我們最近都在聊CRISPR-Cas9技術和TP53的關系，最近聊的兩篇文章內(nèi)容可以簡述為：（1）CRISPR-Cas9誘導DSB芜果，DSB激活P53鞠呈，導致細胞死亡；（2）CRISPR-Cas9無法使得P53 mutant細胞死亡右钾，從而富集P53突變細胞蚁吝。那么CRISPR-Cas9是依賴DNA修復的技術，TP53是DNA修復的上游信號舀射，是否CRISPR-Cas9對DNA修復功能也有影響呢窘茁？這一次，我們將解讀一篇關于CRISPR-Cas9技術應用中脆烟，P53狀態(tài)和DNA修復之間的關系山林。目前的思路圖如下：

graphical flow

文獻解讀：CRISPR-Cas9在不同狀態(tài)P53細胞中的DNA損傷修復情況

選文：今天挑的文章和我們講的paper 1是同一天發(fā)表在Nature Medicine雜志上的。paper 1（下圖上）作為letter形式發(fā)表而今天的文章是一個brief communication（下圖下）邢羔。

paper

1. 研究背景和問題

Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂（DSBs）可通過非同源端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）進行修復驼抹。修復機制的選擇取決于細胞周期的不同階段，在G1時NHEJ占主導地位（NHEJ在整個細胞周期中都有）拜鹤，而在DNA復制時HDR開始有效框冀。這就導致依賴HDR修復機制的精準基因編輯效率低于NHEJ機制，這對于大部分腫瘤細胞來說HDR效率稍微低一點沒什么敏簿，因其本身效率就很高明也。但對于正常細胞系，尤其是干細胞等惯裕，其HDR精準編輯難度非常大温数。雖然近年來已可通過（1）提高修復DNA模板濃度，（2）添加NHEJ抑制劑以及（3）優(yōu)化轉染等方式增加精準編輯效率蜻势。然<u>而對于正常的撑刺、未轉化的人類細胞的低精準編輯效率，其機制仍然未知咙边。</u>

2. 實驗設計和結果

2.1 經(jīng)典CRISRP文庫篩選：dropout screens

<u>方法介紹：</u>下圖a是一個經(jīng)典的CRISPR文庫篩選策略猜煮。選一定數(shù)量的細胞，轉導CRISPR慢病毒文庫并經(jīng)抗生素篩選后將細胞分成兩份败许，一份是initial sample（初始樣本），一份是終止樣本（細胞培養(yǎng)一定時間后/或經(jīng)過實驗處理）淑蔚。通過比對初始樣本和終止樣本的sgRNA文庫：（1）某些sgRNA已不再被檢測到或者含量非常低市殷，則可說明這些sgRNA編輯的基因是生長必須的基因；（2）某些sgRNA含量 比例增加刹衫，則一方面可能是其他sgRNA量的減少醋寝，導致這部分細胞比例增加搞挣，也有可能是這些sgRNA對調(diào)控細胞生長的基因進行了敲除或者抑制。

CRISPR screening

結果：

如下左圖b：作者選用永生化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞 （retinal pigment epithelium音羞，RPE）進行CRISPR文庫篩選：部分細胞在被敲除生長必須基因后應該死亡囱桨，則針對這些基因的sgRNA不應被檢測到，而他們檢測到了嗅绰。對sgRNA進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)P53-P21-RB1等基因的sgRNA序列高度富集舍肠。因此<u>作者推測是P53-P21-RB1軸的失常，導致細胞在被敲除生長必須基因后仍能存活窘面。</u>

