抗體的結(jié)構(gòu)
二抗的結(jié)合
1. 一抗選擇指南
一抗是能和非抗體性抗原（特異性抗原）特異性結(jié)合的蛋白剿涮。種類(lèi)包括單克隆抗體和多克隆抗體言津。一抗可以特異性地結(jié)合底物，識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西取试。檢測(cè)任何靶蛋白都有多種抗體可供選擇悬槽，那如何進(jìn)行一抗的選擇呢？
1）確定實(shí)驗(yàn)樣本的種屬
確定自己實(shí)驗(yàn)所用樣本的種屬瞬浓，如human初婆、rat、mouse猿棉、pig磅叛、goat等。應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體萨赁，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)弊琴，因其氨基酸序列同源性較高。如果樣本的種類(lèi)未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應(yīng)種屬表中杖爽，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白敲董，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)∥堪玻可以通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)腋寨，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。如果比對(duì)結(jié)果化焕，證明同源性比較高的萄窜，也可以選擇。
（2）確定實(shí)驗(yàn)類(lèi)型
確定自己的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型，如WB查刻、IHC番宁、ICC、ELISA赖阻、FCM分析等蝶押，一般抗體說(shuō)明書(shū)會(huì)列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種分析類(lèi)型，如未提及并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類(lèi)型火欧，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證棋电。如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上標(biāo)注出來(lái)不適于某分析試驗(yàn)苇侵。
（3）分析樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
分析了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇合適的抗體赶盔，抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白榆浓、蛋白片斷于未、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞陡鹃，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述烘浦，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體萍鲸。如果打算用FCM流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白闷叉，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。
（4）抗體宿主物種的選擇
一般說(shuō)來(lái)脊阴，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)握侧，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言嘿期，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗品擎，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白备徐，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗萄传，而是選兔源的一抗，二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶坦喘、熒光素盲再、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況瓣铣，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大贷揽。
2. 二抗選擇指南
二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體棠笑，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛禽绪，如ELISA（以偶聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì)蓖救，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體）洪规，免疫組織化學(xué)（檢測(cè)組織中的特異性抗原），western blot（通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)）循捺，免疫沉淀（通過(guò)抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原）,免疫細(xì)胞化學(xué)（通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成）斩例，流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類(lèi)型的細(xì)胞）等。
二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的抗體均具有特異性从橘，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記念赶，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外恰力，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子叉谜，從而使信號(hào)增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度踩萎。二抗可以偶聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記停局，可以是酶，熒光素香府，或生物素董栽。如何選擇二抗？通常情況下企孩，某一特定的實(shí)驗(yàn)中可能同時(shí)有幾種二抗可供選擇裆泳，如何能選擇到適合該實(shí)驗(yàn)的二抗，需要綜合以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：
（1）一抗的種屬來(lái)源
根據(jù)一抗的物種來(lái)源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗柠硕。如果一抗是小鼠源的單克隆抗體工禾，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體蝗柔，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗闻葵。
（2）一抗是屬于哪個(gè)類(lèi)或亞類(lèi)???
除了要與一抗的種屬來(lái)源相一致，二抗還需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配癣丧，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言槽畔。一般來(lái)說(shuō)多克隆抗體主要是IgG類(lèi)免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體胁编。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些厢钧，由于單克隆抗體有不同的類(lèi)別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇嬉橙。
（3）二抗的種屬來(lái)源
一般來(lái)說(shuō)早直，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的聯(lián)系，來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別市框。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里霞扬，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的喻圃，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗萤彩，此時(shí)二抗就不能選山羊或者小鼠來(lái)源的。選擇相應(yīng)的驢來(lái)源的二抗斧拍，就非常適合做類(lèi)似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)雀扶。雙標(biāo)得2個(gè)都抗才行，故選擇第3個(gè)種源的抗體肆汹。
（4）選擇哪種形式的二抗愚墓，是整個(gè)IgG分子，F(xiàn)ab片段县踢，還是F(ab')2片段转绷？
整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)硼啤，一般用來(lái)封閉內(nèi)源性免疫球蛋白议经。
F(ab')2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中谴返，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況煞肾。
（5）二抗的偶聯(lián)標(biāo)記
一般來(lái)講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP嗓袱，PAP）籍救，熒光基團(tuán)（FITC, ?RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)渠抹。對(duì)于western blot和ELISA蝙昙，常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（組織免疫化學(xué)梧却，細(xì)胞免疫化學(xué)奇颠，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗放航。
（6）抗體的純度
親和層析純化的抗體一般更受歡迎烈拒，因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度更高，產(chǎn)生的非特異性背景也少广鳍。但是有些情況下也要考慮到純化過(guò)程中損失的IgG部分荆几，因?yàn)槠渲泻杏H和力高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量較小的時(shí)候赊时。
Protein A與Protein G有何不同吨铸？
目前，絕大多數(shù)的IgG純化使用Protein A蛋叼、Protein G親和層析焊傅，它們是來(lái)自于不同微生物的蛋白質(zhì)剂陡，對(duì)于IgG具有特異性的親和作用狈涮，而對(duì)于其他雜蛋白沒(méi)有或者只有很弱的結(jié)合狐胎，因此具有極高的選擇性。通常歌馍，僅憑Protein A握巢、Protein G一步親和層析就可達(dá)到90%的純度。但是Protein A松却、Protein G又有什么不同呢暴浦？該如何選擇呢？
1.Protein A
Protein A是金黃色葡萄球菌表面的蛋白晓锻，分子量42kDa歌焦，有5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合IgG的Fc片段，具有很強(qiáng)的特異性親和力砚哆，每個(gè)Protein A分子至少可以結(jié)合兩個(gè)IgG分子独撇。同時(shí)，IgA躁锁、IgM或者IgE也有可能和Protein A結(jié)合纷铣。
nProtein A：天然Protein A，無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分战转，載量約30mg人IgG/ml搜立。
rProtein A：重組Protein A ，C-端新增一個(gè)Cysteine槐秧，可以單一位點(diǎn)定向偶聯(lián)于瓊脂糖基架上啄踊，降低與抗體接觸的空間位阻，提高了載量刁标，約50mg人IgG/ml颠通。雅心重組蛋白A為本公司自主研發(fā)產(chǎn)品，非抗體柱純化命雀，產(chǎn)品中無(wú)任何其它抗體如IgG等的污染蒜哀；pH耐受范圍廣，可耐受0.5 M NaOH和0.5M HCl 處理吏砂，不降解撵儿，抗體結(jié)合能力不變。
2. Protein G
Protein G并不是我們熟知的G Protein（細(xì)胞表面G蛋白）狐血， 而是G族鏈球菌的細(xì)胞表面蛋白淀歇，分子量25kDa，和IgG的Fc區(qū)域特異性結(jié)合匈织，還能以低親力與Fab區(qū)域特異性的結(jié)合浪默，但不與IgA和IgM結(jié)合牡直。相比于Protein A，Protein G可以更廣泛纳决、更強(qiáng)地碰逸、與更多類(lèi)型的IgG結(jié)合，但是載量卻較低阔加，約20mg人IgG/ml饵史。
Protein A和Protein G的多個(gè)結(jié)構(gòu)域可與IgG結(jié)合
Protein A 和 Protein G對(duì)于不同物種和亞型的IgG的親和力如下表；
Protein A與Protein G有何不同胜榔？如何選擇胳喷？ - 知乎 (zhihu.com)
簡(jiǎn)書(shū)：超級(jí)無(wú)敵大蝸牛：http://www.reibang.com/p/7968913a8432
