jìn)行了分子亞型分析，他們使用TF表達(dá)譜計(jì)算不同亞型之間的JSD值再膳，以量化它們之間的轉(zhuǎn)錄差異挺勿。結(jié)果顯示，神經(jīng)元喂柒，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不瓶、皮下組織禾嫉、咽肌和神經(jīng)母細(xì)胞中JSD評分最高，即轉(zhuǎn)錄差異較大湃番。
4. 神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型表達(dá)不同數(shù)量的TF
為了對不同細(xì)胞類型的TF表達(dá)進(jìn)行更深入的研究，作者首先對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了亞型分析吭露。首先吠撮，他們發(fā)現(xiàn)在整個細(xì)胞聚類樹中，在排除HSN讲竿，頭感器和尾感器神經(jīng)元之后泥兰，所有的的神經(jīng)元形成一個總體的神經(jīng)元亞型（Fig 4A)，同樣题禀，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也是除頭感器和尾感器神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以外鞋诗，能夠分為總體神經(jīng)膠質(zhì)亞型(Fig 4B)。
作者分析了這幾類神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中TF的表達(dá)情況迈嘹，發(fā)現(xiàn)感受器類神經(jīng)元中表達(dá)的TF數(shù)目顯著多于其他神經(jīng)元削彬，而且頭感器和尾感器中鞘細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目也遠(yuǎn)比其他部位的鞘細(xì)胞中的多（Fig 4C）。并且之前發(fā)表的胚胎期和L2期的scRNA-seq數(shù)據(jù)也支持這一觀察現(xiàn)象秀仲，即在頭感器和尾感器中表達(dá)的TF明顯多于其他神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的TF融痛。而在另一種HSN(雌雄同體特異性神經(jīng)元）中，作者發(fā)現(xiàn)在所有分析的TF中神僵，有86%的TF在HSN中的表達(dá)都處于最低水平（Z2/3為生殖細(xì)胞雁刷，存在轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象）。他們提出一種可能的解釋是：HSN靜止?fàn)顟B(tài)特有的TF廣泛下調(diào)保礼。
為此沛励，他們挑選一些在成蟲期HSN和鄰近細(xì)胞中表達(dá)量相近的TF來進(jìn)行研究，并詳細(xì)分析了兩個報(bào)告基因sage-2和sma-9 在不同蟲期的表達(dá)情況炮障。在L1期幼蟲的DAPI染色圖中（Fig 4G,4H）可以看到目派，這兩個報(bào)告基因在HSN中的表達(dá)明顯弱于鄰近細(xì)胞PHB中的表達(dá)。從表達(dá)量時期變化圖中（Fig 4I）可以看到HSN中的TF的表達(dá)抑制現(xiàn)象從胚胎分化后持續(xù)到L2
5. TF 表達(dá)譜與形態(tài)學(xué)之間的一致性
在前期基于TF表達(dá)譜的聚類分析中胁赢，作者確定了四種神經(jīng)母細(xì)胞亞型址貌，即K, G1/G2/W, V5/Q/T和K(Fig 5A)。盡管在進(jìn)化枝上徘键，這些細(xì)胞亞型的鄰近位置是不同的細(xì)胞類型练对，但它們具有非常相似的形態(tài)。例如吹害，L1期幼蟲的神經(jīng)母細(xì)胞具有各種上皮細(xì)胞形態(tài)螟凭，盡管它們在發(fā)育過程中增殖產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞子代。另外它呀，JSD距離分?jǐn)?shù)熱圖顯示（Fig 5B）,K和G1/G2/W型神經(jīng)母細(xì)胞基因表達(dá)差異最小螺男，這也與它們相似的上皮形態(tài)相一致棒厘。
