前言
細(xì)胞的行為和功能受其周圍微環(huán)境和信號(hào)的影響隧饼，探究細(xì)胞如何根據(jù)其局部信號(hào)環(huán)境中的變化來調(diào)整自身狀態(tài)，以及它們?nèi)绾螀f(xié)同組織成不同的多細(xì)胞群體企巢，對(duì)于深入理解生物學(xué)中的各種關(guān)鍵過程（如發(fā)育漩氨、衰老和癌癥）是至關(guān)重要的膛腐。研究者經(jīng)常利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索這些細(xì)胞狀態(tài)，但相比之下执解，Bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)因其價(jià)格便宜寞肖、樣本量大及深度測(cè)序等優(yōu)勢(shì)，蘊(yùn)含著大量寶貴的信息衰腌。
因此新蟆，我們今天便介紹一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的工具--EcoTyper，能夠從Bulk右蕊、單細(xì)胞琼稻、以及空間分辨率的基因表達(dá)數(shù)據(jù)中大規(guī)模地識(shí)別并驗(yàn)證細(xì)胞狀態(tài)和多細(xì)胞群體。作者將EcoTyper應(yīng)用于16種人類癌癥的12個(gè)主要細(xì)胞系驗(yàn)證了工具的有效性饶囚。過去的研究已經(jīng)為我們揭示了腫瘤中的不同表型帕翻，例如與T細(xì)胞的反應(yīng)相關(guān)的“熱”（T細(xì)胞炎癥的）腫瘤和“冷”（T細(xì)胞耗盡的）腫瘤。這種分類在一定程度上解析了疾病特征萝风，包括對(duì)ICI的反應(yīng)熊咽，但過于簡(jiǎn)化了腫瘤微環(huán)境（TME）中的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)。而EcoTyper克服了這一局限闹丐，為我們解析腫瘤的異質(zhì)性提供了更為全面的信息横殴。具體來講，EcoTyper成功地識(shí)別了16種人類癌癥的69種通過轉(zhuǎn)錄定義的細(xì)胞狀態(tài)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了10種與預(yù)后相關(guān)且具有強(qiáng)烈保守性的多細(xì)胞群體衫仑±嬗耄總的來說，EcoTyper為我們解析任何組織中的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)提供了一個(gè)全新的文狱、大規(guī)模的分析框架粥鞋。
那么接下來，讓我們一起來學(xué)習(xí)一下這項(xiàng)研究吧（ps：后續(xù)會(huì)和大家一起學(xué)習(xí)EcoTyper的代碼實(shí)操哦）瞄崇。
主要內(nèi)容
1. EcoTyper分析框架
EcoTyper的框架包括三個(gè)主要步驟呻粹。第一步是基于CIBERSORTx分離和識(shí)別Bulk組織樣本中特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)特征。第二步是采用統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)算法苏研，包括無監(jiān)督方法和有監(jiān)督非負(fù)矩陣分解（NMF）的變體等浊，來識(shí)別特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄程序（“細(xì)胞狀態(tài)”），量化它們?cè)诿總€(gè)樣本中的相對(duì)豐度摹蘑，并在外部表達(dá)數(shù)據(jù)集中“恢復(fù)”它們筹燕。第三步是將這些狀態(tài)組合成多細(xì)胞群體，多細(xì)胞群體可以理解為在多個(gè)樣本中共同出現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)衅鹿。
值得一提的是EcoTyper能夠在不同的數(shù)據(jù)集和平臺(tái)上分析細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)構(gòu)撒踪。利用EcoTyper，我們還可以進(jìn)行詳細(xì)的表型分析和生物標(biāo)志物的探索大渤；利用已知的配體-受體配對(duì)深入探索細(xì)胞間的通信機(jī)制制妄；在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析多細(xì)胞群體的結(jié)構(gòu)和功能等。
2. 鑒定16種癌癥的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞狀態(tài)圖譜
