MLL3 loss drives metastasis by promoting a hybrid epithelial–mesenchymal transition state
MLL3缺失通過促進(jìn)混合上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化狀態(tài)促進(jìn)轉(zhuǎn)移
背景
- EMT：上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)細(xì)胞的侵襲著角、循環(huán)（就是可以促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生）
- MET：間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)細(xì)胞的定植（到了定植的地方淆九，需要MET來完成侵襲）
- hybridEMT：完成上面兩步才可以完成轉(zhuǎn)移
- histone methyltransferase MLL3：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶3杂腰，既往研究證明其可以加速腫瘤的生發(fā)和生長，但是對轉(zhuǎn)移的作用不明確咬荷。
- MLL3是COMPASS家族中的一員，具有賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性白群。
- 以往的研究證實盘榨，MLL3復(fù)合物通過結(jié)合在基因的增強子（enhancer）上調(diào)控基因的表達(dá)
- Hu D, Gao X, Morgan MA, Herz HM, Smith ER, Shilatifard A. The MLL3/MLL4 branches of the COMPASS family function as major histone H3K4 monomethylases at enhancers. Mol Cell Biol. 2013 Dec; 33(23):4745-54
- 在小鼠中敲除MLL3則會增加多種癌癥的風(fēng)險和促進(jìn)癌癥的發(fā)展
- Chen C, Liu Y, Rappaport AR, Kitzing T, Schultz N, Zhao Z, Shroff AS, Dickins RA, Vakoc CR, Bradner JE, Stock W, LeBeau MM, Shannon KM, Kogan S, Zuber J, Lowe SW. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 2014 May 12; 25(5):652-65.
開始做實驗
MLL3 loss enhances breast tumour metastasis
MLL3缺失提升乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移
首先先是分析了一下這玩意是怎么突變，主要是點突變和基因缺失朴译。接著就上TCGA看井佑，發(fā)現(xiàn)有突變的預(yù)后差，但是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移變少了Ｃ呤佟９獭！（各種轉(zhuǎn)移都少了）且轉(zhuǎn)移灶中MLL3的表達(dá)是減少的盯拱。說明這玩意導(dǎo)致惡性預(yù)后但是不讓他轉(zhuǎn)移盒发？？（是不是從這個懷疑他會不會和混合EMT有關(guān)系）
接著就是養(yǎng)老鼠狡逢，用Luc2-Tomato標(biāo)注了3種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞宁舰，并用CRISPR干掉MLL3。
| 名稱 | 來源/形態(tài) | 培養(yǎng)基 | 細(xì)胞表達(dá) |
|---|---|---|---|
| MDA-MB-231腺癌細(xì)胞 | 乳腺/乳房; 源自轉(zhuǎn)移部位：胸腔積液奢浑；上皮細(xì)胞 L-15 | 培養(yǎng)基蛮艰，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清雀彼，10%壤蚜。氣相：空氣，100%详羡。溫度：37℃。DMEM培養(yǎng)基嘿悬，90%实柠；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%善涨。氣相：37 ℃, 5% CO2 | ER(-); PR(-); HER2(-); TP53++M窒盐；貼壁生長；表達(dá)表皮生長因子EGF受體钢拧、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-α受體和WNT7B癌基因蟹漓。 |
| MDA-MB-435浸潤性導(dǎo)管癌 | 乳腺/乳房 | DMEM培養(yǎng)基，90%源内；優(yōu)質(zhì)胎牛血清葡粒，10%。氣相：37 ℃, 5% CO2 | ER(-); PR(-);TP53+M |
