10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組的初探索

編輯：陸瑤

校對：ANIMUS

編者按：腦科學(xué)是最迷人的學(xué)科之一裆蒸，也是最可能取得重大突破的學(xué)科冬殃，一直是全世界科學(xué)研究熱點(diǎn)虽风。隨著8月29日埃隆·馬斯克(Elon Musk)的腦機(jī)接口公司Neuralink直播展示了最新芯片植入豬腦后可探測小豬神經(jīng)元的活動，讀取腦部活動，未來可幫助解決許多神經(jīng)系統(tǒng)問題喜命，比如記憶力減退卢厂、中風(fēng)乾蓬、成癮等，再一次掀起了全世界對腦科學(xué)研究熱潮慎恒。而目前對大腦各功能區(qū)依然所知甚少任内，從分子水平理解其結(jié)構(gòu)和功能對于腦重大疾病的防治具有重大戰(zhàn)略意義撵渡。

愛麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)專注于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)前沿進(jìn)展，探索心腦血管疾病和癌癥的致病基因死嗦、發(fā)病機(jī)制和藥物開發(fā)等趋距，尤其是腦科學(xué)。作為本刊【Amazing brain】系列第一篇越除，這里解讀全球首篇應(yīng)用10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組研究人腦前額葉背外側(cè)皮質(zhì)的空間基因表達(dá)譜的文章节腐，助力腦科學(xué)前沿進(jìn)展共享。

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腦組織功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)翼雀。其中大腦皮層具有經(jīng)典的分層結(jié)構(gòu)（L1~L6），不同層之間細(xì)胞表現(xiàn)出差異的基因表達(dá)模式孩擂，因而具有不同的形態(tài)锅纺、生理學(xué)和連接模式。而某些神經(jīng)精神疾病也與特定皮層的基因表達(dá)肋殴、突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)囤锉。因此，在細(xì)胞分辨率下定位人腦中的空間基因表達(dá)對于深入了解疾病機(jī)制至關(guān)重要护锤。但目前廣泛運(yùn)用的單細(xì)胞測序技術(shù)官地，由于解離組織成單個細(xì)胞而丟失了組織中細(xì)胞的空間位置信息。而空間轉(zhuǎn)錄組作為一種近年來新興的技術(shù)烙懦，可在組織切片上原位捕獲RNA驱入，并進(jìn)行cDNA合成和測序，得到樣本較為完整的基因表達(dá)空間圖譜氯析。

2020年2月28日亏较，約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院利伯腦發(fā)育研究所的Keri Martinowich和約翰霍普金斯彭博公共衛(wèi)生學(xué)院生物統(tǒng)計學(xué)系A(chǔ)ndrew E. Jaffe團(tuán)隊(duì)聯(lián)合10x Genomics，在bioRxiv發(fā)表了題為“Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex”的論文掩缓，首次運(yùn)用 10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究人腦前額葉背外側(cè)皮質(zhì)（DLPFC）雪情，得到人腦各層皮質(zhì)的基因表達(dá)譜，確定了大腦各層特異性表達(dá)基因你辣，整合單核RNA測序（snRNAseq）數(shù)據(jù)完善了基因表達(dá)簇的空間信息巡通，發(fā)現(xiàn)了精神分裂癥和自閉癥相關(guān)基因在腦不同層的富集，說明了基因空間表達(dá)與疾病密切相關(guān)舍哄。最后作者還開發(fā)了一個無監(jiān)督聚類模型宴凉，可用于對那些解剖學(xué)定義不明的組織進(jìn)行空間劃分。

一 材料與方法

本研究共收集了3個神經(jīng)功能正常的捐獻(xiàn)者死后腦組織表悬，選取前額葉背外側(cè)皮層弥锄，垂直腦表面取樣2對（4張）切片，每對包含直接相鄰的2張切片，厚度為10μm籽暇，對與對之間相距300μm窘行，總共12張切片（圖1）。利用組織切片中灰質(zhì)/神經(jīng)元(SNAP25)图仓、WM/少突膠質(zhì)細(xì)胞(MOBP)和L5 (PCP4)的標(biāo)記基因，勾畫出第6層(L6)與相鄰白質(zhì)(WM)之間的邊界但绕，定位每個樣本方向救崔。

圖1. 取材過程

二 繪制人腦DLPFC中基因表達(dá)概況

將所有樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，檢測到每個Spot平均有3.3個細(xì)胞捏顺、3,462條UMI和1,734個基因六孵。利用標(biāo)記基因進(jìn)行t-SNE降維，將每個Spot歸類到6個皮層及白質(zhì)中幅骄。計算各層皮質(zhì)每個基因的總表達(dá)量劫窒，得到每層基因表達(dá)譜。將以每個Spot為單位的基因表達(dá)譜拆座，轉(zhuǎn)化為以每層皮質(zhì)為單位的基因表達(dá)譜（圖2）主巍。