為驗(yàn)證EcoTyper的準(zhǔn)確性泵三，作者首先將其應(yīng)用于500個(gè)模擬的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）腫瘤（Bulk）忍捡，這些腫瘤是基于單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)構(gòu)建的。測(cè)試結(jié)果十分出色切黔，其中砸脊，細(xì)胞狀態(tài)的識(shí)別敏感性為0.92，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.86纬霞，而且它在數(shù)量預(yù)測(cè)方面也表現(xiàn)良好凌埂，達(dá)到了0.93的Pearson r值（基于真實(shí)和預(yù)測(cè)比例之間的中位數(shù)計(jì)算Pearson相關(guān)性）。值得注意的是诗芜，EcoTyper不僅可以準(zhǔn)確檢測(cè)到豐度低至0.5%的細(xì)胞狀態(tài)瞳抓，還能區(qū)分那些豐度上相關(guān)的不同細(xì)胞狀態(tài)（r≤0.6）。
作者首先選用了TCGA的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集（16種癌癥類型）伏恐，數(shù)據(jù)包括5946個(gè)腫瘤樣本和529個(gè)正常樣本孩哑。基于CIBERSORTx翠桦，作者從這些數(shù)據(jù)中得到了一個(gè)12 * 6475的矩陣横蜒。進(jìn)一步胳蛮，利用EcoTyper工具，從中識(shí)別出了71種離散的細(xì)胞狀態(tài)丛晌，每種細(xì)胞類型具有3-9種不同的狀態(tài)仅炊。這些細(xì)胞狀態(tài)大部分在多種癌癥類型中出現(xiàn)，并在惡性組織顯著富集澎蛛。但同時(shí)砾省，也觀察到一些特定的細(xì)胞狀態(tài)是組織特異的杆煞。例如体捏，腫瘤組織與其相鄰的正常組織染苛，或者腺癌與鱗狀細(xì)胞癌之間，都存在一些獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序或細(xì)胞狀態(tài)毁兆，這些狀態(tài)可以被用作區(qū)分它們的標(biāo)志浙滤。
值得一提的是，EcoTyper不僅可以識(shí)別細(xì)胞狀態(tài)荧恍，還可以將從一個(gè)數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)到的細(xì)胞狀態(tài)注釋到另一個(gè)數(shù)據(jù)集中（有監(jiān)督的方法）瓷叫。因此屯吊，作者使用了單細(xì)胞數(shù)據(jù)（包括乳腺癌送巡、結(jié)直腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌盒卸、非小細(xì)胞肺癌等共7套數(shù)據(jù)）評(píng)估EcoTyper識(shí)別的71種細(xì)胞狀態(tài)的準(zhǔn)確性骗爆，結(jié)果顯示，94%的細(xì)胞狀態(tài)（67/71）在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中可以被顯著恢復(fù)蔽介。此外摘投，作者還發(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記基因是十分穩(wěn)定的，留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果為90%虹蓄。后續(xù)的分析中犀呼，作者排除了兩個(gè)在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中可能為雙胞體的細(xì)胞狀態(tài)（內(nèi)皮細(xì)胞3、纖維細(xì)胞7）薇组，即僅對(duì)剩余的69種細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分析外臂。
作者還使用了另一種方法驗(yàn)證EcoTyper結(jié)果的準(zhǔn)確性，具體來講律胀，作者測(cè)試了在正常組織中富集的細(xì)胞狀態(tài)是否會(huì)在單細(xì)胞水平上被重現(xiàn)宋光，結(jié)果表明，單細(xì)胞水平和Bulk水平得到的在正常組織中富集的細(xì)胞狀態(tài)具有顯著的一致性炭菌。隨后罪佳，作者基于文獻(xiàn)和已有的數(shù)據(jù)對(duì)EcoTyper識(shí)別的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行注釋，從而確定他們的生物學(xué)含義黑低。發(fā)現(xiàn)2/3的狀態(tài)可在前人的研究中得到證實(shí)赘艳。而剩余的1/3新得到的細(xì)胞狀態(tài)，作者選取M2樣巨噬細(xì)胞的狀態(tài)6，這一狀態(tài)與泡沫狀巨噬細(xì)胞有顯著的相似性第练，是一個(gè)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊頻繁相關(guān)的含脂表型阔馋。為了證實(shí)這一狀態(tài)，作者對(duì)具有高和低的泡沫狀巨噬細(xì)胞含量的人類結(jié)直腸癌腫瘤活檢標(biāo)本中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了Bulk RNA測(cè)序娇掏，結(jié)果與預(yù)期相符呕寝，EcoTyper識(shí)別的九種單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞狀態(tài)中，狀態(tài)6在富含泡沫狀巨噬細(xì)胞的樣本中顯著富集婴梧。
