1. PGAM5 deletion leads to accelerated cell senescence
為了明確小鼠aging和線粒體融合/分裂之間的關(guān)系芦鳍，作者首先構(gòu)建了Pgam5的敲除鼠（a-c）丹喻。敲除鼠體重明顯減輕悼瓮，其中約50%出現(xiàn)駝背吹散，25%出現(xiàn)不明原因死亡（d）。敲除鼠細(xì)胞出現(xiàn)衰老時(shí)會(huì)出現(xiàn)的細(xì)胞面積增大(e)污朽，p-rH2AX表達(dá)也增加髓介，提示DNA損傷(f, g)，并出現(xiàn)核破裂箱硕。皮膚細(xì)胞也觀察到類似的現(xiàn)象(j)拴竹。衰老標(biāo)志物：macroH2A和P16Ink4az\在敲除鼠的RPE細(xì)胞中也顯著增加（h-j）。Il6, Mmp3和Tnfa的升高及Lamin B1的降低提示SASP颅痊，這些指標(biāo)的變化在敲除鼠中也檢測(cè)到(k-m)殖熟。
隨后作者使用了兩種獨(dú)立的PGAM5-/-的ARPE-19細(xì)胞系在體外驗(yàn)證了其衰老表型
2. PGAM5 deletion induces changes in mitochondrial dynamics
隨后作者檢測(cè)了PGAM5敲除對(duì)線粒體表型的影響。作者發(fā)現(xiàn)PGAM5敲除后斑响，線粒體長(zhǎng)度增加(a)菱属。此前有文獻(xiàn)報(bào)道，PGAM5可以去磷酸化Drp1 (Ser-637)舰罚，調(diào)控線粒體分裂纽门。作者發(fā)現(xiàn)PGAM5敲除后Drp1磷酸化增加，提示線粒體分裂減少(b)营罢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道赏陵，PGAM5有l(wèi)ong 和 short forms饼齿，也就是full-length 和 cleaved forms。Cleaved PGAM5保留了其磷酸化結(jié)構(gòu)域蝙搔，并且可以被釋放到線粒體去與Axin1結(jié)合缕溉。此外，Drp1-Ser-637的去磷酸化對(duì)其與線粒體的結(jié)合非常重要吃型。因此证鸥，作者假設(shè)cleaved PGAM5可以與Axin1結(jié)合并招募Drp1，從而引起線粒體分裂勤晚。作者發(fā)現(xiàn)ARPE-19細(xì)胞中全長(zhǎng)和剪切的PGAM5都存在枉层，且給予CCCP（氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑）后，剪切的PGAM5減少赐写，Drp1-637磷酸化也減少（c）鸟蜡。使用Axin1可以IP下來(lái)Drp1和cleaved PGAM5，證明他們存在結(jié)合(d)挺邀。
由于Drp-1介導(dǎo)的線粒體分裂是線粒體穩(wěn)態(tài)所必須的揉忘，作者假設(shè)PGAM5下降可以引起線粒體turnover的下降。線粒體外膜蛋白Tom20端铛，內(nèi)膜相關(guān)蛋白cytochrome C癌淮，基質(zhì)蛋白CYPF在PGAM5?/?的 ARPE-19 中都增加(e)，mtDNA的拷貝數(shù)也增加(f)沦补。在PGAM5?/?小鼠的RPE/choroid tissue中，CYPD同樣上升咪橙，提示線粒體mass的增加(g)夕膀。此外，作者檢測(cè)了PGC1α (a critical co-transcriptional regulator for mitochondrial biogenesis)的表達(dá)美侦，發(fā)現(xiàn)PGAM5敲除后PGC1α 表達(dá)下降产舞，提示PGAM5敲除引起的線粒體mass增加不是mitochondrial biogenesis增加引起的(e)。作者還使用了MitoTimer來(lái)檢測(cè)線粒體turnover菠剩，同樣發(fā)現(xiàn)PGAM5敲除后線粒體turnover下降(h)易猫。（MitoTimer is a mitochondria targeting florescence protein that is green once being translated and becomes more red over time.）此外，PGAM5敲除的細(xì)胞膜電位也下降(i)具壮。
為了探究mitochondrial morphological and dynamic changes的后果准颓，作者檢測(cè)了線粒體ATP和ROS，發(fā)現(xiàn)敲除PGAM5后兩者都下降(j, k)棺妓。
3. Regulation of AMPK–mTOR pathway by PGAM5
由于PGAM5?/?的ARPE-19中ATP升高攘已，作者推測(cè)PGAM5誘導(dǎo)衰老是通過(guò)AMPK–mTOR信號(hào)通路。
Cellular AMP:ATP ratio reflects the energy
requirement of a cell, and can be sensed by intracellular sensor AMP-activated protein kinase (AMPK)
在PGAM5?/?細(xì)胞中怜跑，AMPK的磷酸化水平下降样勃，受AMPK調(diào)控的TSC2 (mTORC1的負(fù)性調(diào)節(jié)分子)磷酸化水平也下降(a)，mTORC1的活性(phosphorylation of S6 ribosomal protein)上升(a)。接著作者使用放線菌酮 cycloheximide/CHX (protein biosynthesis inhibitor) 激活mTOR信號(hào)通路峡眶，并si掉PGAM5剧防，發(fā)現(xiàn)CHX-induced S6 and 4EBP1 phosphorylation在si-PGAM5后更強(qiáng)。在體實(shí)驗(yàn)同樣顯示2-month-old Pgam5?/?鼠的脈絡(luò)膜組織WB和視網(wǎng)膜組織免疫熒光同樣顯示S6 磷酸化的上調(diào)(c, d)辫樱。為了進(jìn)一步探究ATP上升和mTORC1活化之前的因果關(guān)系峭拘，作者使用ATPase inhibitor oligomycin A 或 ROS inhibitor N-acetyl-L-cysteine (NAC) 處理 PGAM5?/? RPE細(xì)胞。結(jié)果顯示mTOR信號(hào)通路的激活被oligomycin 而不是 NAC 所抑制(e)搏熄。這提示升高的 ATP 水平而不是 ROS 參與調(diào)控PGAM5?/? RPE 細(xì)胞中 mTOR的激活棚唆。
These data collectively indicate that ATP elevation by PGAM5 deletion stimulates mTORC1 activity, which could explain the accelerated senescence in
PGAM5?/? cells.
