臨近新年了，今天29號式撼，但是沒啥年味呢？肥矢？今天我給大家分享一個單細胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容端衰，文章在Single-Cell Transcriptomic Analyses of Tumor Ecosystems and Spatial Architectures in Human Small Cell Lung Cancer。

ABSTRACT

小細胞肺癌 (SCLC) 是一種高度異質(zhì)性的疾病甘改，其特征是侵襲性表型和預后不良旅东。為了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的細胞成分及其空間分布，對 12 個切除的人類原發(fā)性 SCLC 進行了單細胞 RNA 測序和空間轉(zhuǎn)錄組學分析十艾。分析揭示了腫瘤和非腫瘤細胞的廣泛異質(zhì)性抵代，以及主要的免疫抑制微環(huán)境。重要的是忘嫉，多種雜合腫瘤細胞狀態(tài)被揭露荤牍，包括雜合 SCLC 和肺腺癌細胞以及雜合腫瘤和免疫細胞，表明腫瘤細胞具有高表型可塑性庆冕。此外康吵，揭示了這些雜合腫瘤細胞的細胞起源和進化，以及腫瘤-基質(zhì)細胞串擾在驅(qū)動雜合細胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用访递』耷叮總之，這項研究加深了對人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)的理解，并為針對 SCLC 治療的雜交腫瘤細胞和免疫抑制微環(huán)境提供了理論依據(jù)惭载。

INTRODUCTION

小細胞肺癌 (SCLC) 是一種難治性肺癌旱函，其特征是對化療的初始反應后快速復發(fā)。不幸的是描滔，在過去的三十年里棒妨，SCLC 患者的治療選擇非常有限。更糟糕的是含长，缺乏用于生物醫(yī)學研究的手術(shù)標本一直是一個障礙券腔，許多研究嚴重依賴臨床前模型，例如基因工程小鼠和患者來源的異種移植 (PDX) 模型茎芋。然而颅眶，源自這些模型的腫瘤不能完全概括人類 SCLC 的生物學特征，例如浸潤性免疫細胞和基質(zhì)細胞以及腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的空間結(jié)構(gòu)田弥。值得注意的是涛酗，SCLC 已被揭示為一種高度異質(zhì)性的疾病，在小鼠和人類 SCLC 腫瘤中均表現(xiàn)出廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性偷厦，這與侵襲性表型和預后不良直接相關(guān)商叹。最近，基于轉(zhuǎn)錄因子（ASCL1只泼、NEUROD1剖笙、POU2F3 和 YAP1）的差異表達定義了 SCLC 的四種分子亞型，包括 SCLC-A 和 SCLC-N 神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）亞型请唱，以及 SCLC-P 和 SCLC -Y 非 NE 亞型弥咪。不同的 SCLC 亞型對靶向治療具有不同的脆弱性。例如十绑，觀察到 SCLC-A 亞型對 BCL2 抑制劑更敏感聚至，而 SCLC-N 和 SCLC-P 亞型分別對極光激酶抑制劑和 PARP 抑制劑更敏感。最近本橙，一種炎癥亞型 (SCLC-I) 對免疫檢查點阻斷 (ICB) 表現(xiàn)出更高的敏感性扳躬。此外，MHC I 表達在具有非 NE 特征的 SCLC 細胞亞群中增加甚亭，已被確定為預測因子ICB 功效贷币。鑒于 SCLC 腫瘤的異質(zhì)性，迫切需要剖析腫瘤成分并提供更精細的 SCLC 亞型分類亏狰，以開發(fā)下一代精準療法（有臨床運用價值）役纹。

近年來，單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）已被廣泛用于研究人類癌癥中的腫瘤異質(zhì)性暇唾，包括非小細胞肺癌字管、胰腺癌啰挪、頭頸部鱗狀細胞癌和乳腺癌，這提供了前所未有的研究嘲叔。分辨率以表征腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中不同細胞成分之間的單個細胞和細胞間通訊的分子特征。值得注意的是抽活，scRNA-seq 還被用于使用 PDX硫戈、CDX 模型和人體標本研究 SCLC 的腫瘤異質(zhì)性。例如下硕，通過對 21 個人類 SCLC 標本進行 scRNA-seq 分析丁逝，發(fā)現(xiàn)了具有干細胞樣特征的高 PLCG2 腫瘤細胞群。然而梭姓，在這些研究中測序的大多數(shù) SCLC 標本都是活檢樣本霜幼，每個樣本測序的單個細胞數(shù)量相對有限。此外誉尖，浸潤的免疫細胞和基質(zhì)細胞的landscope大多仍未探索罪既。此外，尚未研究人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中不同細胞成分的空間結(jié)構(gòu)铡恕。為了解決這些限制琢感，本研究應用結(jié)合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學分析來剖析人類 SCLC 腫瘤中的細胞成分及其空間分布。研究結(jié)果揭示了組織和腫瘤內(nèi)廣泛的腫瘤異質(zhì)性探熔。分析還揭示了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中主要的免疫抑制微環(huán)境驹针。重要的是，發(fā)現(xiàn)了多種雜合腫瘤細胞狀態(tài)诀艰，包括雜合腫瘤和免疫細胞的一個子集柬甥。通過整合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學分析，描述了不同cluster的分布及其在單個腫瘤中的相互作用其垄】疗眩總之，分析工作提供了 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分的單細胞圖譜和空間分布捉捅。

