Seahorse能量代謝分析儀主要功能
1苦始、采用超敏感的生物傳感器和非接觸式設(shè)計(jì)，真正實(shí)現(xiàn)檢測(cè)細(xì)胞零損傷慌申；
2陌选、實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞線粒體、糖酵解的能量代謝情況蹄溉，即時(shí)反應(yīng)細(xì)胞生理狀態(tài)咨油；
3、同步檢測(cè)細(xì)胞的耗氧量和產(chǎn)酸率（pH值變化）柒爵，數(shù)據(jù)結(jié)果更加全面役电；
4、實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)96個(gè)細(xì)胞樣品棉胀，通量高法瑟，速度快；
5唁奢、自動(dòng)化控制檢測(cè)流程霎挟、自動(dòng)化控制添加多達(dá)四種藥物，操作方便高效麻掸。
原 理
Seahorse XF 技術(shù)可測(cè)量微孔板細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中的氧通量（即耗氧率酥夭，oxygen consumption rate，OCR）和質(zhì)子通量（即細(xì)胞外酸化率extracellular acidification rate脊奋，ECAR）熬北。OCR 與線粒體呼吸成正比，而 ECAR 與糖酵解成正比诚隙。
1. 有氧呼吸（線粒體呼吸）
因?yàn)橛醒鹾粑窃诘谌A段（氧化磷酸化階段）才消耗氧分子讶隐，所以測(cè)定氧消耗速率反映的是有氧呼吸的水平以及潛力的變化。既然XF技術(shù)是實(shí)時(shí)檢測(cè)氧氣含量變化久又，那么我們肯定是需要細(xì)胞耗氧能力發(fā)生變化的巫延，所以我們可以將呼吸鏈上的不同蛋白逐個(gè)抑制掉。
1.1 ATP合成酶抑制劑——Oligomycin（寡霉素）
ATP合成酶籽孙，即線粒體復(fù)合物V烈评，是有氧呼吸最后一步釋放大量能量的關(guān)鍵分子火俄，其活性若被抑制則有氧呼吸在最后一步（合成ATP）被終止犯建，而前一階段（氧與質(zhì)子以及電子生成水）因下游“擁堵”導(dǎo)致耗氧停止(個(gè)人理解，若有誤瓜客，請(qǐng)大咖們批評(píng)更正)适瓦。下降的這部分為ATP production（這個(gè)概念很容易理解）或ATP-linked respiration（這個(gè)概念不是很好理解竿开，我的疑問是這個(gè)概念似乎更應(yīng)該直接抑制complex IV，這樣可以直接終止其介導(dǎo)的耗氧反應(yīng)）玻熙。
▲線粒體膜上電子傳遞鏈以及測(cè)試過程中使用的四種藥物
1.2 線粒體解偶聯(lián)劑——FCCP
這里的解偶聯(lián)解的是氧化反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)之間的偶聯(lián)否彩，氧化反應(yīng)可以理解為電子的傳遞過程，這個(gè)過程中會(huì)總伴隨著自由能的釋放（即形成質(zhì)子梯度差）嗦随，在ATP合成酶介導(dǎo)的最后一步反應(yīng)時(shí)列荔，這些自由能轉(zhuǎn)化到了ATP中。FCCP可以通過減小質(zhì)子在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的梯度差枚尼，導(dǎo)致氧化反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)不再偶聯(lián)贴浙，但復(fù)合物IV介導(dǎo)的耗氧反應(yīng)仍可繼續(xù)，氧消耗率繼續(xù)上升署恍，線粒體膜間區(qū)域的質(zhì)子濃度繼續(xù)上升崎溃，直至達(dá)到上限。高出基礎(chǔ)耗氧的部分即為儲(chǔ)備有氧呼吸能力（reserve capacity）盯质。
▲線粒體壓力測(cè)試圖譜
1.3 復(fù)合物 I 和 III （有氧呼吸）抑制劑——魚藤酮和抗霉素（rotenone & antimycin）
電子傳遞鏈的起點(diǎn)復(fù)合物 I 以及復(fù)合物 III 被抑制則整個(gè)氧化磷酸化（線粒體呼吸）過程被抑制袁串，因此剩下的則是非線粒體驅(qū)動(dòng)的耗氧。
看到這里呼巷，你是不是覺得囱修，做了上述指標(biāo)的檢測(cè)跟我們標(biāo)題所說的糖酵解基本沒啥關(guān)系？
對(duì)的王悍，可以說基本沒啥關(guān)系蔚袍，但也可以順便測(cè)一下
。我們重點(diǎn)要做的糖酵解還得看下面的內(nèi)容配名！
2. 胞外酸化率（反映糖酵解總體功能）
葡萄糖經(jīng)酶促反應(yīng)生成丙酮酸這一過程為糖酵解啤咽，在此過程中清寇，不需要消耗氧泥栖，所以跟前面的耗氧率沒有啥關(guān)系拦键。在沒有線粒體的參與下藏澳，丙酮酸最終轉(zhuǎn)化為乳酸武鲁，排到細(xì)胞外宁昭。所以骤菠，我們通過另一個(gè)指標(biāo)來反映糖酵解——酸化率铃肯。
2.1 呼吸的起點(diǎn)——葡萄糖
