板塊“白話單細胞”代號“Vernacular”（白話）目標是用最通俗易懂的語言谣光，把單細胞測序相關(guān)內(nèi)容給大家講懂檩淋。
上次給大家分享的文獻中使用了10x Genomics免疫組庫測序（scBCR-seq），詳情可見：Masterpiece｜另辟蹊徑萄金，用BCR克隆多樣性識別腫瘤細胞蟀悦，今天小編給大家講講單細胞免疫組庫測序建庫原理。
免疫組庫測序其實主要測的就是TCR/BCR的基因序列氧敢，編碼TCR/BCR的4個基因簇V(可變區(qū))日戈、D（高變區(qū)）、J（編碼蛋白連接V孙乖、C區(qū)）浙炼、C（恒定區(qū)）會發(fā)生隨機重組排列（圖1）份氧，這就是TCR和BCR多樣性的來源，所以免疫組庫測序又稱V(D)J測序弯屈。
傳統(tǒng)免疫組庫測序利用的是多重PCR或5’ RACE方法蜗帜，但都存在一定的局限性，如多重PCR擴增法范圍局限在CDR3區(qū)资厉，5’ RACE 法只能獲得單鏈全長信息等厅缺。10x Genomics單細胞V(D)J技術(shù)的到來打破了傳統(tǒng)免疫組庫測序的局限，不但可以將TCR/BCR雙鏈完美匹配酌住，實現(xiàn)成對的重鏈和輕鏈（B細胞）或α和β鏈（T細胞）的全長測序店归；還可以細化到單細胞水平，并同時獲得表達譜信息酪我。
下面來說說消痛，該技術(shù)如何實現(xiàn)以上優(yōu)點：
10x單細胞免疫組庫測序利用微流控和油滴包裹技術(shù)捕獲單細胞，原理與小編前面介紹的10x單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的原理基本相似（詳情請移步：Vernacular｜搜索單細胞測序總能看到這張圖都哭，但我還是不懂10x單細胞是怎么回事）秩伞。
01??GEMs形成
Gel Beads、Oil 和要被捕獲的細胞們由通道通過微流控芯片形成一個個油包水結(jié)構(gòu)欺矫，即GEMs（包含單個細胞及單個Gel Beads）纱新。由于V(D)J 區(qū)段是在mRNA 的5'端，所以免疫組庫測序所用Gel Beads小觸角（Primer）的最右側(cè)序列為TSO序列（見圖2A紅框）穆趴。
02??反轉(zhuǎn)錄形成一鏈
那么TSO序列是如何捕獲細胞的呢脸爱？cDNA一鏈又是如何形成的呢？詳情請看圖3：
03??文庫構(gòu)建
當Gel Beads與細胞結(jié)合并在油包水環(huán)境中反轉(zhuǎn)成cDNA后未妹，我們對獲得的全長cDNA序列進行擴增簿废。擴增純化后的cDNA可分為 2 份，一份通過設計在TCR或BCR的C區(qū)的巢式PCR引物络它，進行TCR或BCR富集后構(gòu)建免疫組V(D)J文庫族檬，另一份直接用于構(gòu)建5’轉(zhuǎn)錄組文庫，從而實現(xiàn)在單細胞層面同時對基因轉(zhuǎn)錄本和免疫組庫進行高通量測序的目的（圖4）化戳。
如何獲取V(D)J序列全長信息
為了保證文庫信息可以涵蓋完整的V(D)J信息序列单料，我們使用巢式PCR技術(shù)將全長cDNA庫中包含完整V(D)J信息的序列特異性擴增富集出來（圖5）。
擴增得到的V(D)J全長序列會被隨機酶切為不同長度的片段点楼，之后末端修復扫尖、加A、加接頭構(gòu)建V(D)J文庫（圖6）掠廓。
構(gòu)建好的V(D)J文庫測序會獲得許多條不同的reads藏斩，其中有相同UMI序列標簽的reads都來自于同一條V(D)J全長序列。這些來自同一V(D)J序列的reads長度不一却盘，我們將含有相同UMI序列的reads中的Read2序列拼接起來狰域，就可以獲得V(D)J序列的全長信息（圖7）。
至此黄橘，我們通過建庫兆览，PCR擴增，上機測序等步驟塞关，就完成了對樣本中每個細胞V(D)J基因重排信息的捕捉抬探，以便查看TCR/BCR豐度和多樣性；同時還可獲得每個細胞所有轉(zhuǎn)錄本序列信息帆赢，從而準確地分析基因表達差異小压、基因結(jié)構(gòu)變異、篩選分子標記等生命科學重要問題椰于。
這期內(nèi)容就到這里怠益，關(guān)注+轉(zhuǎn)發(fā)，我們下期不見不散～