RESULTS

A Single-Cell Transcriptome Atlas of Human Primary SCLC Tumors

為了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的異質(zhì)細胞成分及其空間分布撤防，共收集了 12 名接受手術(shù)的 SCLC 患者的 12 個原發(fā)性腫瘤。首先棒口，對 7 個 SCLC 進行了 scRNA-seq 分析寄月，包括 3 個化療治療的腫瘤和 4 個未治療的腫瘤。為了識別每個腫瘤中的稀有細胞亞群无牵，對每個腫瘤平均約 13,800 個單細胞進行了測序漾肮，在所有腫瘤中總共有 81,841 個高質(zhì)量細胞。通過無監(jiān)督聚類分析茎毁，確定了 27 個不同的細胞clusters克懊，包括腫瘤細胞忱辅、白細胞、基質(zhì)成纖維細胞和內(nèi)皮細胞谭溉。進一步推斷每個clusters的拷貝數(shù)改變（CNV）墙懂，以區(qū)分腫瘤和非腫瘤細胞。因此扮念，基于推斷的CNV和典型細胞類型標志物的表達损搬，15個clusters被定義為腫瘤細胞，而9個clusters和3個clusters分別被分類為白細胞和基質(zhì)細胞柜与。值得注意的是巧勤，觀察到大量腫瘤細胞同時表達 ASCL1 和 NEUROD1，表現(xiàn)出 SCLC-A 和 SCLC-N 亞型之間混合狀態(tài)的特征弄匕。此外颅悉，在腫瘤微環(huán)境 (TME) 中鑒定出三種主要類型的基質(zhì)細胞，包括 FAP⁺ ACTA2⁺ 肌成纖維細胞迁匠、MCAM⁺ ACTA2⁺ 血管周圍樣細胞和 PECAM1⁺ CD34⁺ 內(nèi)皮細胞剩瓶。此外，在 7 個 SCLC 中觀察到廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性柒瓣。值得注意的是儒搭，發(fā)現(xiàn) SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中浸潤的免疫細胞、基質(zhì)成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的數(shù)量相對較低芙贫。此外搂鲫，觀察到與未治療的腫瘤相比，化療治療的腫瘤中浸潤的免疫細胞和基質(zhì)細胞的比例相對較低磺平，表明化療可能會重塑 SCLC 微環(huán)境魂仍。

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Spatial Transcriptomic Landscape of Cellular Components in SCLC Ecosystems

為了探索不同細胞成分的空間定位及其相互作用，接下來對 8 個經(jīng)免疫組織化學驗證的人類 SCLC 腫瘤進行了空間轉(zhuǎn)錄組學分析拣挪，包括 6 個 SCLC-A擦酌、1 個 SCLC-N 和 2 個 SCLC-P 腫瘤。 值得注意的是菠劝，8 個腫瘤中的 3 個（LC-250赊舶、LC-251 和 LC-51）通過 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學進行了測序。 共捕獲了來自 8 個腫瘤的 16,853 個spot赶诊，對其進行測序并分組為 17 個clusters笼平。 接下來，探索了每個腫瘤內(nèi)單個亞群的空間分布舔痪。 分析進一步揭示了 SCLC 廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性寓调。 因此，隨后分別分析了單個腫瘤的空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)锄码。

例如夺英，在 LC-251 中識別出 8 個空間spot clusters晌涕，包括 5 個腫瘤細胞clusters（clusters 1、4痛悯、5余黎、7 和 8）和 3 個基質(zhì)細胞clusters（clusters 2、3 和 6）灸蟆。 我們觀察到clusters 1驯耻、4 和 5 位于組織中心，而clusters 7 位于 LC-251 組織內(nèi)的組織邊緣炒考。 通過query每個clsuters的差異基因表達，發(fā)現(xiàn)clusters 4 顯示 H3F3A霎迫、HMGN2 和 TXN 的高表達斋枢，而clusters 7 顯示 SFTPC 和 NAPSA 的高表達。 重要的是知给，觀察到clusters 7 表達 SCLC 和肺腺癌 (LUAD) 的標志物瓤帚，顯示出混合轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的特征。 此外涩赢，發(fā)現(xiàn)clusters 5 表現(xiàn)出高表達的基質(zhì)細胞標志物戈次，如 COL4A1、SPARC筒扒、ESM1 和 RGS5怯邪。 同樣，在 LC-51 組織中也發(fā)現(xiàn)了混合 SCLC/LUAD 細胞.