加葡萄糖后開始第一步反應(yīng)为朋，糖酵解臂拓，這很好理解。
2.2 ATP合成酶抑制劑——寡霉素（Oligomycin）
這里跟前面是一樣的作用习寸，主要用來阻斷有氧呼吸最后一步胶惰。為什么不用魚藤酮、抗霉素抑制復(fù)合物I和III抑制有氧呼吸的開始霞溪，目前還不是很能理解孵滞。等我搞明白了中捆，再來補(bǔ)充。
2.3 糖酵解抑制劑——2-DG
2-DG(2-脫氧葡萄糖)可與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合糖酵解途徑的己糖激酶（糖酵解第一個(gè)限速酶）坊饶，因而抑制糖酵解泄伪。
▲糖酵解壓力測(cè)試圖譜（糖酵解功能關(guān)鍵參數(shù)）
3. 糖酵解質(zhì)子流出率（更進(jìn)一步表征糖酵解的實(shí)時(shí)變化）
除了檢測(cè)耗氧率和胞外酸化率，Seahorse XF技術(shù)還可以檢測(cè)質(zhì)子流出率（proton efflux rate匿级，PER）蟋滴。主要利用魚藤酮/抗霉素和2-DG來相應(yīng)地改變有氧呼吸和糖酵解的質(zhì)子流（如下圖）。
▲糖酵解速率檢測(cè)原理
▲安捷倫 Seahorse XFp 糖酵解速率測(cè)定圖譜痘绎。
活細(xì)胞的質(zhì)子外流包括糖酵解和線粒體源性酸化脓杉。線粒體酸化。通過線粒體功能的抑制作用简逮。(Rot/AA) 對(duì)線粒體功能的抑制作用球散，可計(jì)算線粒體相關(guān)的酸化。將線粒體酸化減去總質(zhì)子流出率散庶，得出糖酵解質(zhì)子流出率蕉堰。
Agilent Seahorse XFp 糖酵解速率分析儀的原理。能量由細(xì)胞內(nèi)的兩種途徑產(chǎn)生--糖酵解和線粒體呼吸悲龟。在糖酵解過程中屋讶，葡萄糖分解為乳酸時(shí)，質(zhì)子被擠出到細(xì)胞外介質(zhì)中须教，XFp 分析儀檢測(cè)到的是 ECAR皿渗。此外，線粒體 TCA 活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生二氧化碳轻腺，使培養(yǎng)基水化和酸化乐疆。在檢測(cè)過程中使用復(fù)合體 I 和復(fù)合體 III 線粒體抑制劑（Rot/AA）抑制呼吸作用（OCR），可計(jì)算出呼吸作用的質(zhì)子外流率贬养，并從總質(zhì)子外流率中去除挤土，得出糖酵解質(zhì)子外流率（glycoPER）。為確認(rèn)途徑的特異性误算，注入糖酵解抑制劑 2-DG仰美，以阻止糖酵解酸化。
更 多 背 景 知 識(shí)
一儿礼、有氧呼吸的三個(gè)階段
1. 糖酵解
葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中分解為兩分子的丙酮酸咖杂，釋放少量能量：C6H12O6+酶→2丙酮酸（C3H4O3)+4[H]+能量（2ATP）。
2. TCA循環(huán)/檸檬酸循環(huán)
線粒體基質(zhì)中蚊夫，兩分子的丙酮酸分解為CO2和少量能量：2丙酮酸（C3H4O3)+6H2O+酶→6CO2+20[H]+能量（2ATP）诉字。包含乙酰CoA的形成這一準(zhǔn)備階段，乙酰CoA進(jìn)入線粒體內(nèi)參與的這個(gè)循環(huán)才是嚴(yán)格意義上的TCA循環(huán)階段。
3. 氧化磷酸化
這需要線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈的參與奏窑，又被稱為電子傳遞鏈（electron transport chain）磷酸化导披。線粒體內(nèi)膜上屈扎，ETC與氧結(jié)合埃唯，釋放大量能量：24[H]+6O2+酶→12H2O+能量（34ATP）。
---more---
氧化磷酸化的工作原理是利用釋放能量的化學(xué)反應(yīng)來驅(qū)動(dòng)需要能量的反應(yīng)：這樣的反應(yīng)稱為是偶聯(lián)反應(yīng)鹰晨。電子在電子傳遞鏈上從電子供體（如NADH）到電子受體（如氧）的流動(dòng)墨叛，是一個(gè)放能的過程，而ATP的合成是一個(gè)耗能的過程模蜡，需要輸入能量漠趁。電子傳遞鏈和ATP合酶都在膜中，在稱為“化學(xué)滲透”的過程中忍疾，通過質(zhì)子穿過這層膜的運(yùn)動(dòng)闯传，將能量從電子傳遞鏈轉(zhuǎn)移到ATP合酶中。
前兩個(gè)階段獲得的ATP屬于底物水平的磷酸化（高能化合物通過酶促反應(yīng)使能量傳遞給ADP生成ATP）卤妒，而氧化磷酸化是指電子在從被氧化(需氧)的底物傳遞到氧的過程中甥绿，釋放出來的自由能推動(dòng)ADP生成ATP的過程。
呼吸鏈（即ETC）由四部分組成: 復(fù)合體I(NADH) 则披、復(fù)合體II(FADH2）共缕、復(fù)合體III和復(fù)合體IV。除此之外士复，還需要泛醌（CoQ）和細(xì)胞色素C（CytC）參與電子的傳遞图谷。傳遞順序如下 (從左到右) ：
圖1. 呼吸鏈【1】
