材料（其他材料見(jiàn)單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備)
含有5~10mmol /L HEPES 的DMEM 完全培養(yǎng)基和DMEM- 10 完全培養(yǎng)基，pH 為7.2~7. 4
70% (V/ V) 乙醇
FBS
10% (m/V) 疊氮鈉歹袁，可選的
850cm2滾筒式培養(yǎng)瓶和滾簡(jiǎn)裝置枷餐，37°C
250ml 塑料錐底離心管靶瘸，無(wú)菌
離心機(jī)轉(zhuǎn)子
0. 45μm 過(guò)濾裝置，可選的
流程
增殖雜交瘤（見(jiàn)單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備 ，步驟1) 怨咪，以1 : 10 的比例分離部分細(xì)胞到裝有DMEM-10/ 5~ 10mmol/L HEPES 培養(yǎng)基的175 cm2培養(yǎng)瓶中（使培養(yǎng)液總共100ml) 屋剑。為了用蛋白A親和色譜法純化MAb, 需單獨(dú)檢測(cè)有FBS 的培養(yǎng)基以排除污染（可能會(huì)與MAb 一起被純化出的雜蛋白） 。如果需要惊暴，則在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞饼丘。
當(dāng)細(xì)胞已達(dá)到分離移種標(biāo)準(zhǔn)（一般為1 X106~2 X 106個(gè)細(xì)胞／ ml) 時(shí)，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到850cm2滾簡(jiǎn)式培養(yǎng)瓶中辽话。加入150ml DMEM-10 完全／ H EPES 培養(yǎng)基（使培養(yǎng)液總量達(dá)到25 0ml ) 肄鸽。塞緊瓶塞，置于滾筒裝置油啤，于恒溫室或培養(yǎng)箱37°C 恒溫培養(yǎng)1~2d 典徘。
用浸有70％乙醇的紗布擦拭培養(yǎng)瓶口和瓶頸。打開(kāi)培養(yǎng)瓶．加入250ml 含有 HEPES 培養(yǎng)基的DMEM-10 完全培養(yǎng)液（使培養(yǎng)液總最達(dá)到500ml) 益咬。塞緊瓶塞逮诲，置于滾筒裝置， 37°C 恒溫培養(yǎng)1~2d 幽告。
擦拭瓶口梅鹦，打開(kāi)培養(yǎng)瓶，加入2L 含有HEPES 的DMEM- 10 完全培養(yǎng)液（使培養(yǎng)液總量達(dá)到2500m l )冗锁，基本裝滿整個(gè)培養(yǎng)瓶齐唆。為防止起泡，先加入培養(yǎng)基冻河，后加入FBS 至培養(yǎng)液總量的10 % 箍邮。塞緊瓶塞，置于滾簡(jiǎn)裝置叨叙， 37°C恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基變黃（大約需要5d 锭弊；不要過(guò)長(zhǎng)時(shí)間滾動(dòng)培養(yǎng)瓶，以免細(xì)胞發(fā)生破碎） 擂错。
將培養(yǎng)液倒入250ml 錐底離心管味滞。室溫下， 250g 離心20min钮呀。取上清桃犬， 棄沉淀。若不進(jìn)行培養(yǎng)上清的生物學(xué)檢測(cè)行楞，則加入10 ％的疊氮鈉溶液至總員的 0.02% 。若需對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行親和色譜或鹽析純化土匀，先用0.45 μm 過(guò)濾裝置過(guò)濾培養(yǎng)上清子房。將培養(yǎng)上清分裝后冰凍儲(chǔ)存。