接下來花墩，檢查了 SCLC 組織內(nèi)基質(zhì)細胞和免疫細胞的空間分布悬秉。在 LC-251 組織中，觀察到基質(zhì)細胞（clusters 2 和 3）圍繞并分離不同的腫瘤細胞clusters冰蘑。 此外和泌，CD45⁺免疫細胞往往在組織內(nèi)分布稀疏，多為耗竭的CD8⁺ T細胞和M2巨噬細胞祠肥，表明存在免疫抑制微環(huán)境武氓。 據(jù)我們所知，這是第一個使用高分辨率轉(zhuǎn)錄組學探索人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分空間結(jié)構(gòu)的分析仇箱。 結(jié)果不僅揭示了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的程度县恕，而且還提供了 SCLC 腫瘤內(nèi)不同細胞類型及其分子特征的空間分布.

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Immune Cell Landscape and Spatial Distribution in SCLC Ecosystems

人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中浸潤的白細胞和基質(zhì)細胞的多樣性和轉(zhuǎn)錄組學特征相對尚未探索。在這項研究中工碾，通過 scRNA-seq 共鑒定出 14,755 個浸潤性白細胞弱睦。觀察到 7 個 SCLC 中免疫細胞的高腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。例如渊额，LC-242 和 LC-254 腫瘤的免疫細胞浸潤相對較高况木，而 LC-51 和 LC-255 腫瘤浸潤較低垒拢。進一步將所有免疫細胞重新聚集成 23 個亞群。根據(jù)典型標記的表達火惊，大多數(shù)亞群可定義為 CD4 T 細胞求类、CD8 T 細胞、NKT 細胞屹耐、漿細胞和 B 細胞尸疆、類胰蛋白酶 + 肥大細胞、漿細胞樣樹突狀細胞 (pDC) 和單核細胞/巨噬細胞惶岭。然而寿弱，觀察到 5 個亞群（clusters 7、11按灶、12症革、13 和 22）也表達上皮細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的標志物，例如 EPCAM鸯旁、INSM1 和 ASCL1噪矛，顯示出雜合腫瘤和免疫細胞的特征。值得注意的是铺罢，腫瘤細胞上免疫細胞標志物的陽性表達已在幾種癌癥中得到描述.

接下來艇挨，對 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的 T 細胞亞群進行了表征。對于 CD4⁺ T 細胞韭赘，cluster 8 代表以高表達 FOXP3 為特征的調(diào)節(jié)性 T 細胞缩滨，cluster 9 代表顯示高水平 CXCL13、NR3C1 和 FKBP5 的濾泡輔助 T 細胞辞居，而cluster 3 指顯示高水平 IL7R 和 BTG1 的細胞毒性 T 細胞.關(guān)于 CD8⁺ T 細胞楷怒，cluster 6、17 和 19 代表具有高表達 GZMK瓦灶、CCL5鸠删、NKG7 和 GZMA 的細胞毒性 T 細胞，而cluster 10 表達高水平的 GNLY 和 KLRD1贼陶，代表 NKT 細胞刃泡。此外，發(fā)現(xiàn)cluster 16 包含 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 細胞碉怔，并表現(xiàn)出 MKI67 和 ASPM 基因的高表達烘贴，代表增殖 T 細胞亞群。重要的是撮胧，發(fā)現(xiàn)大多數(shù) T 細胞表現(xiàn)出與免疫檢查點基因相關(guān)的陽性表達T 細胞耗竭桨踪，如 PDCD1、CTLA4芹啥、TIGIT锻离、LAG3 和 HAVCR2铺峭，表明免疫抑制微環(huán)境在 SCLC 微環(huán)境中占主導地位。

以前汽纠，已觀察到 T 細胞和巨噬細胞是 SCLC 中最豐富的浸潤免疫細胞卫键，而通過免疫組織化學分析評估 B 細胞是稀疏的。 在這里虱朵，發(fā)現(xiàn)浸潤的 B 細胞的比例與 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的 T 細胞和骨髓細胞相當莉炉，但大多數(shù) B 細胞是漿細胞并且表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。 發(fā)現(xiàn)漿細胞的特征是 IGKC碴犬、IGHG1 和 MZB1 的高表達絮宁，而 CD20⁺ B 細胞的特征是 BANK1 和 CD37 的高表達。 此外服协，發(fā)現(xiàn) CD20⁺ B 細胞群由活化的 (CD19⁺ CD20⁺ CD69⁺ CD27⁺) 和耗盡的 (CD19⁺ CD20⁺ CD69⁺ CD27-) 細胞組成羞福。 通過差異表達基因的功能注釋，觀察到抗原加工和呈遞是 CD20⁺ B 細胞中最豐富的途徑之一蚯涮。此外，觀察到血漿和 CD20⁺ B 細胞在組織內(nèi)分布稀疏 卖陵。

