首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組文章小讀:
文獻(xiàn)名稱:?Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 2022
背景介紹
????癌癥TLS中免疫浸潤(rùn)的組成也稱為三級(jí)淋巴器官或異位淋巴結(jié)構(gòu)挺庞，是出生后在非淋巴組織中出現(xiàn)的免疫細(xì)胞的有組織聚集體穿香。TLSs在生理?xiàng)l件下不存在默刚，但在慢性炎癥環(huán)境中形成关筒。
TLS 結(jié)構(gòu)
????利用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)（mIHC）評(píng)估腫瘤免疫微環(huán)境和TLS的成熟度。研究者認(rèn)為献丑，成熟的TLS（mTLS）由B細(xì)胞和CD23+ 濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）組成咽袜，與一個(gè)較小的CD4+和CD8+混合T細(xì)胞區(qū)相連。
????三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)又叫免疫相關(guān)淋巴組織挺举，包括粘膜相關(guān)淋巴組織、皮膚相關(guān)淋巴組織等烘跺，主要包括B細(xì)胞湘纵、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞滤淳、成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞梧喷、基質(zhì)細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、中性粒細(xì)胞铺敌、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞绊困。濾泡狀樹(shù)突細(xì)胞通常位于B細(xì)胞中心，表達(dá)各類受體适刀，促進(jìn)抗原遞呈至B細(xì)胞，并驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞表達(dá)高活性的抗體煤蹭。
TLS 形成?
? ? TLS存在于長(zhǎng)期炎癥部位的附近笔喉，這樣的炎癥引發(fā)原因可以是免疫疾病、傳染病硝皂、器官移植常挚、腫瘤、炎癥性疾病等稽物。在腫瘤中奄毡，TLS通常在腫瘤浸潤(rùn)部位產(chǎn)生。
????在TLS形成的過(guò)程中贝或，首先是慢性炎癥部位附近的基質(zhì)細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞分泌趨化因子CXCL13或者IL-7吼过，招募淋巴組織誘導(dǎo)因子至炎性部位；淋巴組織誘導(dǎo)因子表達(dá)LTα1β2咪奖，結(jié)合到位于基質(zhì)細(xì)胞的LTβR受體上盗忱，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞分泌VEGFC (vascular endothelial growth factor C)，介導(dǎo)HEV (high endothelial venule) 形成羊赵。
TLS 結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)
????為什么在慢性炎癥條件下在感染或癌癥部位創(chuàng)建淋巴生態(tài)位可能是有利的：
（1）速度：T和B細(xì)胞池的局部啟動(dòng)可能導(dǎo)致更快的免疫反應(yīng)趟佃，因?yàn)樗?guī)避了DC和淋巴細(xì)胞進(jìn)出SLO的運(yùn)輸。
（2）效率：局部淋巴生態(tài)位的產(chǎn)生可能會(huì)增加疾病相關(guān)抗原和稀有匹配淋巴細(xì)胞之間相遇的可能性昧捷，從而可能能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)烈或更廣泛的免疫反應(yīng)闲昭。
（3）控制：擁有與發(fā)炎組織部位直接接觸的淋巴生態(tài)位可能會(huì)提供額外的機(jī)會(huì)來(lái)引導(dǎo)免疫反應(yīng)。
（4）存活：在一些TLS中存在大量功能失調(diào)的PD-1 high CD8+ T細(xì)胞靡挥，這是一種與優(yōu)先腫瘤反應(yīng)有關(guān)的表型序矩，在該模型中，TLS不僅對(duì)誘導(dǎo)很重要芹血，而且對(duì)維持免疫反應(yīng)也很重要贮泞。
? ? TLS相關(guān)成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞亞群分泌的存活因子支持TLS中的淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，可能有助于腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞在腫瘤部位的長(zhǎng)期持續(xù)存在幔烛。
研究過(guò)程
????利用空間轉(zhuǎn)錄組, 免疫組學(xué), Bulk BCR測(cè)序 等技術(shù), 解讀腎細(xì)胞癌組織中TLS結(jié)構(gòu)與患者生存率的關(guān)系, 揭示TLS中B細(xì)胞的克隆類型, 推測(cè)并驗(yàn)證漿細(xì)胞隨成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移至病灶區(qū)域, 呈現(xiàn)抗體與巨噬細(xì)胞共同完成癌細(xì)胞的消殺過(guò)程; 最終定義成熟的TLS結(jié)構(gòu)與意義;
空間TME揭示TLS+相關(guān)區(qū)域富含B細(xì)胞
