2022年2月山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院研究團隊在Cell Mol Gastroenterol Hepatol?（IF=9.225）發(fā)表文章屉更，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序剖析了人類遠端膽管癌（dCCA）的異質(zhì)性景觀和腫瘤微環(huán)境（TME）組成摸吠。該研究旨在揭示遠端膽管癌腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性吟孙。該研究中的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供治宣。

【發(fā)表期刊】Cell Mol Gastroenterol?Hepatol

【發(fā)布時間】2022年2月

【影響因子】9.225

【關(guān)鍵詞】單細胞轉(zhuǎn)錄組稳捆，遠端膽管癌

研究背景

遠端膽管癌（dCCA）是一種發(fā)生在遠端膽總管的上皮細胞惡性腫瘤迂烁，約占所有膽管癌病例的40%勋功。dCCA 是一種高度致命的疾病，通常具有顯著的細胞異質(zhì)性上煤。全面探索細胞多樣性和腫瘤微環(huán)境（TME）對于描述驅(qū)動 dCCA 進展的機制至關(guān)重要休玩。

研究思路

研究思路圖

研究結(jié)果

1、單細胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示人類 dCCA 細胞圖譜

構(gòu)建了 4 名 dCCA 患者的 4 份 dCCA 樣本和 3 份匹配的相鄰正常膽管組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖 1劫狠，A）拴疤。共 30,860 個細胞進一步注釋為 11 種不同細胞類型，包括 T 細胞独泞、上皮細胞呐矾、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞懦砂、中性粒細胞蜒犯、自然殺傷（NK）細胞组橄、成纖維細胞、B 細胞愧薛、神經(jīng)細胞晨炕、肥大細胞和組織干細胞（圖 1，B 和 C）毫炉。熱圖展示了每種細胞類型的 top 3 的差異基因（DEG）（圖 1瓮栗，D）。條形圖顯示了每個樣本中細胞類型的比例以及每種細胞類型中每個樣本的比例（圖 1瞄勾，E 和 F）费奸。

圖1 scRNA-seq 研究人類 dCCA 的單細胞圖譜

進一步量化響應(yīng) dCCA 惡性腫瘤的細胞類型豐度的變化，確定了跨越 KNN 圖的 2446 個鄰接进陡，其中 77 個顯示了正常（N）和惡性（M）條件之間豐度差異的證據(jù)（圖 2愿阐，B）。將差異豐度結(jié)果與之前確定的所有細胞群進行比較趾疚，恢復(fù)了除肥大細胞群外的所有細胞群中差異豐度的鄰接（圖 2缨历，C）。?

圖2 正常（N）和惡性（M）樣本之間的差異豐度

2糙麦、惡性細胞亞群在人類 dCCA 中表現(xiàn)出腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

所有上皮細胞進一步細分為 6 個主要亞群（圖 3辛孵，A），包括 1 個正常上皮細胞亞群（N）和 5 個惡性亞群（M1-M5）赡磅，顯示出不同程度的 CNV 評分（圖 3魄缚，B 和 C）。亞群 M1 是最主要的惡性亞群焚廊，而 M5 數(shù)量最少（圖 3冶匹，D）。5 種惡性亞型表現(xiàn)出很大程度的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖 3咆瘟，A）嚼隘。每種惡性亞型都顯示了特異表達的 DEG（圖 3，E 和 F）搞疗。惡性組織中有 212 個上調(diào)基因嗓蘑，正常組織中有 70 個相對高表達的基因（圖 3，G）匿乃。KEGG 功能富集分析表明，在惡性腫瘤中高表達的基因主要富集于細胞連接豌汇、ErbB 和 Notch 等信號通路（圖 3幢炸，H）。

圖3 人類 dCCA 中惡性成分的全面細胞概述和異質(zhì)性

通過免疫組織化學(xué)（IHC）和 qPCR 方法驗證每個亞群的 marker 基因表達拒贱，并顯示了每個樣本的形態(tài)學(xué)特征（圖 4）宛徊。結(jié)果與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致佛嬉，尤其是在蛋白質(zhì)水平上。