4. Drp1-K38A overexpression mimicks PGAM5?/? cell phenotypes
接下來(lái)，作者探究了PGAM5?/?中Drp1磷酸化增加是否驅(qū)動(dòng)了線粒體形態(tài)改變和mTOR的激活心例。由于Drp1的GTPase activity依賴于其Ser-637去磷酸化宵凌，作者構(gòu)建了磷酸化位點(diǎn)突變的Drp1-K38A mutant腺病毒，并轉(zhuǎn)染了RPE細(xì)胞止后。作者推測(cè)失去GTPase的Drp1-K38A mutant可以phenocopy PGAM5?/?的表型瞎惫。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Drp1-K38A mutant的RPE細(xì)胞的線粒體面積增大branches變長(zhǎng)(a, b)，與PGAM5?/?的表型一致译株。此外瓜喇，在WT和PGAM5?/?細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)Drp1-K38A mutant都可以升高ATP水平(c,d)歉糜。而且過(guò)表達(dá)Drp1-K38A mutant后磷酸化s6增多(e)乘寒，SA-β-Gal staining增強(qiáng)(f)。p16 INK4A和MMP3 上調(diào)匪补，Lamin B1下降(g,h)伞辛，SASP的分子也增高(i)，提示衰老表型夯缺。
5. Drp1-S637A overexpression rescues PGAM5?/? phenotypes
接著作者在PGAM5?/?細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了
Drp1 S637A phosphorylation mutant蚤氏，發(fā)現(xiàn)其可以rescuePGAM5?/?細(xì)胞的衰老表型。
6. Age-dependent response to oxidative stress by PGAM5 deletion
有文獻(xiàn)報(bào)道踊兜，PGAM5?/?淋巴細(xì)胞和 MEF細(xì)胞以非caspase依賴的途徑抵抗氧化應(yīng)激竿滨。 為了檢測(cè)PGAM5?/?是否可以保護(hù)RPE細(xì)胞免于氧化應(yīng)激，作者構(gòu)建了NaIO3-driven RPE degeneration model捏境。結(jié)果顯示Pgam5?/?和WT小鼠在2和18月時(shí)沒(méi)有顯著差別(a, f)于游。然而在給予2周小鼠NaIO3損傷5天后，白點(diǎn)的數(shù)量 (RPE
degeneration)在Pgam5?/?小鼠中顯著更少(b)垫言。ZO-1染色也得到了一致的結(jié)果(c-e)曙砂。而在18周小鼠，這種保護(hù)作用消失(f-j)骏掀。
體外實(shí)驗(yàn)也得到了一致的結(jié)果
7. Loss of PGAM5 promotes immune regulatory pathway
IRF通路對(duì)機(jī)體固有免疫反應(yīng)鸠澈、炎癥和衰老至關(guān)重要柱告。由于phospho-rH2AX (DNA損傷的marker)被Pgam5?/?所激活，作者推測(cè)Pgam5?/?可以激活I(lǐng)RF通路笑陈。結(jié)果顯示Pgam5?/?細(xì)胞中IRF3磷酸化增加(a)际度，IFNb的表達(dá)也增加(b-c)。Ιfnβ, Ccl2 和 Ccl4在RPE/choroid組織中隨著aging增加涵妥，而在敲除PGAM5后更高(d)乖菱，這些提示Pgam5?/?中IRF通路的激活。此外蓬网，subretinal microglia細(xì)胞也會(huì)隨著aging增加而增多窒所，且在敲除PGAM5后更多(e)。Taken together,
we found that PGAM5 deficiency promotes the IRF/IFN-β pathway activation, which results in more microglia accumulation in the RPE/subretinal space.