1. 使用冷凍（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12）對(duì) 24 個(gè) ccRCC 原發(fā)性腫瘤進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)啃擦。在對(duì)切片進(jìn)行 H&E 染色后，經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家 (VV) 對(duì)每個(gè)腫瘤的整體組織以及 TLS 的存在和定位進(jìn)行了注釋饿悬。A: TLS+ 冷凍切片腫瘤令蛉、B: TLS+ FFPE 腫瘤、C: TLS- 冷凍切片腫瘤。
2. TLS+ 腫瘤中珠叔，B 細(xì)胞譜系（包含識(shí)別從幼稚細(xì)胞到 PC 的所有成熟步驟的基因）和 T 細(xì)胞（識(shí)別不同的 T 細(xì)胞群）基因特征優(yōu)先在位于TLS 區(qū)域中表達(dá) 蝎宇。這些腫瘤表現(xiàn)出 CD8 T 細(xì)胞特征的低表達(dá)，在 TLS 區(qū)域略有富集（p = 0.017）祷安。TLS 中的單核細(xì)胞譜系特征略高（分別為 p = 0.00081 和 p = 0.035）姥芥，而 NK 細(xì)胞更廣泛地分布在整個(gè)腫瘤切片中。內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均勻分布汇鞭，在 TLS 內(nèi)得分較低）凉唐，而在 TLS 區(qū)域發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞特征的高表達(dá)。
3. TLS 與 B 譜系霍骄、T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的表達(dá)有關(guān)台囱。
4. Ca9是ccRCC腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物；
TLS 內(nèi)外差異基因差異分析鎖定差異: 免疫球蛋白+B細(xì)胞
1. 三重免疫熒光（IF） 標(biāo)記 (CD20/CD3/PD-1) 確認(rèn) H&E 定義的 TLS 位置读整；
2. 9/10 的 TLS+ 腫瘤中 AUC 范圍為 0.75 至 0.93 簿训；1/10樣本的 AUC 為 0.62 且 TLS 印記特征表達(dá)較弱(該腫瘤缺乏 TLS 成熟度標(biāo)志物，例如 CD23 和 BCL6米间，以及外周淋巴結(jié)尋址素陽(yáng)性 (PNAd+) 高內(nèi)皮小靜脈 (HEV));
3.? TLS imprint 標(biāo)志物: 對(duì)TLS內(nèi)部區(qū)域和外部區(qū)域進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析（logFC>1, p.adjust <0.05强品，不同樣本存在overlap)，獲得?TLS imprint 的標(biāo)志物: 12 個(gè)免疫球蛋白基因车伞、5 個(gè) B 細(xì)胞標(biāo)志物择懂， 2 個(gè) T 細(xì)胞標(biāo)志物、2 個(gè)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物另玖、2 個(gè)補(bǔ)體蛋白編碼基因困曙，以及 CD52、APOE谦去、PTLP慷丽、PTGDS、PIM2 和 DERL3 基因鳄哭。
Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS 區(qū)域顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞
1. 精確定位與 TLS 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄不同的 B 細(xì)胞亞型: 通過(guò) RCTD 對(duì)單細(xì)胞分析中定義的 B 細(xì)胞亞群進(jìn)行空間映射要糊；
2. PC （漿細(xì)胞）相關(guān)基因 MZB1 （漿母細(xì)胞特征基因）的表達(dá)在 TLS 中高，而在冷凍切片腫瘤區(qū)域中總體低妆丘。
3. 由于漿母細(xì)胞不僅限于 TLS 區(qū)域锄俄，在 TLS 外發(fā)現(xiàn) MZB1 的高表達(dá): MZB1 的 PC 可能不僅存在于 TLS 中，而且存在于腫瘤區(qū)域勺拣；
4. 由于 PC 的主要功能是產(chǎn)生抗體奶赠，分析了免疫球蛋白基因的空間表達(dá)：IGHM 幾乎只在 TLS 區(qū)域表達(dá)，增強(qiáng)了 TLS 內(nèi)非轉(zhuǎn)換 B 細(xì)胞的存在药有； IGHG1毅戈、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的幾何平均值）基因在 TLS 區(qū)域以及遠(yuǎn)端區(qū)域高度表達(dá)苹丸。 IGHG1 和 IGHA1 的分散表達(dá)表明同種型轉(zhuǎn)換的 PC 已在 TLS 中形成并在遠(yuǎn)處遷移。
5. 成纖維細(xì)胞標(biāo)記 COL1A1 的高表達(dá);
6. CXCL12 （趨化因子, 與位于骨髓苇经、淋巴結(jié)和慢性炎癥組織中的 PC 遷移和滯留有關(guān)）的表達(dá)與 MZB1 的表達(dá)共定位赘理。
空間 BCR 識(shí)別原位超突變和克隆選擇
A. TLS區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量最多的獨(dú)特輕鏈克隆型;
B. TLS區(qū)域VL基因突變少于或等于中位數(shù); 與TLS相距較遠(yuǎn)的腫瘤區(qū)域大多高突變;
C.? TLS區(qū)域和腫瘤區(qū)域VL突變計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì);
D. 統(tǒng)計(jì)47例ccRCC樣本輕鏈和重鏈突變計(jì)數(shù); TLS高, 體細(xì)胞突變(VL,VH)水平顯著較高;
體細(xì)胞超突變是否伴隨著克隆型選擇?