如下右圖c：為驗證P53-P21RB1軸失常對維持細胞生存的作用翠语，作者對RPE P53+/+和P53-/-細胞進行全基因組CRISPR文庫篩選，將對細胞生長必須的核糖體基因進行分析：（1）P53-/- RPE 有相當一部分細胞的核糖體基因含量很少财边，說明在沒有正常核糖體基因的情況下仍能存活肌括。（2）而P53+/+ RPE細胞都有較高含量的核糖體基因，說明被敲除核糖體基因的細胞已經(jīng)死亡酣难〉玻總得來說，在該死的時候憨募，p53-/-細胞不死慧库。經(jīng)過前面兩篇文章的解說，<u>我們很容易認為這是由于P53缺失馋嗜，導致凋亡誘導失敗造成的齐板，但是不是呢</u>？

major result 1

解讀分析：在正文中有很短的一段話銜接葛菇，雖然結果在中文和補充材料中我都沒找到甘磨。作者發(fā)現(xiàn)P21 sgRNA的富集僅僅出現(xiàn)在P53+/+中，在P53-/-則無P21 sgRNA富集眯停。因此作者認為济舆，P21的缺失僅僅在P53+/+的時候，才能給細胞提供生長競爭優(yōu)勢莺债。由于P21是P53調(diào)節(jié)細胞周期的重要下游因子滋觉，因此作者假設，CRISPR-Cas9誘導DSBs觸發(fā)了通過p21和pRB介導的短暫的齐邦、p53依賴的細胞周期阻滯椎侠，而與靶向位點無關。注意這里提到了與靶點無關措拇，即<u>只要達到細胞周期阻滯效果皆可我纪，不一定是P53缺失</u>。這里就為后面的研究做了前因后果鋪墊，這也是本文與同一天發(fā)表的另外一篇文章的不同之處浅悉。

2.2 P53狀態(tài)對細胞周期的影響

方法介紹：

（1）上文提到短暫的細胞周期阻滯趟据，因此作者選用了瞬轉的CRISPR-Cas9方法：即直接將Cas9蛋白和sgRNA的復合物投放到細胞中，這個復合物叫做核糖核蛋白（ribonucleoprotein术健，RNP）汹碱。

（2）此外，還設計依賴HDR的CRISPR-Cas9精準修復實驗BFP-GFP實驗荞估，如下圖b所示：細胞原本帶有mutant GFP-2A-BFP元件咳促，由于GFP是突變的無法發(fā)光，因此細胞只表達藍色熒光泼舱，通過HDR精準修復mutant-GFP后等缀，被修復的細胞同時發(fā)藍色和綠色熒光。

major result 2

解讀分析：從上圖a結果可看到娇昙，經(jīng)由RNP瞬時CRISPR-Cas9基因編輯時尺迂，P53-/-細胞其周期沒有特別改變，而p53+/+細胞則出現(xiàn)G1期增加（NHEJ增強）冒掌，G2/S期減少的情況（HDR減弱）噪裕。

2.3 細胞周期與HDR精準編輯的關系

鑒于HDR主要在S期中激活，作者認為P53WT細胞的由于P53激活導致G2/S期細胞減少股毫，從而依賴HDR 的CRISPR-Cas9精準編輯效率不如p53-/-細胞膳音。為了驗證這個假設，使用了上圖b中的BFG-GFP實驗铃诬。從下圖結果可看到祭陷，確實p53-/-組的綠色熒光細胞更多，證明p53-/-的精準編輯更多趣席。

同時作者使用細胞周期抑制劑--CDK4/6抑制劑palbociclib兵志，將細胞周期阻滯在G1期，此時G2/S期細胞會變少宣肚，可以看到HDR精準編輯的效率下降想罕。這一個實驗非常重要，因為P53+/+細胞的低編輯效率也可以是因為細胞的死亡霉涨，就如前面paper1我們提到的那樣按价，<u>這里使用細胞周期抑制劑，使得兩者的相關關系笙瑟，進一步往因果關系靠攏楼镐。</u>

major result 3

2.4 驗證性實驗：P53激活劑和抑制劑

接下來是兩個在P53研究中非常常用的抑制劑和激活劑。

P53抑制劑MDM2：如下圖e逮走，P53在常規(guī)情況下被MDM2泛素化鸠蚪，最后被運送到蛋白酶體降解今阳，這就是P53在正常細胞中維持非常低水平的原因师溅。而外加MDM2則可降低Cas9誘導DSB時誘導的P53水平茅信，使得HDR精準修復效率更高。

