01.什么是基因融合
基因融合是指兩個基因的部分或全部序列相互融合為一個新的基因的過程。一定比例的融合基因會被轉(zhuǎn)錄成嵌合融合轉(zhuǎn)錄物载慈，這些嵌合融合轉(zhuǎn)錄物可以通過保留其親本基因的閱讀框架形成融合蛋白，可以影響親本基因表達或作為長的非編碼嵌合RNA發(fā)揮作用珍手。
一般來說办铡，基因融合是指基因組層面的融合辞做。但轉(zhuǎn)錄組層面也可能發(fā)生融合，主要是由于兩個不同基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA寡具，由于某種原因融合在了一起秤茅，形成新的融合RNA，該RNA可能編碼蛋白童叠，也可能為非編碼框喳。而基因組層面產(chǎn)生的融合基因，根據(jù)融合的情況厦坛，可能表達五垮，也可能不表達（如破壞了啟動子區(qū)域或其他原因）。
▲融合基因示意圖
02.融合基因的產(chǎn)生機制
由于染色體層的重排或轉(zhuǎn)錄過程中的錯誤剪接所造成的杜秸。在DNA層面上的重排主要包括了6種形式:
1.染色體內(nèi)的易位和染色體間的易位放仗；
2. 大片段的插入；
3. 大片段缺失撬碟；
4. 串聯(lián)重復诞挨；
5.倒置；
6. 染色體碎裂導致的復雜重排呢蛤。
▲DNA層面上的重排形式
在RNA層面上亭姥，轉(zhuǎn)錄過程中的“通讀事件”也可能產(chǎn)生融合蛋白。當RNA聚合酶不能正確終止一個基因末端的轉(zhuǎn)錄顾稀，并且由于異常剪接而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄到下一個基因末端時，產(chǎn)生了嵌合轉(zhuǎn)錄子稱之為“通讀事件”坝撑，并不涉及基因組物質(zhì)的重排(DNA重排)即可產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄子静秆。
▲轉(zhuǎn)錄過程中的“通讀事件”
03.融合基因常見檢測方法
FISH
通過熒光標記的探針與細胞核內(nèi)的DNA 靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析基因擴增或融合變異的一種分子檢測技術巡李，一般被認為是檢測基因擴增和融合的“金標準”抚笔，但也存在一定的局限性。如并非所有檢測到的融合均會產(chǎn)生可表達的融合RNA侨拦，分離探針可能會遺漏較小的染色體內(nèi)重排導致假陰性結果殊橙，無法確定和區(qū)分不同的融合基因變異亞型等。
IHC
利用抗原抗體反應和化學顯色原理狱从，檢測組織或細胞學切片中特定蛋白表達的技術膨蛮。IHC檢測靈敏度高、成本低季研、檢測時間短敞葛、易于自動化，但其準確性取決于檢測的融合蛋白是否有經(jīng)過驗證的抗體与涡，如Ventana?D5F3 IHC檢測肺腺癌患者ALK 融合的準確性高惹谐，而 ROS1和NTRK陽性IHC結果尚需其他檢測方法驗證持偏。
RT-PCR
在RNA水平檢測融合RNA，靈敏度高氨肌、檢測時間短鸿秆，但僅限于檢測引物設計范圍內(nèi)的已知融合，無法檢出未知融合怎囚。此外卿叽，該方法檢測結果的準確性高度依賴標本RNA的質(zhì)量。
靶向二代測序
通過大規(guī)模平行測序的方法桩了，對引物或探針設計范圍內(nèi)的區(qū)域同時進行多個融合基因檢測附帽。根據(jù)核酸投入物的不同，靶向二代測序可在DNA或RNA水平檢測基因融合井誉。
根據(jù)中心法則蕉扮，以DNA為模板通過轉(zhuǎn)錄和剪接加工產(chǎn)生成熟的RNA。在DNA水平上颗圣，融合斷點位置通常發(fā)生在較長的內(nèi)含子區(qū)域喳钟，且融合的斷裂點不同患者可能不同，故用傳統(tǒng)的PCR直接擴增斷裂點是不易實現(xiàn)的在岂，采用NGS的方法設計探針去抓取斷裂點是一種可行的檢測方法奔则，但從DNA水平檢測融合基因不可避免存在如下局限性和挑戰(zhàn)：
1.融合基因的斷點一般在內(nèi)含子區(qū)域，而融合基因的內(nèi)含子又特別冗長蔽午，因此易茬，如果基于DNA-based的檢測方法就要在內(nèi)含子區(qū)域鋪設大量的探針，探針設計難度大及老。
2.大量探針也會導致下機數(shù)據(jù)量過大（增加實驗成本抽莱，加大生信分析難度）。
3.大量探針仍會存在覆蓋盲點骄恶，導致融合漏檢食铐。
4.DNA層面出現(xiàn)融合不一定能轉(zhuǎn)錄成mRNA進而翻譯成蛋白質(zhì)，進而不能激活下游MAPK/mTOR通路僧鲁，而RNA則相對更接近翻譯成為蛋白質(zhì)虐呻。
相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現(xiàn)為前后兩個基因外顯子之間的銜接寞秃，融合點相對固定斟叼。這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢。因此春寿，根據(jù)融合基因序列特點犁柜，在RNA水平上檢測融合基因比DNA水平更易實現(xiàn)。
▲融合基因常見的檢測方法
04.融合基因檢測：DNA vs RNA
DNA-based NGS
原理：對可能發(fā)生融合的區(qū)域設計探針進行覆蓋堂淡，雜交捕獲得到目的片段進行測序分析馋缅。