| SUM159PT間變性癌（三陰性乳腺癌） | 乳腺 | Ham’s F12，5%-IH氣相：37 ℃, 5% CO2RPMI-1640)嗽交，90%卿嘲；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%夫壁。 | ER(-); PR(-); HER2(-); TP53-;具有高度轉(zhuǎn)移性拾枣。 |
- 在231中，原發(fā)腫瘤明顯增大盒让，肺梅肤、肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險均明顯增大（mutaiong burdern）
- 在435和和159中，雖然原發(fā)腫瘤沒有明顯增大邑茄，其發(fā)生的自發(fā)轉(zhuǎn)移明顯增加姨蝴。
Loss of MLL3 promotes metastatic colonization
MLL3缺失促進(jìn)轉(zhuǎn)移定植
背景：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）反映了腫瘤細(xì)胞在侵襲入循環(huán)、在體內(nèi)循環(huán)和存活的能力撩扒。
前面證明了MLL3缺失小鼠轉(zhuǎn)移情況增加似扔，那么接著就要看，到底是什么原因搓谆，是影響入侵還是影響轉(zhuǎn)移炒辉，就用CTC評估一下。
這兒就看了一下MLL3確實和不缺失小鼠的CTC情況泉手。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLL3缺失和不缺失不會影響小鼠體內(nèi)腫瘤侵入循環(huán)系統(tǒng)黔寇。同時通過尾靜脈注射，并且評估帶熒光的腫瘤細(xì)胞滲透到血管外的頻率（血管用FITC凝集素標(biāo)記了）斩萌。結(jié)果就是MLL3不影響MLL3的外滲缝裤。（這個肺的血管）
小結(jié)論：這兒就是說明了MLL3的改變既不影響進(jìn)血也不影響離開滲透出血管，那么他影響轉(zhuǎn)移估計就是影響定植了颊郎？憋飞？
既然測了在肺里的滲透，下面就要看影響定植的問題姆吭。尾靜脈注射一周后榛做，MLL3-WT和MLL3-Mutation的癌細(xì)胞數(shù)量和克隆大小相似。這說明MLL3缺失不影響滲出細(xì)胞的初始播種和存活内狸，但是检眯，MLL3缺失組的肺轉(zhuǎn)移灶明顯變大，轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)更明顯昆淡。
注：這個轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)一直沒搞懂锰瘸，metastatic burden。
這個e圖應(yīng)該是流式昂灵。
SSC避凝，即側(cè)向角散射舞萄，它的值代表細(xì)胞的顆粒度（granularity）
接著有做了已給免疫組化看了一下突變情況，MLL3確實后Ki67+的細(xì)胞明顯更多了恕曲，同時裂解的Caspase-3 陽性細(xì)胞沒有明顯增加（附圖偷懶）鹏氧。之前說的都是231細(xì)胞系，那么159里呢佩谣？MLL3缺失也導(dǎo)致轉(zhuǎn)移定植超級加倍把还。
Caspase-3是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起到關(guān)鍵作用茸俭，被廣泛用作凋亡的生物標(biāo)志物吊履。
為了評估在具有免疫能力的宿主中的肺定植，我們生成了攜帶Trp53 CRISPR 缺失和Pik3ca H1047R突變的小鼠乳腺干細(xì)胞（mouse mammary stem cell调鬓，MaSC）類器官艇炎，然后用慢病毒CRISPR進(jìn)一步敲除MLL3
理解：最后就是創(chuàng)建MLL3缺失或沒缺失的Trp53 缺失 / Pik3ca H1047R的 MaSC。
PIK3CA H1047R：PIK3CA H1047R是一個熱點突變腾窝，位于PIK3CA蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域(http://UniProt.org)缀踪。H1047R導(dǎo)致Akt和Mek1/2磷酸化增加，生長因子獨立的細(xì)胞存活和細(xì)胞培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化(PMID: 26627007, PMID: 29533785)虹脯。
在同基因FVB/n小鼠尾靜脈注射后驴娃，兩個MLL3缺失的MaSC獨立系產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)明顯高于MLL3-WT細(xì)胞。
FVB小鼠毛色為白色循集，起源于Swiss小鼠唇敞，1966年起開始選育，在接種百日咳疫苗后咒彤，其中一系HSFS/N對組胺敏感疆柔。到70年代初HSFS/N系第八代中，發(fā)現(xiàn)攜帶Fv1b等位基因的小鼠對B型Friend白血病敏感镶柱，后將這些小鼠育成Fv1b同型合子近交系旷档，故稱FVB。由于FVB小鼠受精卵中的原核突出顯著且生產(chǎn)性能好歇拆、產(chǎn)仔量大鞋屈，常用于轉(zhuǎn)基因顯微注射。FVB小鼠自發(fā)腫瘤率低查吊，但化學(xué)誘導(dǎo)易發(fā)鱗狀細(xì)胞癌谐区。