P53激活劑Nutin3a：如下圖f墓臭，Nutin3a通過抑制MDM2作用蘸鲸，使得P53不再被泛素化，P53蛋白得以穩(wěn)定于細胞中窿锉，此時HDR精準編輯效率降低酌摇。這部分的結果進一步證實P53與HDR精準編輯的關系。如果可以的話嗡载，最好把細胞周期結果補一補窑多，進一步驗證“P53-細胞周期阻滯-HDR精準修復效率”這個機制。

major result 4

綜上所述洼滚，P53激活導致的細胞周期阻滯會降低HDR精準編輯效率埂息，而抑制P53可以增加精準編輯的效率。

3. 未解決問題

即使短暫的P53抑制都有可能會導致染色質重排或者基因損傷修復失敗遥巴，從而積累DNA突變千康，對后續(xù)應用造成影響，因此需要進一步的工作去驗證短時P53抑制對細胞的影響铲掐。在這里不得不佩服大課題組的敏銳嗅覺拾弃，這篇文章發(fā)表于2018年6月份，就在2019年就已有關于瞬時抑制P53對細胞基因組或功能影響的研究摆霉，且該文發(fā)表在干細胞領域top期刊cell stem cell上豪椿，下次我們將來解讀，別人是如何解決這個問題的携栋。

結語

別看這篇文章只是brief communication搭盾，文章篇幅雖短，但是實驗設計十分精巧刻两。尤其是如何擺脫P53和凋亡之間的關系增蹭，轉而研究細胞周期這部分，做了很好的銜接磅摹。早在2019年我也讀過這篇文章滋迈，從前讀文章只會看結果，讓自己強行接受作者的觀點户誓。而這次有了前面幾篇文章的鋪墊饼灿，我開始會橫向比較這些工作的不同，以及他們?nèi)绾未_定自己的方向帝美。白天太忙有時候無法思考碍彭，到了晚上躺在床上拿出手機細細的看，寫寫筆記，越看越對頭庇忌。最近已經(jīng)愛上了這樣的文獻閱讀方式舞箍，假以時日，我們期盼能把P53和CRISRP-Cas9之間的經(jīng)典文章都過一遍皆疹，組成自己的小宇宙疏橄。同時在文末不斷的強調(diào)這是學習筆記，希望大家多多反饋交流略就。也在這里像廣大小伙伴發(fā)出邀請捎迫，如果您也想一起看文章，請在評論摳1表牢，但最終還是要圍繞自己的可以讀文窄绒，還是有個輕重緩急。

我們最終的目的還是：一起學習崔兴！

前期文章：

1. 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質粒骨架及其各個要素的介紹：
   解剖式學習一個質粒結構--update
   質粒系列之什么是質粒
2. 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
   質粒系列之限制性克隆--restriction cloning
3. 前面還夾雜的講過一些piggybac彰导、gateway、RMCE的一些內(nèi)容：
   基因編輯如何換藥不換湯
4. 慢病毒系列也有講過兩篇：
   團隊作案HEK293恼布，史上最強搬磚細胞
   不想再用慢病毒了螺戳，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon
5. 此外我們本還有一個CRISPR screening的專題折汞，只有開頭倔幼，未得完善：精準大海撈針--5. CRISPR screening專題
6. 質粒系列之再談無縫連接--Gibson assembly
7. Golden Gate，質粒改造的王者
8. 關于CRISPR-Cas9技術的脫靶效應：CRISPR-Cas9基因編輯--脫靶效應如何檢測
9. CRISPR和TP53文獻解讀之：Cas9誘導P53激活并導致細胞死亡
10. CRISPR和TP53文獻解讀之：Cas9活性可篩選P53突變細胞