3. 細(xì)胞狀態(tài)與預(yù)后
進(jìn)一步的下梢，作者想要探索細(xì)胞狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明塞蹭，大多數(shù)細(xì)胞狀態(tài)（69中的39）與總體生存率顯著相關(guān)孽江，并在考慮到分期、年齡和性別的多變量分析中番电，49%（n = 34）細(xì)胞狀態(tài)同樣顯著岗屏。具體來講，M1（狀態(tài)3）和M2（狀態(tài)4-7）的巨噬細(xì)胞亞群分別與較長(zhǎng)和較短的生存時(shí)間相關(guān)漱办。此外这刷，在M2樣狀態(tài)中，AEBP1+泡沫狀巨噬細(xì)胞是不良生存的前五大決定因素之一娩井，這暗示泡沫狀巨噬細(xì)胞可能在癌癥的進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用暇屋，并有希望成為治療靶點(diǎn)。與不良風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的其他顯著狀態(tài)包括CA9+成纖維細(xì)胞（狀態(tài)8）和POSTN+成纖維細(xì)胞（狀態(tài)3）洞辣，兩者都與腫瘤侵襲性有關(guān)咐刨，以及促血管生成的尖端樣內(nèi)皮細(xì)胞（狀態(tài)2）。特定的白細(xì)胞主導(dǎo)了有利的生存結(jié)局扬霜，主要狀態(tài)包括CCR7+初始/中心記憶CD4 T細(xì)胞定鸟，CD247+ NK細(xì)胞，CD27+漿細(xì)胞和XCR1+ cDC1樣樹突狀細(xì)胞著瓶，這些與CD8 T細(xì)胞的激活有關(guān)联予。
為了驗(yàn)證結(jié)果的普遍性，作者使用PRECOG（n = 9,062）隊(duì)列作為驗(yàn)證集蟹但。結(jié)果表明躯泰，TCGA和PRECOG之間的生存相關(guān)性高度一致（Pearson r = 0.73, p = 1.2 * 10^-12）。此外华糖，作者還使用了一個(gè)具體的例子展現(xiàn)結(jié)果的一致性麦向，在兩套數(shù)據(jù)中的結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌中客叉，M1和M2泡沫樣巨噬細(xì)胞都分別預(yù)測(cè)了更長(zhǎng)和更短的生存時(shí)間诵竭。
4. 識(shí)別CEs
腫瘤不是單一的細(xì)胞群體话告，而是由多種細(xì)胞和他們之間的相互作用構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。作者基于共同出現(xiàn)和相互避免模式的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)方法對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行聚類卵慰，識(shí)別了10個(gè)多細(xì)胞群體沙郭，將其稱之為“癌細(xì)胞生態(tài)型”(CEs)。CEs包含3-9個(gè)不同的細(xì)胞狀態(tài)并且在人類癌癥中普遍存在裳朋。接下來病线，作者統(tǒng)計(jì)了每個(gè)腫瘤樣本中不同細(xì)胞狀態(tài)的豐度，發(fā)現(xiàn)幾乎每個(gè)腫瘤都有一個(gè)主導(dǎo)的CE鲤嫡，且大多數(shù)腫瘤都由多個(gè)CEs組成送挑。
進(jìn)一步，作者使用3個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這10個(gè)CEs暖眼。首先惕耕，作者測(cè)試了CEs是否能夠在不同的平臺(tái)和獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中得以再現(xiàn)。他們分析了同時(shí)使用RNA-seq和微陣列兩種方法的395個(gè)人類癌癥標(biāo)本诫肠，結(jié)果顯示估計(jì)的CE水平在這兩種平臺(tái)之間存在顯著的相關(guān)性司澎。其次，作者測(cè)試了CEs是否富集了有互動(dòng)潛力的細(xì)胞狀態(tài)栋豫。與背景預(yù)期相比挤安，60%的CEs在配體-受體對(duì)中顯著富集。最后笼才，作者驗(yàn)證了這10個(gè)CEs能否在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中被檢測(cè)到漱受。將EcoTyper應(yīng)用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)（包括76個(gè)腫瘤和21個(gè)正常樣本）络凿，為每個(gè)單細(xì)胞分配狀態(tài)標(biāo)簽并將這些細(xì)胞狀態(tài)與預(yù)先定義的CE進(jìn)行匹配骡送。在這里，作者評(píng)估了預(yù)先定義的CE出現(xiàn)的概率是否顯著高于隨機(jī)情況絮记，結(jié)果表明摔踱，80%的CEs在scRNA-seq數(shù)據(jù)中可以以p < 0.05的顯著性被檢測(cè)到。90%在p < 0.06時(shí)可被檢測(cè)到怨愤。作為補(bǔ)充派敷，作者還計(jì)算了隨機(jī)獲取10個(gè)具有同樣強(qiáng)烈的相關(guān)性的CEs的聯(lián)合概率，發(fā)現(xiàn)P<10^-6撰洗±河洌總的來說，這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了EcoTyper識(shí)別出的多細(xì)胞群體的準(zhǔn)確性差导，并提出CEs為腫瘤中細(xì)胞組織的基本單位试躏。