此外遭顶，確定了 4 個骨髓細胞亞群。 cluster 5 代表以 APOE泪蔫、APOC1 和 SPP1 高表達為特征的 C1QB⁺ 巨噬細胞棒旗，而cluster 15 代表 FCN1⁺ 單核細胞，顯示 S100A9撩荣、LYZ 和 CST3 的高表達铣揉。 此外，觀察到cluster 23 代表高表達 TPSB2 和 TPSAB1 的肥大細胞亞群餐曹，而cluster 21 代表高表達 IRF7 和 GZMB 的 pDC逛拱。 此外，觀察到大多數(shù)巨噬細胞表現(xiàn)出 CD163台猴、LAIR1朽合、HAVCR2、LGALS9饱狂、VSIR 和 LAG3 的高表達曹步，表明免疫抑制性 M2 巨噬細胞在 SCLC TME 中占優(yōu)勢。最后休讳，觀察到巨噬細胞占優(yōu)勢并且主要分布在 LC 的基質(zhì)內(nèi) -251 和 LC-29 腫瘤讲婚。 總之，分析提供了浸潤免疫細胞的單細胞圖譜及其在人類 SCLC 微環(huán)境中的空間分布俊柔。

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Landscape of Stromal Fibroblasts and Endothelial Cells in SCLC Ecosystems

癌癥相關(guān)成纖維細胞 (CAF) 是 TME 的主要組成部分筹麸，已被證明在腫瘤的發(fā)生和進展中起關(guān)鍵作用活合。然而，關(guān)于 CAF 的類別及其在 SCLC 中的功能作用知之甚少。在這里腿箩，通過 scRNA-seq 共鑒定出 3,145 個 CAF第岖，將其分為 15 個亞群。此外侵续，在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中揭示了 5 個成纖維細胞狀態(tài)（這個地方的方法還是要注意一下）。 S1 CAF 類似于血管周圍樣細胞憨闰，顯示出 MCAM 和 ACTA2 的高表達状蜗，富含粘著斑、cGMP-PKG 信號傳導和血管平滑肌收縮通路鹉动。 S2 CAF 代表以 FAP 和 PDGFRA 高表達為特征的肌成纖維細胞轧坎，富含 ECM-受體相互作用和粘著斑通路。重要的是泽示，S3缸血、S4 和 S5 成纖維細胞類似于經(jīng)歷 EMT 程序的腫瘤細胞，共表達間充質(zhì)細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的標志物械筛，包括 ACTA2捎泻、INSM1、ASCL1 和 GRP埋哟。因此笆豁，可以將成纖維細胞分為三種主要亞型，包括 FAP⁺ 肌成纖維細胞赤赊、MCAM⁺ 血管周圍樣細胞和 EPCAM⁺ 成纖維細胞闯狱。已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)抗原呈遞和炎癥性 CAF。有趣的是抛计，發(fā)現(xiàn)一部分 EPCAM⁺ CAFs 也表達免疫細胞的標志物哄孤，例如第 3 clusters中 CD24、IGHG2 和 IGLC2 的高表達爷辱，以及第 13 clusters中 IGHG1录豺、IGHG4 和 MZB1 的高表達》构總的來說双饥，研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中 CAF 的單細胞圖譜，并強調(diào) EPCAM⁺ CAF 最有可能來自經(jīng)歷過 EMT program的腫瘤細胞弟断。

此外咏花，在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中確定了總共 1,308 個血管內(nèi)皮細胞 (ECs)，其中包含 10 個亞群，可分為 3 個狀態(tài)昏翰。 S1 ECs 類似于腫瘤內(nèi)皮細胞苍匆，共表達內(nèi)皮細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標志物，如 PECAM1棚菊、ASCL1 和 GRP浸踩。 S2 ECs表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞的典型特征，表達高水平的MCAM统求、ANGPT2和ESM1检碗，而S3 ECs表現(xiàn)出高表達VWF、ACKR1码邻、HLA-DRB5和RGS5折剃。 值得注意的是，據(jù)報道像屋，非神經(jīng)內(nèi)分泌 SCLC 細胞在轉(zhuǎn)錄上準備好進行血管模擬并表達假性缺氧的基因表達譜怕犁。 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明己莺，SCLC 細胞誘導血管生成以支持其快速生長的機制之一可能是通過腫瘤-內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化奏甫。 最后，強調(diào)了基質(zhì)細胞的異質(zhì)性及其在人類 SCLC 組織中的空間定位凌受。

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Hybrid Tumor Cells with Multiple Cell Lineage Features Revealed in Human SCLCs