結(jié)論：總之湖蜕，這些結(jié)果表明MLL3的缺失增加了轉(zhuǎn)移定植逻卖。
MLL3 loss facilitates hybrid EMT in mesenchymal cells
MLL3缺失混合EMT中的間充質(zhì)細(xì)胞
背景：MDA-MB-231原發(fā)腫瘤細(xì)胞具有vimentin (VIM)+ /E-cadherin (Ecad) - 間充質(zhì)表型
- 所以就是231腫瘤本身發(fā)生了EMT的
Vimentin 角色4：EMT 間充質(zhì)標(biāo)記
上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種生物學(xué)過程，可讓極化上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為減少細(xì)胞附著昭抒、增加遷移和侵襲性的間充質(zhì)細(xì)胞评也。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化參與胚胎發(fā)育炼杖、修復(fù)、癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移盗迟。Vimentin 是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 的分子標(biāo)志物之一坤邪，常搭配上皮標(biāo)記 E-Cadherin 一同研究。除了 E-Cadherin 與 Vimentin 這二個關(guān)鍵明星罚缕，ZO-1艇纺、N-Cadherin、Snail邮弹、ZEB1 也是研究上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的固定班底黔衡。3.1 E-Cad表達(dá)下調(diào)與波形蛋白（Vimentin）表達(dá)升高
在EMT發(fā)生過程中，E-Cad表達(dá)下調(diào)的同時腌乡，常伴隨有多種間充質(zhì)相關(guān)蛋白的升高盟劫，其中較為明顯的是波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)升高。波形蛋白表達(dá)升高會干擾E-Cad介導(dǎo)的細(xì)胞黏附与纽，從而增加腫瘤細(xì)胞的遷移性侣签。轉(zhuǎn)移中的腫瘤細(xì)胞可以伸出偽足，內(nèi)有許多肌動蛋白聚集成絲急迂，這些肌絲的收縮推動了細(xì)胞的前進(jìn)影所；同時，癌細(xì)胞分泌蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)袋毙，使基底膜產(chǎn)生局部缺損型檀，以允許癌細(xì)胞通過。Irie等的研究中提到了蛋白激酶B（AKT或PKB）在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲時的功能特異性听盖。AKT1的下游調(diào)節(jié)可增強表皮生長因子（EGF）應(yīng)答刺激中的遷移胀溺，從而誘導(dǎo)出EMT的表型：即抑制E-Cad表達(dá)，而波形蛋白表達(dá)略有增加皆看。相比之下仓坞，AKT2下游調(diào)節(jié)就不能加強細(xì)胞遷移或改變E-Cad的表達(dá)，但其可以減少波形蛋白的表達(dá)腰吟。
徐浩翔等在綜述中提到了Singh在2003年發(fā)表的一個實驗：比較高侵襲性前列腺癌細(xì)胞LNCap和低侵襲性癌細(xì)胞CL1的差異蛋白時發(fā)現(xiàn)无埃，LNCaP中波形蛋白的含量是CL1細(xì)胞含量的20倍，向LNCaP細(xì)胞和CL1細(xì)胞分別導(dǎo)入表達(dá)反義波形蛋白和正義波形蛋白的載體以改變波形蛋白的含量毛雇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原本高侵襲性LNCaP細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯減少嫉称，低侵襲性CL1細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)水平升高但其遷移程度未明顯改變，所以他們認(rèn)為癌細(xì)胞中波形蛋白的高表達(dá)與細(xì)胞的侵襲性相關(guān)灵疮，波形蛋白可能通過作用于其他蛋白或者影響細(xì)胞侵襲過程較晚的階段才能最終改變細(xì)胞的遷移能力织阅。
所以作者就接著想看看轉(zhuǎn)移灶中的癌細(xì)胞是不是也是這個表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自發(fā)肺轉(zhuǎn)移中的一小部分癌細(xì)胞表現(xiàn)出共同表達(dá)VIM和E-cad的混合EMT表型震捣。在MDA-MB-231實驗性轉(zhuǎn)移中（應(yīng)該就是模擬轉(zhuǎn)移灶）觀察到類似的VIM+/Ecad+細(xì)胞荔棉，表明MDA-MB-231細(xì)胞在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移位點經(jīng)歷部分MET以獲得混合EMT特征闹炉。