5. 確定CEs的特征
在識(shí)別出10個(gè)CEs后，接下來作者探討了它們的細(xì)胞设褐、基因組和臨床特征颠蕴。結(jié)果表明泣刹，在訓(xùn)練集中，8個(gè)CEs在單變量模型中具有顯著的預(yù)后意義犀被，在對(duì)腫瘤分期椅您、年齡和性別進(jìn)行多變量調(diào)整后，仍有5個(gè)CEs具有顯著預(yù)后意義寡键。
CE1和CE2高表達(dá)的腫瘤分別以POSTN+成纖維細(xì)胞和基底樣上皮細(xì)胞為標(biāo)志掀泳，并與更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。CE3的特點(diǎn)是髓系細(xì)胞富集西轩、微高衛(wèi)星不穩(wěn)定性开伏，與多種癌癥、特別是與胃反流相關(guān)的食管癌和胃癌有關(guān)遭商。CE4高表達(dá)的腫瘤與肌肉生成和60歲以上的男性有關(guān)（部分是因?yàn)樗鼈冊(cè)陬^頸鱗狀細(xì)胞癌和前列腺癌中的高患病率）固灵，而CE5到CE8高表達(dá)的腫瘤分別富集了與吸煙相關(guān)的突變、正常組織劫流、與年齡相關(guān)的突變和適度的預(yù)后良好結(jié)局巫玻。CE9和CE10高表達(dá)的腫瘤是促炎性的（即富含白細(xì)胞），與較長(zhǎng)的總體生存率相關(guān)祠汇，并分別以高度的免疫反應(yīng)性和較高的B細(xì)胞含量為特征仍秤。
6. 使用CEs預(yù)測(cè)總生存期和免疫治療響應(yīng)
首先，作者比較了CEs與兩種分子分型（Bulk NMF聚類和6種TCGA定義的泛癌免疫亞型）對(duì)生存的預(yù)測(cè)能力可很。結(jié)果表明诗力，無論是單獨(dú)CEs構(gòu)建的生存模型還是在調(diào)整了Bulk NMF和泛癌免疫亞型的多變量生存模型中，CEs都顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)我抠。接下來苇本，作者使用帶有免疫治療和生存信息的數(shù)據(jù)共571名患者評(píng)估了CEs的預(yù)測(cè)能力。結(jié)果表明菜拓，以IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)為特征的CE9在預(yù)測(cè)各種治療類型和生存上優(yōu)于其他CEs瓣窄。此外，作者還將CEs與112種候選生物標(biāo)志物進(jìn)行了比較（這些生物標(biāo)志物包括通過EcoTyper定量的69種細(xì)胞狀態(tài)纳鼎、通過CIBERSORTx計(jì)數(shù)的25種細(xì)胞類型俺夕、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和2種已發(fā)表的ICI應(yīng)答的Bulk標(biāo)志物）。結(jié)果表明贱鄙，CE9具有最高的性能劝贸。總的來說逗宁，這些數(shù)據(jù)證明了CEs對(duì)生存和免疫治療響應(yīng)的預(yù)測(cè)能力映九。
7. CEs的空間分布模式
接下來，作者想要探究CEs是否在腫瘤組織中有固定的空間分布模式疙剑。在這里氯迂，作者主要關(guān)注了與良好生存相關(guān)的CE9和CE10践叠。CE9中的T細(xì)胞狀態(tài)表達(dá)激活和免疫調(diào)節(jié)基因，包括衰竭的標(biāo)志物嚼蚀。而CE10的T細(xì)胞則表達(dá)初始和中心記憶細(xì)胞標(biāo)志物禁灼。使用EcoTyper，作者發(fā)現(xiàn)CE9-T細(xì)胞與M1巨噬細(xì)胞轿曙、成熟的免疫原性樹突狀細(xì)胞和活化的B細(xì)胞等狀態(tài)同時(shí)存在弄捕。而CE10-T細(xì)胞則與促炎性單核細(xì)胞、cDC1和初始/靜息B細(xì)胞共存导帝。這些結(jié)果在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中也得到了驗(yàn)證守谓。
為了探索CE特異的表型是否在空間上有所不同，作者分別對(duì)GZMB（標(biāo)記CE9-T）和GZMK（CE10-T）進(jìn)行了多色免疫熒光(IF)染色您单。作者將EcoTyper應(yīng)用于23個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤斋荞，并選擇了4個(gè)CE9和CE10組成不同的標(biāo)本。為了將分析擴(kuò)展到T細(xì)胞之外虐秦，作者進(jìn)一步使用APOE+/CD68+和CCR2+/CD68+標(biāo)記巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞平酿。結(jié)果表明，IF測(cè)定的相對(duì)細(xì)胞狀態(tài)豐度與EcoTyper推測(cè)的細(xì)胞狀態(tài)豐度一致悦陋。APOE+/CD68+細(xì)胞定位于腫瘤核心蜈彼，而CCR2+/CD68+細(xì)胞定位于腫瘤外圍。無論在單細(xì)胞水平還是Bulk水平俺驶，這些發(fā)現(xiàn)都與10x Visium對(duì)人乳腺癌標(biāo)本的EcoTyper反卷積結(jié)果一致幸逆。