在這項研究中扶檐，通過 scRNA-seq 共鑒定出 62,633 個腫瘤細胞，占 7 個 SCLC ecosystems中所有細胞成分的約 77%胁艰。進一步將這些腫瘤細胞重新聚集成 26 個亞群，這些亞群在組織和腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性智蝠。觀察到大多數(shù)亞群同時表達 ASCL1 和 NEUROD1腾么，顯示出混合 SCLC-A/N 亞型的特征。還觀察到一個 YAP1⁺ 細胞亞群（cluster 21 ）顯示高表達 LUAD 標記杈湾，如 NAPSA解虱、SFTPB 和 SCGB3A1。此外漆撞，觀察到一些 POU2F3⁺ 腫瘤細胞殴泰，它們稀疏地分布在多個clusters中。值得注意的是浮驳，除了混合 SCLC-A/N 細胞外悍汛，還鑒定了多種其他混合腫瘤細胞狀態(tài)，包括混合上皮/間充質(zhì) (E/M) 細胞至会、SCLC/LUAD 細胞和腫瘤/免疫細胞离咐。例如，我們觀察到clusters 21、16宵蛀、11昆著、17、25 和 8 中的細胞顯示混合 E/M 特征术陶，共表達上皮和間充質(zhì)標志物凑懂。有趣的是，具有 EMT 特征的細胞子集也表達了 LUAD 標記梧宫，尤其是在 LC-51 樣本中接谨，這表明混合 SCLC/LUAD 細胞可能會經(jīng)歷 EMT 程序。此外祟敛，發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細胞表現(xiàn)出高表達的免疫細胞標志物（CD45疤坝、CD27 和 HLA-DRA），表現(xiàn)出混合腫瘤/免疫特征馆铁。重要的是跑揉，通過流式細胞術(shù)分析證實了幾種人類 SCLC 細胞系中存在表達免疫細胞標志物的腫瘤細胞。

最近埠巨，在具有非神經(jīng)內(nèi)分泌特征且與對免疫檢查點阻斷劑 (ICB) 的持久反應相關(guān)的一部分 SCLC 中觀察到高 MHC I 表達历谍，這表明 MHC I 可用作 SCLC 患者免疫反應的預測生物標志物。 在這里辣垒，觀察到編碼 MHC I 分子（HLA-A望侈、HLA-B 和 HLA-C）的基因在幾乎所有 SCLC 腫瘤細胞中的陽性表達。 有趣的是勋桶，發(fā)現(xiàn)編碼 MHC II 分子（HLA-DRA 和 HLA-DRB1）的基因的表達也在 21脱衙、16、17例驹、11捐韩、8 和 12 clusters中上調(diào)。MHC II 分子通常在professional抗原-呈遞細胞鹃锈，例如 DC荤胁、單核細胞和 B 細胞。 總的來說屎债，這些發(fā)現(xiàn)表明大多數(shù)雜交腫瘤/免疫細胞也表現(xiàn)出 EMT 和/或雜交 SCLC/LUAD 細胞特征仅政，并且可能對 ICB 治療更敏感。 同樣盆驹，還鑒定了表達內(nèi)皮細胞標志物的腫瘤細胞亞群圆丹，例如 PECAM1、CDH5 和 CD34躯喇。

最后运褪，空間轉(zhuǎn)錄組學分析表明，混合 SCLC/LUAD 細胞主要位于 LC-251 組織內(nèi)的腫瘤邊緣，而它們位于 LC-51 組織的中心秸讹。 LC-4腫瘤中的雜交SCLC-A/SCLC-P細胞和LC-29腫瘤中的雜交SCLC-P/SCLC-Y細胞在組織內(nèi)隨機分布檀咙。 總之，分析揭示了人類 SCLC 中的多個雜交腫瘤細胞璃诀。

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Trajectory Analysis Reveals Cell of Origin of Hybrid SCLC Cells

為了追蹤 SCLC ecosystems中腫瘤細胞的進化弧可，對所有腫瘤細胞進行了軌跡分析。確定了 6 個分支和 9 個細胞states劣欢。觀察到分支 1 由states 1棕诵、2、3 和 4 細胞組成凿将，而分支 2校套、3、4牧抵、5 和 6 分別由states 9笛匙、8、7犀变、5 和 6 細胞組成妹孙。值得注意的是，分支 5 和分支 6 中的細胞主要來源于 LC-255 腫瘤获枝，表明存在更多分化states蠢正。觀察到進化軌跡從states 1 細胞開始。隨著時間的推移省店，其他 8 個states的細胞沿著軌跡進化嚣崭。在 SCLC 細胞的進化過程中觀察到了 4 個分支點，它們都可以成功分化成不同的分支懦傍。此外有鹿，分析了隨偽時間變化的 SCLC 和 LUAD 的規(guī)范標記的表達。在軌跡開始時觀察到 ASCL1谎脯、NEUROD1 和 INSM1 的最低表達（states 1），而這些基因的表達隨著時間的推移逐步增加持寄。相比之下源梭，發(fā)現(xiàn) LUAD 和間充質(zhì)標志物（NAPSA、SFTPC稍味、VIM）的表達隨著偽時間逐步降低废麻。一致地，觀察到states 1 細胞顯示混合 SCLC/LUAD 細胞的特征模庐，而states 9 細胞代表混合 SCLC-A/SCLC-N 細胞烛愧，表明 LUAD 和 SCLC 之間存在潛在的細胞譜系轉(zhuǎn)變。總之怜姿，研究結(jié)果表明慎冤，一種潛在的雜交腫瘤細胞起源細胞，例如雜交 SCLC/LUAD 細胞沧卢，可能源自 LUAD 細胞譜系蚁堤。

