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//文獻(xiàn)
2020年發(fā)表于Cancer Cell啸如，影響因子31.743，一篇非典型的scRNA文章撤逢，大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證佐證了分析結(jié)果争拐，對(duì)于深入挖掘一個(gè)基因影響一個(gè)通路的機(jī)制有一定借鑒意義。
MYC drives temporal evolution of small cell lung cancer subtypes by reprogramming neuroendocrine fate
//摘要
小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一種臨床上作為單一疾病治療的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤蝗岖，預(yù)后不良侥猩。基于 ASCL1抵赢、NEUROD1欺劳、POU2F3 或YAP1 的表達(dá)可以定義不同的SCLC分子亞型。文章使用不同時(shí)間點(diǎn)小鼠和人類模型铅鲤，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示MYC基因驅(qū)動(dòng) SCLC 亞型划提。在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，MYC 激活 Notch 以去分化腫瘤細(xì)胞邢享，促進(jìn) SCLC 從ASCL1+到 NEUROD1+再到 YAP1+狀態(tài)的轉(zhuǎn)移鹏往。MYC也可促進(jìn)來自不同細(xì)胞類型的POU2F3+腫瘤。人類SCLC表現(xiàn)出腫瘤內(nèi)亞型異質(zhì)性骇塘，表明這種動(dòng)態(tài)演變發(fā)生在患者腫瘤中伊履。
//前言
大量的研究都已表明SCLC可以通過四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分為不同的亞型韩容，ASCL1 (SCLC-A)、NEUROD1(SCLC-N)唐瀑、POU2F3(SCLC-P) 群凶， YAP1(SCLC-Y)。SCLC_ASCL1亞型占比70%左右哄辣，ASCL1是一個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(NE)命運(yùn)的主要調(diào)節(jié)因子请梢，MYCL高表達(dá)。另外三種亞型高表達(dá)MYC力穗，并且逐漸失去NE的分子特征溢陪。
Notch在SCLC中是一種腫瘤抑制因子，約25%的腫瘤存在Notch受體功能喪失的改變睛廊，在肺損傷時(shí)，Notch2標(biāo)記一個(gè)NE-干細(xì)胞群在Notch缺失的情況下進(jìn)行自我更新杉编。
雖然MYC和NOTCH都與SCLC的non-NE細(xì)胞命運(yùn)有關(guān)超全，但MYC和NOTCH之間的功能關(guān)系并不清楚。文章主要研究了MYC在SCLC亞型的起源和關(guān)系中的作用邓馒。
//分析思路
//主要結(jié)果
- 問題：MYC驅(qū)動(dòng)了哪些SCLC亞型嘶朱？
分析不同時(shí)間點(diǎn)Myc-driven(RPM)和Mycl-driven(RPR2)SCLC小鼠模型的腫瘤，早期NE marker高表達(dá)光酣，后期擴(kuò)散性的RPR2腫瘤仍維持高表達(dá)疏遏，RPM腫瘤中的表達(dá)顯著下降，非NE marker NEUROD1, YAP1, HES1, ZEB1, CD44 表達(dá)升高救军，MYC在擴(kuò)散性RPM中高表達(dá)财异，而在RPR2中沒有檢測(cè)到。有趣的是唱遭，POU2F3很少在來自PNECs的RPM腫瘤中檢測(cè)到戳寸。然而，RPM小鼠啟動(dòng)子中一般啟動(dòng)子(Ad-CMV-Cre)拷泽，非club或者AT2啟動(dòng)子疫鹊，在表達(dá)POU2F3的腫瘤中富集。
表明MYC在SCLC-N司致、-Y拆吆、-P中的高表達(dá)和已報(bào)道的研究結(jié)果一致，MYC可能是不同SCLC亞型的驅(qū)動(dòng)因素脂矫。
- 問題：SCLC不同亞型潛在的時(shí)空聯(lián)系是怎么的枣耀？
取ASCL1+陽性的RPM原位腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞最初形成緊密庭再、圓形奕枢、球形的聚集物娄昆，類似經(jīng)典的高NE特性的人類SCLC細(xì)胞系，最終形成鏈?zhǔn)降姆荖E的細(xì)胞缝彬，而RPR2腫瘤細(xì)胞沒有變化萌焰。不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞依次表達(dá)ASCL1、NEUROD1谷浅、YAP1等扒俯。并通過在RPR2腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)Myc，證明MYC促進(jìn)了RPR2腫瘤細(xì)胞系向非NE轉(zhuǎn)變一疯。