E. TLS高->總克隆型數(shù)目多+超過(guò)100倍的克隆型計(jì)數(shù)比例較高;
BCR克隆類型與空間分布
F. CDR3 序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù):
點(diǎn)的大小表示每個(gè)克隆型的計(jì)數(shù)數(shù)量，點(diǎn)的顏色表示克隆型所在的不同空間點(diǎn)的數(shù)量;
√ found in both spatial and bulk analyses from the same tumor;
G. 同一家族的克隆型聚集在TLS附近聚集; 在遠(yuǎn)離TLS區(qū)域稀疏分布;
漿細(xì)胞從TLS沿成纖維細(xì)胞軌道傳播
備注:?CD20: B淋巴細(xì)胞抗原; CD3: T細(xì)胞的共同的表面標(biāo)志; MUM1: 表達(dá)于正常的漿細(xì)胞扇单、晚期B細(xì)胞和活化的T細(xì)胞;? ? IgG/IgA: 血漿B細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的一種抗體;COL1: 成纖維細(xì)胞標(biāo)記;? ? CXCL12: 與位于骨髓商模、淋巴結(jié)髓索和慢性炎癥組織中的 PC(plasma cell) 生態(tài)位中的 PC 遷移和滯留有關(guān);
????為了分析腫瘤內(nèi)PCs和成纖維細(xì)胞的位置以及CXCL12的原位表達(dá)，使用多重IF標(biāo)記FFPE腫瘤切片蜘澜，利用多發(fā)性骨髓瘤癌基因（MUM1）作為PCs和成纖維細(xì)胞COL1（Col1a）的特異性標(biāo)記阻桅。
? ? 通過(guò)連續(xù)玻片上的顯色CD3/CD20標(biāo)記，在TLS區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到雙陽(yáng)性MUM1+IgG+PC和少量MUM1+IgA+PC(4A);
? ? COL1+/CXCL12+成纖維細(xì)胞與MUM1+ PC并列(B);
? ? COL1+/CXCL12+成纖維細(xì)胞與MUM1+ PC并列(C);
? ? PC沿著纖維母細(xì)胞軌道排列兼都，嵌入COL1+CXCL12+成纖維細(xì)胞的密集網(wǎng)絡(luò)中;
PC與COL1+成纖維細(xì)胞軌跡圖
1. 絕大多數(shù)PC與成纖維細(xì)胞非常接近，兩種腫瘤的平均距離分別為17.5和19 mm稽寒，圖G和K顯示了距離分布;
2. 44個(gè)腫瘤樣本的平均距離為25.7 mm;
3. Ig和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共同表達(dá)扮碧，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和CXCL12的共同表達(dá)（圖2E）;驗(yàn)證了PCs在TLS內(nèi)以及沿空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC）軌跡的位置。引人注目的是杏糙，在被MUM1+IgG+成纖維細(xì)胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的IgG（圖4F和4J）慎王。
產(chǎn)生Ig的PC與結(jié)合到凋亡腫瘤細(xì)胞上的IgG抗體與機(jī)體對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)
備注:?CD20: B淋巴細(xì)胞抗原; CD3: T細(xì)胞的共同的表面標(biāo)志; MUM1: 表達(dá)于正常的漿細(xì)胞、晚期B細(xì)胞和活化的T細(xì)胞;? ? IgG/IgA: 血漿B細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的一種抗體;? ? CD23是人類B淋巴細(xì)胞表面的一種分化抗原; PNAd: 抗體;? Bcl-6是一種編碼原癌基因蛋白宏侍，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能赖淤。Bcl-6主要表達(dá)在正常生發(fā)中心B細(xì)胞以及相關(guān)淋巴瘤中;