SCLC-P 亞型約占所有 SCLC 的 15%，被認為是一種具有更強侵襲性的非神經(jīng)內(nèi)分泌型但狭。據(jù)報道披诗，一些 SCLC-P 腫瘤可能起源于肺上皮中的稀有簇狀細胞，并表達簇狀細胞的典型標志物立磁，如 POU2F3呈队、ASCL2 和 AVIL。然而唱歧，這種亞型的細胞起源尚未得到很好的定義宪摧。在本研究中，鑒定了多種混合 SCLC-P 細胞迈喉，例如 LC-4 腫瘤中的混合 SCLC-A/SCLC-P 細胞和 LC-29 腫瘤中的混合 SCLC-P/SCLC-Y 細胞绍刮。為了揭示 SCLC-P 亞型的新起源細胞，研究了這些腫瘤中腫瘤細胞的進化挨摸。軌跡分析揭示了 LC-29 腫瘤中的 3 個分支和 3 個細胞狀態(tài)孩革。軌跡根從state 1 細胞開始，該細胞由來自cluster 6 的細胞組成得运，其特征是 LUAD 標記的高表達膝蜈，例如 NAPSA、SFTPC熔掺。隨著時間的推移饱搏，腫瘤細胞分化為 2 個分支，其中分支 2 富含來自cluster 2 和 7 的細胞置逻，而分支 3 富含來自cluster 1推沸、2、3券坞、4鬓催、5 和 8 的細胞。值得注意的是恨锚，觀察到LUAD標志物的表達減少宇驾，而POU2F3、YAP1猴伶、ASCL2和MYC的表達在分支1到分支3的轉(zhuǎn)變過程中增加课舍。此外塌西，發(fā)現(xiàn)LC-29腫瘤表達相對較高水平的KRT5、KRT8和NKX2-1基因.總之筝尾，這些發(fā)現(xiàn)表明 SCLC-P 亞型可能起源于肺上皮細胞中的多種細胞類型捡需，例如角蛋白 + 基底細胞、肺泡細胞和 LUAD 細胞的轉(zhuǎn)化忿等。根據(jù)這一假設栖忠，最近在轉(zhuǎn)化的 SCLC 的研究中揭示了 SCLC-P 的簇細胞非依賴性起源。

此外贸街，我們在 LC-4 腫瘤中鑒定了 4 個分支和 5 個細胞狀態(tài)庵寞。 基于每個clusters的組織學特征和基因表達特征，我們將cluster 3 定義為相鄰的正常肺細胞薛匪，將cluster 2 和 5 定義為基質(zhì)細胞捐川，將cluster 1、4逸尖、6 和 7 定義為腫瘤細胞古沥。 因此，觀察到軌跡根起源于狀態(tài) 1 細胞娇跟，其中填充了來自cluster 1 和 7 的腫瘤細胞岩齿，并且以非神經(jīng)內(nèi)分泌標志物（包括 ASCL2 和 POU2F3）的高表達為特征。 隨著時間的推移苞俘，腫瘤細胞可以分化為states 4 和 5盹沈，它們由來自cluster 4 和 6 的細胞組成，并顯示出神經(jīng)內(nèi)分泌標志物的高表達吃谣。 因此乞封，可以看到 LC-4 腫瘤內(nèi)從 SCLC-P 到 SCLC-A 亞型的轉(zhuǎn)變，從cluster 1 開始岗憋，到cluster 4 和 6 結(jié)束肃晚。這些發(fā)現(xiàn)表明，SCLC-P 細胞可能分化為 混合 SCLC-A/SCLC-P 細胞仔戈。

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Exploration of Cellular Crosstalk in SCLC Ecosystems

最后关串，為了確定驅(qū)動腫瘤異質(zhì)性的分子機制，特別是雜交腫瘤細胞的發(fā)展监徘，分析了 7 個 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中所有 27 個細胞成分之間的配體-受體相互作用晋修。 因此，共鑒定了 34,546 對配體-受體相互作用耐量。 值得注意的是，觀察到腫瘤和免疫細胞之間的大量相互作用滤港。 骨髓細胞表現(xiàn)出最大數(shù)量的相互作用對廊蜒。 骨髓和腫瘤細胞之間的大多數(shù)相互作用是由與免疫反應和細胞外基質(zhì)相關(guān)的分子介導的趴拧，例如 CD74-MIF/COPA/APP、HLA-DPB1-TNFSF13B/NRG1 和 SPP1-CD44 對山叮，以及由趨化因子介導 及其受體著榴，例如 CCL3-IDE、CCL2-CCR10 和 CXCL8-ACKR1 對屁倔。 此外脑又，觀察到 T 細胞和腫瘤細胞之間的幾種已知抑制性相互作用，例如 TIGIT-NECTIN2/NECTIN3 和 PDCD1-CD274/PDCD1LG2 對锐借。據(jù)報道问麸，CAFs 可以分泌多種趨化因子和生長因子，從而能夠重塑 TME 并調(diào)節(jié)腫瘤進展钞翔。 在這里严卖，觀察到 CAF 和腫瘤細胞之間的廣泛相互作用，其中大部分是由趨化因子和免疫相關(guān)分子介導的布轿，例如 TIMP1-FGFR2 和 HLA-C-FAM3C 對哮笆。 同樣，揭示了內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞之間的相互作用汰扭，包括 CD74-MIF 和 NRP1-VEGFB 對稠肘。