為了確定其他細(xì)胞類型和癌癥是否顯示CE特異性共定位模式的證據(jù)，作者接下來通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了乳腺癌暮现、結(jié)直腸癌还绘、卵巢癌和黑色素瘤樣本中的細(xì)胞狀態(tài)關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明送矩，無論發(fā)育譜系或癌癥類型如何蚕甥，細(xì)胞狀態(tài)通常以CE特異性的方式共定位哪替。接下來栋荸，作者使用一種空間自相關(guān)的統(tǒng)計(jì)度量--Moran 's I來評(píng)估CE間的相似性。發(fā)現(xiàn)一些CEs具有高度的空間聚集性(CE1凭舶、CE9晌块、CE10)，而另一些則更為分散(CE4帅霜、CE5匆背、CE3)。在之前的訓(xùn)練集中確定的特定配體-受體對(duì)中身冀，大約有2/3的CEs在空間上聚集钝尸，這意味著大多數(shù)CEs空間上接近括享，這可能增加了它們之間的相互作用。
此外珍促，由于CE10比CE9距離腫瘤核心更遠(yuǎn)铃辖，并且在正常組織中也存在。作者假設(shè)CE10在腫瘤早期發(fā)展時(shí)早于CE9的出現(xiàn)猪叙。許多證據(jù)支持這一發(fā)現(xiàn)娇斩，如在鱗狀細(xì)胞肺癌發(fā)生的最早階段，CE10比CE9更為普遍穴翩；在惡性組織中犬第，CE9比CE10更為普遍。此外芒帕，在從33名已知結(jié)果的受試者中收集的肺鱗狀細(xì)胞癌的癌前病變中歉嗓，CE10的相對(duì)水平較高與自發(fā)性退化顯著相關(guān)。而CE9的相對(duì)水平較高則預(yù)示著發(fā)展為侵襲性癌癥（AUC = 0.82）背蟆∫４唬總的來說，這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了EcoTyper的準(zhǔn)確性淆储，強(qiáng)調(diào)了CEs與肺癌早期發(fā)展的關(guān)系冠场，并有助于探索TME的診斷和治療潛力。
小結(jié)
從以上結(jié)果我們可以看出本砰，EcoTyper能成功地從Bulk數(shù)據(jù)中識(shí)別了人類16種上皮細(xì)胞起源癌癥的69種細(xì)胞狀態(tài)碴裙，并進(jìn)一步識(shí)別了10種CEs。作者還使用文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些細(xì)胞狀態(tài)的生物學(xué)功能点额，而CEs描述了多種細(xì)胞及其互作構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)舔株。作者驗(yàn)證了EcoTyper識(shí)別出CEs的準(zhǔn)確性，并提出CEs為腫瘤中細(xì)胞組織的基本單位还棱。
此外载慈，作者發(fā)現(xiàn)無論是細(xì)胞狀態(tài)還是CEs都具有良好的預(yù)測(cè)預(yù)后的能力≌涫郑總的來說办铡，EcoTyper展示了如何從Bulk轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組琳要、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷并驗(yàn)證細(xì)胞狀態(tài)和多細(xì)胞群體寡具。在未來，我們可以將EcoTyper框架應(yīng)用于各種疾病的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中稚补，探索疾病發(fā)病機(jī)制童叠，從而輔助我們得到更為有意義的科研結(jié)論。
好啦课幕，本期分享到這就結(jié)束了厦坛，我們下期再會(huì)~
[參考文獻(xiàn)]
Luca BA, Steen CB, Matusiak M, Azizi A, Varma S, Zhu C, Przybyl J, Espín-Pérez A, Diehn M, Alizadeh AA, van de Rijn M, Gentles AJ, Newman AM. Atlas of clinically distinct cell states and ecosystems across human solid tumors. Cell. 2021 Oct 14;184(21):5482-5496.e28. doi: 10.1016/j.cell.2021.09.014IF: 64.5 Q1 . Epub 2021 Sep 30. PMID: 34597583IF: 64.5 Q1 ; PMCID: PMC8526411IF: 64.5 Q1 .