因此，作者推測亞型內(nèi)的分子異質(zhì)性可能有助于不同神經(jīng)母細(xì)胞亞型間相似的TF調(diào)控程序的發(fā)現(xiàn)下隧。
作者通過計(jì)算四種神經(jīng)母細(xì)胞之間的標(biāo)準(zhǔn)化JSD得分奢人，發(fā)現(xiàn)在P和G1/G2/W神經(jīng)母細(xì)胞之間具有最小的標(biāo)準(zhǔn)化JSD得分（Fig 5C）。為了分析G1/G2/W和P神經(jīng)母細(xì)胞之間是否存在共享的TF調(diào)控程序淆院，作者分析了已知的四種P神經(jīng)母細(xì)胞調(diào)節(jié)子中的三種在G2/W神經(jīng)母細(xì)胞中表達(dá)的TF（ref-2何乎、vab-15和tlp-1）的功能。在ref-2 敲低的線蟲中土辩，G2（Fig 5E,L）和W神經(jīng)母細(xì)胞(Fig 5H,M)產(chǎn)生的后代都比野生型少支救。然而，在tlp無效突變株中沒有在G2(Fig 5I)和W(Fig 5L,M)中觀察到明顯的表型拷淘。當(dāng)敲低vab-15時各墨，ref2在G2中顯著下調(diào)但是在W幾乎不變。然而启涯，在tlp-1 無效突變中敲低vab-15,會導(dǎo)致W細(xì)胞中ref-2的顯著下調(diào)贬堵。但是vab-15和 tlp-1之間的協(xié)同作用沒有在G2中被觀察到。
總之结洼，這部分結(jié)果顯示基于TF分類的G2/W和P神經(jīng)母細(xì)胞亞型之間共享TF（ref2扁瓢，vab15和tlp-1）轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序。
6. 胚胎后TF與胚胎譜系表達(dá)的相關(guān)性
由于作者在前面的分析中發(fā)現(xiàn)TF表達(dá)在不同細(xì)胞表型的亞型之間可能存在顯著差異补君，因此他們接下來研究了表型同質(zhì)細(xì)胞類中TF表達(dá)的變化引几。在Fig 3的TF聚類圖中，作者發(fā)現(xiàn) 47%的簇僅與一種表型細(xì)胞部分重疊挽铁，因此可以被指定為TF定義的亞類伟桅。因此作者進(jìn)一步分析了在表型細(xì)胞類別中，亞類本身和亞類之間的胚胎細(xì)胞譜系距離叽掘，結(jié)果顯示亞類內(nèi)的胚胎細(xì)胞譜系距離明顯短于亞類之間的胚胎細(xì)胞譜系距離楣铁。
- Fig 6. 細(xì)胞譜系與胚胎后TF表達(dá)模式的關(guān)聯(lián)
由于密切相關(guān)譜系中的細(xì)胞，通常占據(jù)相同或者相近的位置更扁，空間表達(dá)模式可能會影響譜系判定盖腕。因此，作者重點(diǎn)研究了TF表達(dá)變化與任何空間模式均不一致的細(xì)胞浓镜，例如腹側(cè)體壁肌束溃列，其中插入了MS衍生和C-/D衍生的細(xì)胞，并檢測到了18種譜系依賴性TF（Fig 6B）膛薛。其中有兩個（hmg-11和unc-130）即使在幼蟲發(fā)育完成后仍在前體壁肌肉中保留其譜系依賴性表達(dá)模式听隐。
在L1階段，有159個雙邊細(xì)胞對可以觀察到相同的形態(tài)和功能哄啄，并且這159個細(xì)胞對中有97個在細(xì)胞譜系上是對稱的雅任，而另外62對是聚合細(xì)胞對风范，它們的左右的細(xì)胞配偶具有不對稱的細(xì)胞譜系歷史。
在L1階段的TF 譜中沪么，不對稱TF表達(dá)明顯比來自對稱譜系的TF表達(dá)豐富硼婿。在成蟲中，大多數(shù)TF都失去了表達(dá)不對稱性禽车，盡管如此寇漫，三種TF(nhr-67, ceh-27和ref-1) 保留了它們的表達(dá)不對稱性】薜保總之猪腕，這些數(shù)據(jù)支持了胚胎細(xì)胞譜系對胚胎后基因表達(dá)的顯著影響冗澈，而且這種譜系依賴性可能在整個胚胎后生命中持續(xù)存在钦勘。
7. 趨同進(jìn)化中的譜系特異性TF