重要的是，確定了雜交腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的多種相互作用萝毛。例如项阴，發(fā)現(xiàn)雜交 SCLC/LUAD 細胞（cluster 7 ）和骨髓細胞之間的相互作用是由 CD74-MIF/COPA、C5AR1-RPS19 和 SPP1-CD44 對介導的珊泳，而雜交腫瘤/免疫細胞之間的相互作用（cluster 9 ）和 FAP⁺CAFs（cluster 14）由趨化因子鲁冯、Notch 配體及其各自的受體介導，表明基質(zhì)細胞可能通過增強細胞間通訊來驅(qū)動這些雜交腫瘤細胞的發(fā)育色查。最后薯演，還展示了組織內(nèi)不同細胞類型之間的細胞間通訊。例如秧了，探索了基質(zhì)細胞（cluster 2跨扮、3 和 6 ）與腫瘤細胞之間的相互作用，尤其是 LC-251 腫瘤內(nèi)的混合 SCLC/LUAD 腫瘤細胞（cluster 7）验毡。觀察到CD74在基質(zhì)細胞中的表達相對較高衡创，而COPA、APP和MIF的表達水平在腫瘤細胞中相對較高晶通×猓總之，工作代表了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分之間的細胞間通訊的第一步狮辽，并提供了在 SCLC 進展過程中由配體-受體相互作用介導的細胞串擾網(wǎng)絡一也。

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DISCUSSION

了解驅(qū)動腫瘤異質(zhì)性和進展的細胞和分子機制對于開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要巢寡。單細胞 RNA-seq 已被用于分析 SCLC 的腫瘤異質(zhì)性。然而椰苟，這些研究并未提供人類原發(fā)性 SCLC 微環(huán)境中所有細胞成分及其空間結(jié)構(gòu)的綜合單細胞圖譜抑月。特別是免疫和基質(zhì)細胞的景觀尚未得到徹底研究。在這里舆蝴，邁出了第一步谦絮，通過使用 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)剖析人類 SCLC 的復雜生態(tài)系統(tǒng)。 SCLC的特點是免疫細胞浸潤低的免疫性冷腫瘤洁仗。因此层皱，研究還揭示了 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中免疫細胞的低浸潤。然而京痢，數(shù)據(jù)揭示了腫瘤和組織內(nèi)浸潤的免疫細胞的多樣性和異質(zhì)性奶甘，以及它們的轉(zhuǎn)錄特征。重要的是祭椰，工作表明臭家，由耗盡的 T 細胞和 M2 巨噬細胞介導的免疫抑制微環(huán)境在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中占主導地位。此外方淤，探索了 SCLC 組織內(nèi)不同免疫亞群的空間分布钉赁，并表明大多數(shù)免疫細胞稀疏地定位于 SCLC 組織內(nèi)。

此外携茂，研究揭示了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中基質(zhì)成纖維細胞的廣泛異質(zhì)性你踩，因為確定了 15 個 CAF 亞群。值得注意的是讳苦，鑒定了一部分 EPCAM⁺ 成纖維細胞带膜，它們可能是接受了 EMT 程序的腫瘤細胞。最近鸳谜，CD105 已被用作定義基質(zhì)成纖維細胞的標志物膝藕，CD105 成纖維細胞能夠促進胰腺癌的抗腫瘤免疫。在目前的研究中咐扭，發(fā)現(xiàn) MCAM 可以區(qū)分 SCLC 中的成纖維細胞芭挽。 MCAM⁺ 成纖維細胞表現(xiàn)出 RGS5、COX4I2 和 FAM162B 的高表達蝗肪，而 MCAM-CAF 表現(xiàn)出細胞外基質(zhì)成分（如 FAP袜爪、PDGFRA 和 PDPN）的高表達。據(jù)報道薛闪，F(xiàn)AP⁺ CAF 與多種癌癥中的免疫抑制微環(huán)境有關(guān)辛馆。此外，CAF 中的 PDPN 表達與肺腺癌疾病復發(fā)風險增加有關(guān)豁延。因此昙篙，我們的研究結(jié)果表明倔韭，這些 MCAM 成纖維細胞可能有助于 SCLC 的免疫抑制微環(huán)境。