接著作者染了一下CD44和CD104，尾靜脈注射2周后润樱，MLL3突變MDA-MB-231肺轉(zhuǎn)移灶中CD44+ CD104 - high細(xì)胞數(shù)量約為對照轉(zhuǎn)移灶的兩倍渣触。MLL3缺失也增加了Trp53 null/Pik3ca H1047R MaSC類器官和肺轉(zhuǎn)移中VIM+/Ecad+混合EMT細(xì)胞的頻率。
小背景：混合EMT CD44+CD104high壹若，而完全間充質(zhì)細(xì)胞為CD44+ CD104 low嗅钻。
小理解：這兒就是用marker和表型都證明了轉(zhuǎn)移灶中，MLL3缺失導(dǎo)致了混合EMT的產(chǎn)生
然后作者就嘗試解釋一下遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定植時候的機(jī)制店展，他們?nèi)诉h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)生的MET可能是由轉(zhuǎn)移微環(huán)境的間質(zhì)信號驅(qū)動的（在肺中尚未明確定義）啊犬。促進(jìn)MET的一個信號通路是蛋白激酶A （protein kinase A（PKA））。
作者測試了MLL3確實是否可以促進(jìn)PKA誘導(dǎo)的MET壁查。經(jīng)過PKA激活劑forskolin（真是毛喉素）處理后觉至，MLL3缺失腫瘤組織中產(chǎn)生的CD44+ CD104 high 的雜交EMT細(xì)胞較WT型顯著增加（3倍）。同時睡腿，forskolin僅使MLL3缺失細(xì)胞中 的上皮標(biāo)記物E cad出現(xiàn)了上調(diào)语御，VIM的下調(diào)沒有明顯變化。
小結(jié)論：這些結(jié)果表明MLL3的缺失促進(jìn)了混合EMT狀態(tài)的獲得席怪。
證明了MLL3缺失會產(chǎn)生混合EMT应闯，那么MLL3缺失的混合EMT的定植能力會不會更牛呢？
作者就從MLL3-wt或MLL3缺失的MDA-MB-231細(xì)胞中篩選出CD44+ / CD104high雜交EMT細(xì)胞和CD44+ / CD104 low 的間充質(zhì)細(xì)胞挂捻，并通過實驗轉(zhuǎn)移進(jìn)行評估碉纺。
結(jié)果顯示MLL3缺失的混合EMT細(xì)胞顯示出明顯高于其他細(xì)胞類型的肺轉(zhuǎn)移啟動能力（a-c）。(CD104high說明比較偏向于混合EMT刻撒，可能更加容易轉(zhuǎn)移)
MLL3缺失的雜交細(xì)胞也顯著增加了轉(zhuǎn)移到其他多個器官的能力骨田，包括骨、肝和腎（d,e展示的是骨轉(zhuǎn)移的情況声怔，附圖偷懶）态贤。此外，與其他細(xì)胞類型相比醋火，MLL3突變雜交細(xì)胞表現(xiàn)出明顯更高的腫瘤啟動能力和更快的腫瘤生長（f悠汽，附圖偷懶）。
小結(jié)果：MLL3缺失誘導(dǎo)的雜交EMT增加了多器官轉(zhuǎn)移和腫瘤啟動能力芥驳。
MLL3 loss facilitates EMT and metastasis in luminal cancer
MLL3確實促進(jìn)腔內(nèi)癌的EMT和轉(zhuǎn)移
目的：為了確定MLL3的缺失是否促進(jìn)了上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)可塑性
本研究中柿冲，作者引入了腔內(nèi)乳腺癌細(xì)胞系MCF7，并敲掉了MLL3兆旬。
MCF7
細(xì)胞描述：人乳腺癌細(xì)胞 MCF7 保留了分化乳腺上皮的許多特性假抄。包括：能通過胞質(zhì)雌
激素受體加工雌二醇并能形成圓形復(fù)合物（domes）铆帽。該細(xì)胞含有 WNT7B 癌基因委刘。腫
瘤壞死因子α（TNF alpha）可以抑制 MCF-7 細(xì)胞生長场勤。細(xì)胞經(jīng)抗雌激素處理后能調(diào)節(jié)
胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 IGFBPS 分泌狰贯。
雖然MLL3缺失在貼壁培養(yǎng)中沒有導(dǎo)致明顯的EMT表型（不太清楚這兒是如何說的宝鼓，大概就是沒有出現(xiàn)形態(tài)的變化刑棵？），但它顯著增加了球形形成能力愚铡，這是與經(jīng)歷EMT的細(xì)胞相關(guān)的特性蛉签。同時，MLL3突變的MCF7球含有明顯更高頻率的缺乏上皮標(biāo)志物CD24的細(xì)胞（往間充質(zhì)轉(zhuǎn)化了沥寥？）碍舍。另外，這些CD24 -細(xì)胞比CD24+細(xì)胞具有更高的成球能力（附圖偷懶）邑雅。
此外片橡，MLL3突變球顯著上調(diào)了VIM和EMT的TF（SLUG和SNAIL），同時維持了上皮標(biāo)志物E-cad和CD104的表達(dá)淮野，表明這些細(xì)胞部分發(fā)生了EMT捧书。在另一種腔內(nèi)乳腺癌細(xì)胞系T47D中，MLL3缺失同樣增加了球的形成和CD24 -和VIM+細(xì)胞的數(shù)量骤星。