圖4 Marker 基因的表達驗證

接下來闸天，采用 SCENIC 方法分析所有惡性上皮細胞亞群并識別不同信號性質(zhì)的潛在轉(zhuǎn)錄因子（TF）（圖 5暖呕，A）。發(fā)現(xiàn)了所有惡性亞群的共同潛在 TF苞氮，例如 STAT3 和 Rel（圖 5湾揽，B），SMARCC2笼吟、EGR1库物、IKZF1、STAT1 和 POU2F3 分別為 M1 到 M5 中具有代表性的基礎(chǔ) TF（圖 5贷帮，A 和 B）戚揭。所有上皮細胞的偽時間軌跡圖顯示，正常上皮細胞和每個惡性細胞亞群形成一個連續(xù)體撵枢，但惡性亞群彼此分離民晒，具有不同的表達特征，證實了人 dCCA 中惡性亞克隆的異質(zhì)性（圖 5锄禽，C）潜必。正常的上皮細胞群形成了一個根，有 2 個主要的軌跡分支沟绪，將 M1 與 M2刮便、M3 和 M5 分開（圖 5，D）绽慈『藓担基因集變異分析（GSEA）表明所有 M 子集共享一些共同的激活特征，M1 和 M2 亞組共享最常見的途徑（圖 5坝疼，E）搜贤。

圖5 人 dCCA 組織中惡性細胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)異質(zhì)性

3、惡性細胞表現(xiàn)出與 17 號染色體相反的改變狀態(tài)

有趣的是钝凶，低和高 CNV 的 M 亞組特征分別是 chr17q12 - chr17q21.2 的擴增或缺失（圖 3仪芒，C）。該區(qū)域涉及多個顯著的腫瘤相關(guān)基因耕陷，所有這些基因在 M1 中均高表達掂名，而與 N 組相比，它們在 M2 至 M5 中的表達水平相對較低（圖 5哟沫，F(xiàn)）饺蔑。偽時間軌跡表達也顯示了這些基因在亞組之間差異的表達分布（圖 5，G）嗜诀。并且與 CCA 患者的患者總生存概率密切相關(guān)（圖 5猾警，H）孔祸。

4、人 dCCA 腫瘤中富含細胞毒性 CD8+ T 細胞和免疫抑制性腫瘤浸潤性 Treg

在非癌性膽道組織中发皿，僅檢測到 na?ve CD4+ 和 na?ve CD8+ T 細胞（圖 6崔慧，A），而在癌組織中穴墅，鑒定出 4 個不同的 T 細胞亞群（圖 6惶室，B）。Na?ve T 細胞在腫瘤和非腫瘤組織中均占主導(dǎo)地位封救，細胞毒性 CD8+ T 細胞是 dCCA 中的主要效應(yīng)子（圖 6拇涤，C 和 D）。接下來誉结，使用 iTALK 研究正常組織或腫瘤組織中 T 細胞和上皮細胞之間的細胞間通訊鹅士，ERBB2 受體在腫瘤組織中增強，表明阻斷 ERBB2 信號傳導(dǎo)可能會影響惡性細胞的增殖作用（圖 6惩坑，E）掉盅。

圖6 人類 dCCA 中的浸潤免疫細胞亞型景觀

5、dCCA 和 iCCA 的單細胞數(shù)據(jù)比較

與已發(fā)表的肝內(nèi)膽管癌（iCCA）單細胞數(shù)據(jù)進行整合分析以舒，證實了 iCCA 和 dCCA 之間不同的表達變化情況（圖 7趾痘，C）÷樱總共檢測到 45 個基因在 iCCA 中顯著上調(diào)永票，而 17 個基因在 dCCA 中過表達（圖 7，D）滥沫。GSEA分析表明侣集，二者富集了不同的激活信號通路（圖 7，E）兰绣。

圖7 ?單細胞數(shù)據(jù)與批量數(shù)據(jù)以及 dCCA 和 iCCA 之間的比較

總結(jié)

本研究全面繪制了人類 dCCA 的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀世分，揭示了高水平的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性以及對 dCCA 具有潛在臨床意義的關(guān)鍵生物學(xué)特征。

參考文獻

Li H, Qu L, Yang Y, Zhang H, Li X, Zhang X. Single-cell transcriptomic architecture unraveling the complexity of tumor heterogeneity in distal cholangiocarcinoma [published online ahead of print, 2022 Feb 24].?Cell Mol Gastroenterol Hepatol.?2022; S2352-345X（22）00041-8.doi:10.1016/j.jcmgh.2022.02.014