- 問題：人和小鼠中MYC的驅(qū)動(dòng)進(jìn)化是否一致撼玄？
通過bulk測(cè)序證明不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞分別高表達(dá)各亞型的信號(hào)。
- 問題：SCLC亞型是否沿著單一軌跡發(fā)展墩邀？
使用Day4-21 6個(gè)不同時(shí)期的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序掌猛。在Day4-7的細(xì)胞群中，Ascl1和NE marker大量表達(dá)眉睹，而在Day11-21的細(xì)胞中荔茬，非NE marker大量表達(dá)。
使用4個(gè)擴(kuò)散性的腫瘤樣本和上面細(xì)胞系中腫瘤細(xì)胞一起進(jìn)行擬時(shí)序分析竹海，少部分細(xì)胞進(jìn)入到晚期階段慕蔚，RPM2-4腫瘤在較晚的時(shí)間點(diǎn)有更多的細(xì)胞，這與RPM1的ASCL1水平較低斋配，YAP1蛋白表達(dá)較高是一致的孔飒。top500個(gè)差異表達(dá)基因在擬時(shí)間內(nèi)的表達(dá)表現(xiàn)為NE基因的廣泛缺失和非NE基因的獲得。并使用 diffusion map的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證Monocle的結(jié)果艰争。
- 問題：MYC驅(qū)動(dòng)的不同亞型腫瘤內(nèi)異質(zhì)性怎樣坏瞄？
擬時(shí)間分析表明，單個(gè)RPM腫瘤由代表多種SCLC亞型的細(xì)胞組成甩卓。通過分析單個(gè)RPM腫瘤的原位或侵襲期的系列切片惦积，也說明了不同亞型組成的異質(zhì)性。通過CIBERSORT解卷積分析10個(gè)RPM腫瘤也證明了MYC驅(qū)動(dòng)進(jìn)展的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性猛频。
- 問題：MYC如何在NE去分化中激活Notch信號(hào)狮崩？
使用scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，并使用ENRICHR分析對(duì)top差異基因進(jìn)行富集分析鹿寻，鑒定到了影響SCLC命運(yùn)重要的轉(zhuǎn)錄因子睦柴，包括REST, SUZ12, TCF3, NEUROD1, NHLH1, MYC, SOX2。Notch/Rest 信號(hào)可以促進(jìn)SCLC的非NE命運(yùn)毡熏，使用人源的NE基因集鑒定每個(gè)細(xì)胞的NE-score坦敌，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，NE-score準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了NE-identity的下降，在第7天至12天之間狱窘，NE-score顯著下降杜顺。
進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)變過程中Notch信號(hào)相關(guān)的機(jī)制和靶基因，發(fā)現(xiàn)Notch抑制因子在早期表達(dá)較高蘸炸，包括Dll3, Hes6, Fbxw7 ,Ncor2躬络，相反促Notch信號(hào)基因隨著時(shí)間表達(dá)增高，包括Notch靶基因Hes1,Rest,Notch2搭儒。對(duì)Bulk-RNA
數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析發(fā)現(xiàn)晚期相對(duì)于早期Notch信號(hào)活性增強(qiáng)穷当，而REST轉(zhuǎn)錄靶基因集受到抑制。多個(gè)Notch信號(hào)中的基因在Chip-seq數(shù)據(jù)中鑒定為MYC的靶基因淹禾。這些數(shù)據(jù)表明MYC增加NOTCH/REST活性在MYC驅(qū)動(dòng)的SCLC進(jìn)化過程中改變NE特性馁菜。
- 問題：Notch信號(hào)激活在MYC驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)化中是否必須？
將早期RPM腫瘤細(xì)胞在gamma-secretase inhibitor下培養(yǎng)(如DAPT)來阻斷Notch信號(hào)铃岔，并設(shè)置非阻斷的對(duì)照汪疮。發(fā)現(xiàn)DAPT處理的RPM細(xì)胞并沒有轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌男螒B(tài)，并且和對(duì)照相比毁习，ASCL1, INSM1, EPCAM, NEUROD1的表達(dá)增加智嚷。