通過雜交捕獲建庫扒腕，僅使用DNA就可同時對多個腫瘤相關基因的突變、擴增萤悴、融合及腫瘤突變負荷（TMB）瘾腰、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)進行檢測，極大地節(jié)約了標本量覆履，并且能夠在DNA水平確定基因融合的斷點位置和融合伴侶蹋盆，檢出已知和未知的基因融合。DNA-based NGS測序是基于腫瘤細胞來源的DNA分子進行檢測硝全。DNA分子由螺旋的雙鏈組成栖雾，相對于RNA更加穩(wěn)定货抄。因此村怪，DNA-based NGS的組織學/細胞學樣本，包括新鮮組織绵患、FFPE凳厢、胸水等账胧，均可滿足檢測質(zhì)控要求。在組織樣本難以獲取或樣本量不足時先紫，還可以通過液體活檢提取ctDNA進行測序治泥，而這是RNA-based NGS無法實現(xiàn)的。但是遮精，DNA二代測序檢測基因融合受腫瘤細胞含量居夹、標本DNA質(zhì)量、捕獲探針覆蓋度及DNA層面復雜基因變異等影響本冲，可能會出現(xiàn)漏檢准脂。另外，隨著DNA二代測序在臨床分子檢測中的廣泛應用眼俊，越來越多攜帶罕見伴侶的激酶融合被發(fā)現(xiàn)，但某些罕見融合并不能產(chǎn)生有功能的融合RNA/蛋白粟关。
RNA-based NGS
RNA二代測序可以通過多重PCR擴增疮胖、錨定多重PCR或雜交捕獲建庫在RNA水平檢測融合轉(zhuǎn)錄本。與DNA二代測序需要對外顯子和內(nèi)含子區(qū)均進行探針捕獲相比闷板，RNA測序僅需要針對外顯子區(qū)設計引物或探針澎灸，相對簡單、經(jīng)濟遮晚，不受DNA層面復雜融合的影響县遣，且RNA二代測序能直接真實地反映轉(zhuǎn)錄水平融合的表達情況及融合伴侶基因類型其兴。
但是元旬，RNA-based NGS檢測樣本要求相對較高。從樣本質(zhì)量上講坑资，由于存在核糖核酸酶且RNA是單鏈結構穆端，非常容易降解徙赢，因此狡赐，新鮮組織是做RNA-based NGS檢測的首選枕屉。有研究表明，高達50%的存檔FFPE樣本哨颂，特別是較舊的樣本喷市，不能滿足RNA建庫和測序的要求，可能無法通過測序前的質(zhì)量控制。目前尚不推薦從液體活檢樣本中提取RNA進行腫瘤融合基因檢測，這也限制了RNA-based NGS檢測的應用漂羊。
紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心（MSKCC）的一項真實世界肺腺癌大隊列研究和一項中國人群的研究中均通過RNA-based NGS在DNA NGS檢測陰性的非小細胞肺癌樣本中檢出了10%左右的靶點基因融合或MET跳突艾猜，相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現(xiàn)為前后兩個基因外顯子之間的銜接低淡，不受內(nèi)含子的影響蔗蹋，融合點相對固定妥衣，這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢芦倒，也是RNA-based NGS比DNA-based NGS檢測融合基因更具優(yōu)勢的原因之一麻裳。
▲紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心研究
▲中國人群研究
▲NGS檢測基因融合對比
05.總結
相比DNA-based NGS，RNA-based NGS不受內(nèi)含子影響周霉，可提升融合基因的檢出率掂器。融合基因DNA和RNA水平上的結構特征決定了融合基因檢測亚皂，RNA水平遠比DNA水平更敏感俱箱，更準確，但是樣本要求較高灭必。
DNA-based NGS對樣本要求相對較低狞谱，可聯(lián)合其他biomarker共同檢測乃摹，同時DNA層面可檢出的罕見融合伴侶、外顯子斷點融合及基因間融合跟衅，但需在RNA或蛋白水平進一步驗證孵睬。
在臨床應用中，全面準確地腫瘤靶基因檢測需要臨床實踐經(jīng)驗的積累以及不斷的總結驗證伶跷￡粒基于檢測方法學的局限性和檢測標本的復雜性，多平臺聯(lián)合應用或補充有益于腫瘤患者的精準診治叭莫。
參考文獻
[1]Oncotarget.?2019 Mar 12;10(21):2095-2111.
[2]Genome Biol.?2020 Jul 6;21(1):166.
[3]Comput Math Methods Med.?2015:2015:912742
[4]DOI：10.3760/cma.j.cn112151-20221111-00946
[5]Noncoding RNA.?2021 Feb 4;7(1):10
[6]https://doi.org/10.1200/JCO.2024.42.16_suppl.e2004
[7]Clin Cancer Res.?2019 Aug 1;25(15):4712-4722
[8]J Thorac Oncol. 2021 Mar;16(3):404-418.
[9 ]DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2023.102.43
聲明：本文僅用于分享蹈集，如涉及版權等問題，請盡快聯(lián)系我們雇初，我們第一時間更正拢肆，謝謝！