圖2. 計算各層皮質(zhì)基因表達(dá)譜原理

三 尋找各層富集基因

得到各皮層的基因表達(dá)譜后，運(yùn)用'Enrichment' model挪凑，即：比較每一皮層相對于其他6層孕索，顯著高表達(dá)的基因，定義為“層富集基因”躏碳。將此“層富集基因”與既往文獻(xiàn)中已發(fā)表搞旭、或明確的層標(biāo)記基因?qū)Ρ龋l(fā)現(xiàn)只有59.5%的基因在本次研究中被證實(shí)為顯著差異基因菇绵，同時肄渗，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了一些新的層富集基因。于是咬最，作者使用多重單分子熒光原位雜交技術(shù)（multiplex single molecule fluorescentin situhybridization）進(jìn)行驗(yàn)證翎嫡，確認(rèn)AQP4, HPCAL1, FREM3, TRABD2A,KRT17等層標(biāo)記基因的表達(dá)（圖3）。

圖3. 多重原位雜交技術(shù)驗(yàn)證新標(biāo)記基因

四 snRNA-seq/scRNA-seq亞細(xì)胞群空間位置注釋

對人腦組織snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)注釋其空間位置信息永乌，有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞亞群的功能钝的。因此，作者利用本實(shí)驗(yàn)室既往單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)（2例人腦DLPFC組織铆遭，共5231個細(xì)胞核）進(jìn)行聚類硝桩，在 7種廣泛細(xì)胞類型中得到30個初級的細(xì)胞簇。利用各層皮質(zhì)中顯著富集的前100個基因枚荣，分析各層皮質(zhì)和白質(zhì)與亞細(xì)胞群之間碗脊，關(guān)于這700個基因表達(dá)譜的Pearson相關(guān)系數(shù)。最終，將少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligo）主要定位于腦白質(zhì)區(qū)（WM）衙伶，星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astro）主要定位于L1祈坠，小膠質(zhì)細(xì)胞（Mircro）、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）主要定位于L1和WM矢劲，神經(jīng)元較廣泛地定位于L2~L6（圖4~5）赦拘。為了進(jìn)一步評估該 “空間位置注釋”方法的穩(wěn)定性，又應(yīng)用其他單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析芬沉、對比躺同，最終得到相似的細(xì)胞亞群定位結(jié)果。因此丸逸，作者認(rèn)為該方法可為既往任何腦研究中的scRNA-seq或snRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞空間位置信息注釋蹋艺。

圖4. snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)空間注釋原理

圖5. snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)空間注釋結(jié)果

五 疾病相關(guān)基因的皮層定位

為促進(jìn)本研究結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化，探究疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制黄刚，尋求更有效治療方法捎谨，作者分析了包括自閉癥譜系障礙（ASD）、精神分裂癥（SCZD）等一系列腦疾病相關(guān)基因集的皮層定位憔维，發(fā)現(xiàn)自閉癥譜系障礙（ASD）相關(guān)基因集在特定皮層被富集（圖6）涛救。更有趣的是，如果將102個ASD相關(guān)基因按照不同臨床表現(xiàn)歸為53個與ASD主要特征相關(guān)的基因集（ASD53）和49個與神經(jīng)發(fā)育延遲相關(guān)的基因集（ASD49）业扒，發(fā)現(xiàn)上述兩者分別被富集到L5和L2（圖7）州叠。這表明疾病的不同臨床亞型，可能是由不同部位的不同亞類細(xì)胞驅(qū)動的凶赁。

圖6. 腦疾病相關(guān)基因集的皮層定位

圖7. ASD不同臨床癥狀的皮層定位

六 構(gòu)建數(shù)據(jù)聚類模型

由于本研究中的人腦皮層結(jié)構(gòu)及各層標(biāo)記基因已被廣泛研究咧栗、較為明確。除此之外虱肄，一些組織可能缺乏一定的解剖結(jié)構(gòu)規(guī)律及標(biāo)記基因致板。因此，針對這一情況咏窿，作者分別構(gòu)建了3種“非監(jiān)督”斟或、“半監(jiān)督”、“監(jiān)督”的數(shù)據(jù)聚類方法集嵌。而非監(jiān)督方法可用來分析空間結(jié)構(gòu)不明確的組織萝挤，特別是那些與抑制神經(jīng)元亞群、腦血管系統(tǒng)或免疫功能相關(guān)的組織根欧，以便日后將空間轉(zhuǎn)錄組更可靠地應(yīng)用于更廣泛的研究怜珍。

圖8. “非監(jiān)督”、“半監(jiān)督”凤粗、“監(jiān)督”數(shù)據(jù)聚類方法

七 總結(jié)

本研究運(yùn)用10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)酥泛，繪制人腦DLPFC中各層基因表達(dá)譜并挖掘各層富集基因，運(yùn)用富集基因?qū)韧鵶cRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行空間注釋，并將疾病相關(guān)基因定位于特定皮層柔袁，便于臨床轉(zhuǎn)化呆躲。最終構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，可更好地應(yīng)用于其他組織的解剖學(xué)定義捶索。

本文作為Visium空間轉(zhuǎn)錄組在腦科學(xué)應(yīng)用的第一篇文章插掂，展示了空間轉(zhuǎn)錄組在腦科學(xué)研究的思路，應(yīng)用了很多新穎方法腥例，具有非常重要的意義辅甥。愛麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)計劃推出【Amazing brain】系列，解讀腦科學(xué)相關(guān)重磅文章院崇。

下期預(yù)告：小編解析【Amazing brain】系列第二篇，空間轉(zhuǎn)錄組研究阿爾茲海默癥（AD）文章袍祖。

原文鏈接https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.28.969931v1

參考文獻(xiàn)

1. Maynard K底瓣，Leonardo CT, et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex.biorxiv.2020.02.28.