單細胞水平的測序技術發(fā)展的越來越快，目前應用最多的是集中于mRNA表達的scRNA-seq和結合了空間信息的空間轉錄組转培。在此基礎上恶导，還發(fā)展出了其他變種，比如snRNA-seq浸须，scTCR/BCR-seq, scCITE-seq惨寿，ECCITE-seq，SPARC-seq删窒，scATAC-seq裂垦，等等。這些測序手段越來越成熟和細分易稠。不同的測序手段適用于不同的情況缸废，研究者們需要綜合考慮樣本來源、處理方法驶社、研究目的企量、實驗費用等因素后選擇適合自己課題的測序方案。

研究癌癥譜系進化可關注的不同水平的測序技術[3]

代表性的單細胞多組學測序方法[4]

接下來的一段時間亡电，我們計劃深入解讀以上提到的幾種常用的單細胞組學測序方法届巩，包括目的、測序原理份乒、經典文章解讀恕汇、數據分析工具、圖表復現(xiàn)等方面或辖。歡迎大家持續(xù)關注瘾英！

Why scCITE-seq：在單細胞組學技術出現(xiàn)之前，想要研究單個細胞的活性和功能颂暇，通常是使用一組細胞表面蛋白的免疫熒光抗體通過流式細胞等技術來檢測細胞蛋白表達缺谴。目前常規(guī)的scRNA-seq雖然能夠高通量的輕松測到成千上萬個細胞內的幾乎所有mRNA的表達水平，但是它卻反而無法得到那些早期技術能得到的信息：細胞表面蛋白的表達水平耳鸯。細胞功能的發(fā)揮最終還是落腳到蛋白上湿蛔。而從mRNA到蛋白還會受到復雜的轉錄后調控膀曾，這導致了mRNA水平和蛋白水平的差異，即mRNA表達不能精確反應當前蛋白豐度水平阳啥。有文獻表明蛋白表達差異整體低于mRNA差異[5]添谊。這強調了同時考慮蛋白和mRNA表達水平的重要性。

What is scCITE-seq：CITE-seq全稱為：Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing察迟，是紐約基因組中心技術創(chuàng)新實驗室與Satija實驗室合作開發(fā)的一種多模式單細胞表型檢測方法(a multimodal single cell phenotyping method)[6]斩狱。它的出現(xiàn)彌補了scRNA-seq無法同時獲得單個細胞的mRNA和細胞表面蛋白（注意：該技術僅檢測細胞表面蛋白，不考慮胞內蛋白）表達的缺點卷拘。該技術通過帶DNA標簽的抗體來檢測細胞表面蛋白喊废，同時用10x的RNA單細胞測序來檢測全部的mRNA，從而完成同時獲得mRNA和膜蛋白表達兩個維度的信息栗弟。（注意本文中的CITE-seq和scCITE-seq是相同含義）

測序原理

CITE-seq的關鍵是引入了帶DNA barcode的抗體：

該抗體連接了PCR擴增引物（PCR handle）、用于識別抗體身份的DNA barcode工闺、和poly A尾乍赫。抗體與寡核苷酸的5’端通過鏈霉素-生物素親和反應連接起來陆蟆，并形成一個二硫鍵雷厂，還原劑可將寡核苷酸和抗體分離開。

將這種抗體和細胞懸浮液共孵育叠殷，等抗體和對應的細胞表面蛋白通過抗原-抗體特異性反應充分結合后改鲫，洗掉沒有結合上抗原的游離抗體。此時得到的單細胞懸液中林束，每個細胞的表面蛋白都與對應的帶DNA標簽的抗體結合了像棘。接下來將結合了抗體的細胞和帶有條形碼的凝膠微珠經由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成油包水的微滴(droplet)，獲得單細胞反應體系壶冒。然后將微滴中的細胞裂解缕题，從而讓細胞內的mRNA和細胞表面蛋白抗體的DNA序列（poly A尾的存在讓抗體上的DNA標簽能如同mRNA一樣和凝珠上的poly T序列結合）和凝膠珠上的引物結合。最后通過文庫制備過程后進行測序胖腾。

CITE-seq文庫制備過程

疑問與解答

測了mRNA還不夠嗎烟零？為什么還要測細胞表面蛋白？

從mRNA到蛋白出現(xiàn)在細胞表面還有很長一段過程咸作，這導致了兩者之間可能是不一致的锨阿。相對而言，蛋白比mRNA更能反應細胞目前的狀態(tài)记罚。因而同時測蛋白和mRNA可以提供不同且互補的信息來更好的判斷細胞的功能和活性墅诡。除此之外，表面蛋白表達數據可以幫助細胞分類毫胜，提高細胞類型識別準確度书斜。

CITE-seq一次可以測多少種抗體诬辈？

理論上來說使用的抗體種類數量是沒有上限的。數量遠遠超過流式細胞儀的熒光團數量或質譜儀的同位素數量荐吉。但是要考慮到抗體太多導致費用更多等其他問題焙糟。目前CITE-seq常見的檢測蛋白數量是100-200個左右。

示例文獻

https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1

這篇文獻中样屠，同時使用了scRNA-seq, CITE-seq和空間轉錄組穿撮。這里我們只關注CITE-seq的部分：

用scRNA-seq數據對基質細胞進行聚類（a）和經典marker展示（b）

用CITE-seq數據展示相同細胞內部分marker蛋白的表達（i）用marker基因的蛋白表達值可將細胞按類型聚類（j），兩個圖均驗證了兩種數據間的一致性痪欲。

看下方法學：

這篇文章只對26個樣本中的4個樣本進行了CITE-seq測序悦穿，檢測了157個細胞表面蛋白的表達。但是后續(xù)使用了Seurat的anchoring-based transfer learning算法用4個樣本的CITE-seq值計算出所有剩余沒有進行CITE-seq的樣本對應膜蛋白的表達值业踢。

下期預告

• 示例文獻解讀以及結果復現(xiàn)
• scCITE-seq測序數據分析：CITE-seq-Count
• scCITE-seq數據下游分析：Seurat

Reference

[1]http://www.reibang.com/p/442d890d12ea

[2]https://www.bilibili.com/video/av328984786/?vd_source=0678d16c91cefd3d36645d90da8ed188

[3]Nam, A. S., Chaligne, R., & Landau, D. A. (2021). Integrating genetic and non-genetic determinants of cancer evolution by single-cell multi-omics. Nature reviews. Genetics, 22(1), 3–18. https://doi.org/10.1038/s41576-020-0265-5

[4]Kashima, Y., Sakamoto, Y., Kaneko, K. et al. Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses. Exp Mol Med52, 1419–1427 (2020). https://doi.org/10.1038/s12276-020-00499-2

[5]Reimeg?rd, J., Tarbier, M., Danielsson, M. et al. A combined approach for single-cell mRNA and intracellular protein expression analysis. Commun Biol**4, **624 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02142-w

[6]https://cite-seq.com/

[7]Wu, S.Z., Al-Eryani, G., Roden, D.L. et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet**53, **1334–1347 (2021). https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1

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