在整個報(bào)告基因譜中，腸道肌肉細(xì)胞具有數(shù)量最多的不對稱TF（Fig 6D）亚亲。其中Six/SO 家族同源框TF unc-39 呈現(xiàn)典型的譜系特異性表達(dá)模式彻采，并在MS.(a/p)pa的所有胚胎子代細(xì)胞的L1階段表達(dá)，包括五種細(xì)胞類型捌归。其中兩種細(xì)胞類型（M成肌細(xì)胞和體腔細(xì)胞）僅由MS.(a/p)pa譜系產(chǎn)生肛响，另外三種ent.m，BWM惜索，GLR是融合細(xì)胞特笋。其中M成肌細(xì)胞和體腔細(xì)胞均表達(dá)unc-39，在融合細(xì)胞中巾兆，如ent.m（綠色猎物，它有多個來源MS,ABplp,ABprp），這些ent.m細(xì)胞中只有MS譜系來源的子代細(xì)胞表達(dá)unc-39. 同樣b.w.m（藍(lán)色）中只有部分MS來源的細(xì)胞才表達(dá)unc-39（Fig 6F）角塑。
為了進(jìn)一步研究unc-39在肌肉類型趨同分化中的作用蔫磨，作者構(gòu)建了unc-39（gk798）突變體，前面提到腸道肌肉細(xì)胞來源于兩個譜系圃伶，即MS.lineage和AB.lineage堤如，當(dāng)unc-39突變后，作者發(fā)現(xiàn)L側(cè)ABlinage來源的imL/AB.plpppppaa細(xì)胞仍然表達(dá)marker基因arg-1和非橫紋肌特異基因msl-1, 而R側(cè)MS來源的imR/MS.ppaapp則不表達(dá)這些基因(Fig 7A,B)窒朋。由此可見搀罢，unc-39是一種譜系特異性TF，參與腸道肌肉類別的趨同分化侥猩。
接下來魄揉，作者開始尋找調(diào)節(jié)左側(cè) imL/AB.plpppppaa細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，他們關(guān)注到了一個在左側(cè)imL/AB.plpppppa 腸道肌肉細(xì)胞中表達(dá)明顯強(qiáng)于imR/MS細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子 hnd-1(Fig 6G,H),這種不對稱表達(dá)可以一直持續(xù)到2天期成蟲拭宁。接著洛退，他們就構(gòu)建了hnd-1突變株來探究hnd-1基因的功能瓣俯，在突變株中，腸道肌肉仍然表達(dá)marker基因Arg-1,但是L側(cè)細(xì)胞的形態(tài)是異常的（Fig 7D,E）兵怯。為了進(jìn)一步研究彩匕，hnd-1在胚胎后的作用，他們生成了一個hnd-1體細(xì)胞敲除株媒区，其中Cas9由熱休克啟動子驅(qū)動驼仪，當(dāng)熱休克條件刺激時會激活Cas-9啟動子從而條件敲除hnd-1基因。他們首先在剛孵化的L1期幼蟲進(jìn)行了熱休克處理袜漩，發(fā)現(xiàn)imL/AB.plpppppaa細(xì)胞的指狀突起明顯少于imR/MS.ppaapp（Fig 7F,J）绪爸。同樣在成蟲中，條件敲除hnd-1基因時宙攻，也可以觀察到imL/AB.plpppppaa細(xì)胞的形態(tài)異常（Fig 7G,J）奠货。
總之，上述結(jié)果表明譜系依賴性轉(zhuǎn)錄因子TF, unc-39和hnd-1 以鏡像模式表達(dá)座掘，并在腸道肌肉融合中發(fā)揮不對稱作用递惋。并且hnd-1的不對稱表達(dá)和作用在幼蟲發(fā)育結(jié)束后仍然存在。
討論與總結(jié)
（1）開發(fā)了RAPCAT算法溢陪，可以自動注釋L1幼蟲3D圖像中的所有細(xì)胞身份萍虽；
（2）構(gòu)建了多個TF的報(bào)告基因株，并分析和量化了單細(xì)胞分辨率下TF的原位表達(dá)形真；
（3）使用TF譜重新對表型類型進(jìn)行了分類杉编，并根據(jù)TF表達(dá)變化的將異質(zhì)分子簇的表型細(xì)胞類型進(jìn)一步劃分為亞型。
（4）通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了譜系發(fā)育中的TF協(xié)同調(diào)控程序咆霜，以及在不同譜系細(xì)胞融合為相同表型細(xì)胞過程中邓馒，多個譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子不對稱作用，加深了我們對細(xì)胞分化和分型的理解裕便。