B：成熟TLS的特征是含有GC B細(xì)胞區(qū)，B細(xì)胞區(qū)被T細(xì)胞區(qū)包圍谅河，其中存在CD4+ PD1+ T細(xì)胞咱旱、CD4+ PD1+ CXCR5+ Tfh細(xì)胞和CXCL13+ 細(xì)胞;
C: GC區(qū)的特征是在外圍檢測(cè)到CD23+濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞（FDC）、BCL6+CD20+B細(xì)胞和PNAd+ HEV網(wǎng)絡(luò);
D: TLS的存在與MUM1+ IgG+細(xì)胞密度和MUM1+IgA細(xì)胞密度之間存在顯著相關(guān)性;
E: 含有CD23+ FDC網(wǎng)絡(luò)的TLS绷耍、BCL6+細(xì)胞和PNAd+ HEV與MUM1+ IgG+ PC和MUM1+ IgA+ PC密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性;
成熟TLS的特征
A. CAIX 是一種跨膜蛋白吐限，在發(fā)育中的侵襲性腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH平衡; 黃色虛線方框和箭頭表示雙陽(yáng)性細(xì)胞褂始。
B.? 根據(jù)TLS狀態(tài)诸典，IgG+（左）和IgA+（右）腫瘤細(xì)胞的百分比（n=103）。
C. 根據(jù)MUM1+IgG+PC的密度崎苗，IgG+腫瘤細(xì)胞的百分比（n=103）狐粱。
D. 根據(jù)MUM1+IgA+PC的密度，IgA+腫瘤細(xì)胞的百分比（n=103）胆数。
E. caspase-3（綠色）染色顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡肌蜻。
G. CD68+巨噬細(xì)胞與IgG+裂解的caspase-3+腫瘤細(xì)胞的共定位。
凋亡細(xì)胞數(shù)量多且IgG染色腫瘤細(xì)胞百分比高的腫瘤更容易被CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);
與低IgG腫瘤細(xì)胞患者相比幅慌，高IgG腫瘤細(xì)胞患者的PFS要長(zhǎng)得多;
內(nèi)容概述
????針對(duì)ccRCC原發(fā)性腫瘤宋欺，作者做了12個(gè)冷凍切片空間轉(zhuǎn)錄組和12個(gè)FFPE切片空間轉(zhuǎn)錄組并結(jié)合BCR分析、多色免疫熒光等分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤中的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)產(chǎn)生成熟B細(xì)胞齿诞，漿細(xì)胞擴(kuò)散到腫瘤基部中酸休，產(chǎn)生抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合并引發(fā)其凋亡。
? ? B細(xì)胞在TLS中富集祷杈。BCR分析顯示TLS中的克隆多樣性斑司、選擇、擴(kuò)展但汞，以及遠(yuǎn)處存在完全成熟的克隆型宿刮。
? ? 在TLS+腫瘤中，產(chǎn)生IgG和IgA的PC沿著成纖維細(xì)胞的軌跡播散到腫瘤區(qū)域私蕾。
? ? TLS+樣本具有高豐度IgG的PC和凋亡的惡性腫瘤細(xì)胞僵缺，提示具有抗腫瘤效應(yīng)物活性。
? ? 在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的RCC患者中踩叭，治療反應(yīng)和無(wú)進(jìn)展生存率與IgG染色的腫瘤細(xì)胞相關(guān)磕潮。
? ? 結(jié)論: 腫瘤內(nèi)TLS維持B細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生，這與免疫治療反應(yīng)相關(guān)容贝，可能通過(guò)直接抗腫瘤作用實(shí)現(xiàn)自脯。
參考文獻(xiàn):?
Maxime Meylan, Florent Petitprez, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity.?
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