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1，首先需要得到待克隆的基因的CDS序列衙传，上游UTR約250bp决帖，下游UTR約250bp。將上游250bp和CDS序列和下游250bp拼起來粪牲，ctrl+C復(fù)制古瓤。
2，打開Primer Premier 5軟件（自行激活）腺阳，選擇DNA Sequence落君。
3，把序列粘貼到空白面板處亭引，彈出的框框直接點OK绎速。
4，再點Primer焙蚓。
5纹冤，在彈出的框框中點search。
6购公，彈出這么一個框框萌京，因為用上下游各250bp的UTR作為正/反向引物設(shè)計，所以正向引物Sense Primer的位置是1到250宏浩。我的這個基因兩個UTR和CDS加起來的整體的長度是1935bp知残，所以反向引物的位置是在1685到1935。最后一個是PCR產(chǎn)物的大小比庄，我的CDS長度是1353求妹，所以就是1353到1953乏盐。
7，點OK制恍，OK父能。又彈出這么一個框框。一般對前5個結(jié)果進行挑選净神。
8何吝，以第二個結(jié)果為例，點一下之后强挫，回到這個框框中岔霸，點左邊的S薛躬，代表Sense正向俯渤，再點Edit Primers。
9型宝，彈出這么的框框八匠，可以看長度，Tm值和GC含量趴酣，底下還能看引物是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)梨树，引物二聚體，錯配岖寞÷账模可以在那個小框里自行調(diào)整序列，比如我喜歡長一點的仗谆，我調(diào)整到19~25bp指巡，前后都可以根據(jù)自己的序列進行加減微調(diào)堿基，再點右邊的Analysis信息就會更新隶垮。三個只紅了一個錯配藻雪，還行。那我就挑選這個序列作為正向引物了狸吞，選中復(fù)制粘貼就行勉耀。
10，接下來就是回到第8步蹋偏，點A便斥，代表Anti反向。一樣的操作威始。一對引物的Tm值和長度要相近枢纠。復(fù)制粘貼這段序列就行，它會自行從5’端開始的字逗。一定要把信息記錄好京郑，將序列信息發(fā)給公司合成引物就行了宅广。
11，公司送到引物后些举，就可以做PCR跟狱，一般是連T載，轉(zhuǎn)大腸桿菌户魏，然后涂板挑點搖菌驶臊，菌落PCR出來單條帶就可以送樣測序了。因為公司測序前后50bp都是不準的叼丑，且單端測序只能測約800bp关翎，這種方法可以確認基因的全長，尤其是基因的兩端鸠信，往后就可以設(shè)計含同源臂的引物再連接各種載體了纵寝。引物設(shè)計還可以用NCBI網(wǎng)站，具體教程百度即可星立。
12爽茴，再次感謝我漂亮的吳師姐~