最近瓢对，在對 38 個 SCLC CDX 模型的分析中發(fā)現(xiàn)了一種新的 ATOH1⁺ SCLC 亞型。還鑒定了具有干細胞樣特征的新型 PLCG2⁺ SCLC 細胞亞群胰苏，并與耗盡的 CD8⁺ T 細胞和免疫抑制性骨髓細胞群相關(guān)硕蛹。有趣的是，本研究揭示了多個混合 SCLC 細胞亞群硕并。腫瘤細胞的混合或中間狀態(tài)已在癌癥中廣泛報道法焰，例如混合 E/M 細胞。此外倔毙，雜交內(nèi)皮/間充質(zhì)和雜交腫瘤/內(nèi)皮細胞也已在癌癥中發(fā)現(xiàn)埃仪。最近，通過單細胞測序在幾種癌癥中發(fā)現(xiàn)了雜交腫瘤細胞陕赃。 SCLC 的表型可塑性已被認為是 SCLC 細胞變得更具攻擊性的一種機制卵蛉。例如，在人類 SCLC 中揭示了 SCLC-A 和 SCLC-N 之間的中間狀態(tài)么库。此外傻丝，通過批量和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的原型分析揭示了 SCLC 亞型之間的連續(xù)塑性細胞狀態(tài)。此外诉儒，在少數(shù)肺部腫瘤中發(fā)現(xiàn)了聯(lián)合 SCLC 和 NSCLC葡缰。例如，從 NSCLC 向 SCLC 的轉(zhuǎn)化已成為驅(qū)動免疫檢查點抑制劑耐藥的機制之一忱反。根據(jù)這些觀察結(jié)果泛释，我們還剖析了 SCLC 細胞的表型可塑性，例如在異源 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中存在多個雜交 SCLC 細胞温算，指的是具有多種細胞譜系特征的腫瘤細胞怜校。

例如，發(fā)現(xiàn)了幾種新型雜交細胞米者，包括雜交 SCLC/LUAD 和雜交腫瘤/免疫細胞韭畸。最近，已經(jīng)在鼻咽癌蔓搞、皮膚鱗狀細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了表達免疫特征的腫瘤細胞胰丁。例如，在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)了表達腫瘤和免疫細胞雙重標志物（EPCAM喂分、MHC-II 和補體基因）的腫瘤細胞亞群锦庸，并觀察到其具有增加的致瘤特性并與不良預后相關(guān)。此外蒲祈，據(jù)報道甘萧，腫瘤細胞與白細胞的融合有助于腫瘤異質(zhì)性和增加的轉(zhuǎn)移行為萝嘁。然而，據(jù)我們所知扬卷，顯示出免疫特征的 SCLC 細胞尚未在其生態(tài)系統(tǒng)中被描述牙言。觀察到幾個腫瘤細胞亞群共表達免疫細胞（CD45 和 CD27）和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞（INSM1 和 ASCL1）的標志物。因此怪得，假設這些混合腫瘤/免疫細胞更可能是具有免疫細胞特征的腫瘤細胞咱枉。然而，這些雜交細胞的生物學作用需要在未來的研究中確定徒恋。

我們的研究提供了幾個新發(fā)現(xiàn)蚕断。首先，這是人類初級 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分及其空間分布的第一個單細胞轉(zhuǎn)錄組景觀入挣。其次亿乳，本研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中不同浸潤性免疫細胞、基質(zhì)成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的全面視圖和分子特征径筏。第三葛假，我們確定了 SCLC 細胞的多種雜交狀態(tài)，從雜交 SCLC 亞型滋恬、雜交 SCLC/LUAD 到雜交腫瘤/免疫細胞桐款，表明 SCLC 細胞的動態(tài)進化發(fā)生在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中。第四夷恍，還揭示了這些雜合 SCLC 細胞的進化以及 SCLC-P 亞型的新潛在細胞來源魔眨。最后，這項研究全面了解了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分內(nèi)部和細胞之間的細胞間通訊酿雪，為針對這些相互作用進行 SCLC 治療提供了理論依據(jù)遏暴。鑒于 SCLC 的異質(zhì)性，未來的研究將需要整合更多的 SCLC 樣本并結(jié)合更高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)指黎。確定我們已經(jīng)確定的腫瘤細胞狀態(tài)的各種混合狀態(tài)的功能作用和臨床相關(guān)性也至關(guān)重要朋凉。總之醋安，本研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細胞成分及其空間分布的綜合單細胞圖譜杂彭，揭示了組織和腫瘤內(nèi)腫瘤、免疫和基質(zhì)細胞的廣泛異質(zhì)性吓揪，并深入了解了它們的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)亲怠。研究還揭示了人類 SCLC 中的多種雜交腫瘤細胞狀態(tài)，表明靶向這些雜交腫瘤細胞可以為 SCLC 患者的下一代治療策略奠定基礎(chǔ)柠辞。

Methods（關(guān)注一些重點方法）

Cell-cell interaction analysis

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Copy-number variation analysis

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