T-47細(xì)胞是由I. Keydar分離自一位54歲乳房乳腺浸潤性導(dǎo)管癌女性患者胸水经瓷。T-47D細(xì)胞是T-47細(xì)胞的的上皮分化亞株，被發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞質(zhì)連接和17-β-雌二醇及其他類固醇降血鈣素的受體洞难，表達(dá)WNT7B癌基因舆吮。T-47D細(xì)胞可以用于乳腺癌研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主队贱。
我們進(jìn)一步測試了MLL3的缺失是否增強了永久化人乳腺上皮（HMLE）細(xì)胞中EMT對TGF-β的響應(yīng)色冀，這是TGF-β誘導(dǎo)EMT的典型模型。通過誘導(dǎo)CD44 high CD24 low 間充質(zhì)細(xì)胞可以看出柱嫌，低濃度TGF-β1可以讓MLL3突變HMLE細(xì)胞更快高效發(fā)生EMT呐伞。
HMLE：人正常乳腺細(xì)胞
在體內(nèi)，MLL3缺失顯著加速了MCF7腫瘤的發(fā)生和生長慎式。此外伶氢，mll3突變的腫瘤表現(xiàn)出Ecad表達(dá)減少和粘附連接紊亂，與mll3突變MCF7球的部分EMT表型一致瘪吏。此外癣防，mll3突變MCF7細(xì)胞在尾靜脈注射后發(fā)生的轉(zhuǎn)移明顯多于WT細(xì)胞。
這些結(jié)果表明掌眠，MLL3的缺失使腔內(nèi)癌細(xì)胞獲得混合EMT特性蕾盯，并變得更具轉(zhuǎn)移性
MLL3 loss activates the IFN-γ pathway
MLL3缺失激活I(lǐng)FN-γ通路
然后就是要看MLL3確實如何激活混合EMT的，看了一下MCF7中WT和MLL3缺失的轉(zhuǎn)錄組情況蓝丙。
干擾素-γ（IFNγ）级遭、干擾素-α（IFNα）和腫瘤壞死因子-α（TNFα）信號是MLL3缺失后富集的signature望拖。MLL3缺失也增加了MDA-MB-231細(xì)胞中的IFNγ基因特征（圖6b）。
此外挫鸽，從福斯科林處理過的MDA-MB-231細(xì)胞中分選出來的雜交EMT細(xì)胞IFNγ基因表達(dá)的明顯高于間充質(zhì)細(xì)胞说敏。匠心途徑分析（IPA）確定IFNγ是雜交EMT細(xì)胞中的上游細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。
一些干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF1, IRF2, IRF3, IRF5和IRF7）和STAT1也被發(fā)現(xiàn)在混合EMT細(xì)胞中被鑒定為活性TF調(diào)節(jié)因子(圖6e)丢郊。這些結(jié)果表明盔沫，混合EMT狀態(tài)與較高的IFNγ通路活性相關(guān)，而IFNγ通路活性因MLL3損失而上調(diào)枫匾。
IFNγ signalling is required for hybrid EMT and metastasis
IFNγ信號是混合EMT和轉(zhuǎn)移需要的
我們測試了炎癥因子的功能作用架诞，發(fā)現(xiàn)IFNγ可以在MCF7貼附培養(yǎng)中顯著增加了CD24 -細(xì)胞的頻率。說明IFNγ在混合EMT誘導(dǎo)中具有獨特的作用干茉。（IFNα谴忧、TNFα沒有情況）
此外，在IFNγ處理后角虫，MLL3缺失的MCF7細(xì)胞比WT細(xì)胞更有效地下調(diào)上皮標(biāo)志物CD24俏蛮，支持MLL3的缺失提升了對IFNγ的反應(yīng)的敏感性。
對照MCF7球中IFNγ處理使CD24 -細(xì)胞的頻率增加到mll3突變球的頻率上遥。
相反搏屑，使用IFNGR1阻斷抗體抑制IFNγ信號，降低了mll3突變球體中CD24 -細(xì)胞的頻率粉楚。
慢病毒CRISPR缺失IFNGR1同樣降低了CD24 -細(xì)胞的頻率和mll3突變細(xì)胞的成球效率辣恋。
IFNGR1缺失也消除了MLL3缺失對加速MCF7腫瘤發(fā)病的影響(圖6j)。
IFNGR1 deletion also abolished the effect of MLL3 loss on accelerating MCF7 tumour onset (Fig. 6j).
此外模软，通過EMT標(biāo)記物和腫瘤組織學(xué)測量伟骨，IFNGR1缺失降低了mll3突變MCF7腫瘤的EMT表型(圖6k和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6g-i)。
Additionally, IFNGR1 deletion diminished EMT phenotypes in MLL3-mutant MCF7 tumours, as measured by EMT markers and tumour histology (Fig. 6k and Extended Data Fig. 6g–i).
挖個巨坑燃异，啥時候想起來填吧携狭。