由于線粒體內(nèi)膜的兩側(cè)的氫離子濃度存在高低梯度(內(nèi)側(cè)（膜間區(qū)域）濃度比外側(cè)（線粒體基質(zhì)區(qū)域）濃度大)，而位于內(nèi)膜上的ATP合成酶（復(fù)合物V）阱洪，可以將氫離子通過F0的氫離子通道便贵，使氫離子從高濃度的內(nèi)側(cè)回流到低濃度的外側(cè)，即回流到線粒體基質(zhì)中冗荸，而 F1通過氫離子回流的能量嫉沽，驅(qū)動(dòng)ADP生成ATP。
圖2. 呼吸鏈上全部復(fù)合物及其相應(yīng)功能【3】
二俏竞、名詞解釋
氧化磷酸化是一個(gè)生物化學(xué)過程绸硕，發(fā)生在真核細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜或原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，是物質(zhì)在體內(nèi)氧化時(shí)釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)魂毁。
ATP合成酶玻佩，又稱FoF?-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成。在呼吸或光合作用過程中通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子(H+)梯度差（可想象為高水位的勢(shì)能）席楚，之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過ATP合酶驅(qū)動(dòng)使ADP和磷酸鹽（Pi）合成ATP（類似水流帶動(dòng)發(fā)電機(jī)發(fā)電）咬崔。合成一個(gè)ATP分子所需的質(zhì)子數(shù)估計(jì)為為3至4個(gè)。
解偶聯(lián)劑（uncoupler），指一類能抑制偶聯(lián)磷酸化的化合物垮斯。能使氧化與磷酸化脫離(即解偶聯(lián))郎仆，雖然氧化照常進(jìn)行，但因不能進(jìn)行磷酸化而不能生成ATP兜蠕，使P/O比值降低扰肌，甚至為零。FCCP（全稱是Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone熊杨，同CCCP曙旭；酸性芳香族化合物）是一種有效的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑 (IC50 = 20 nM)，是一種代謝毒素晶府，通過跨線粒體內(nèi)膜運(yùn)輸質(zhì)子（H+能夠直接通過線粒體內(nèi)膜擴(kuò)散桂躏，而無需通過ATP合成酶，見圖3右上角部分）來破壞 ATP 合成川陆，使線粒體膜電位去極化剂习。
圖3. 細(xì)胞呼吸過程【4】
糖酵解質(zhì)子流出率（glycolytic proton efflux rate，glycoPER)较沪，糖酵解過程中源自糖酵解的質(zhì)子向細(xì)胞外介質(zhì)中排出的速率鳞绕，不考慮CO2依賴性酸化的作用。這一測(cè)量結(jié)果與細(xì)胞外乳酸生成率高度相關(guān)购对。
質(zhì)子滲漏（proton leak）：質(zhì)子遷移到基質(zhì)中猾昆，但沒有產(chǎn)生 ATP，這使得底物氧和 ATP 的產(chǎn)生不能完全耦合骡苞。
有氧糖酵解垂蜗，在正常生理情況下，細(xì)胞只在限氧條件下進(jìn)行糖酵解解幽，而癌細(xì)胞即使在有氧條件下也傾向于進(jìn)行糖酵解贴见；這被稱為沃伯格（Warburg）效應(yīng)或有氧糖酵解，是癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)別所在躲株。
▲腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)與正常細(xì)胞的有氧呼吸代謝途徑的比較【6】
參考文獻(xiàn)
1. https://www.zhihu.com/question/416165432
2. https://zhuanlan.zhihu.com/p/629486604
3. https://istudy.pk/electron-transport-chain/
4. https://www.chegg.com/homework-help/questions-and-answers/refer-summary-diagram-cellular-respiration--fccp-metabolic-poison-allows-mathrm-h-diffuse--q122295525
5. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103346-400.pdf
6. Arora A, Singh S, Bhatt A N, et al. Interplay between metabolism and oncogenic process: role of microRNAs[J]. Translational oncogenomics, 2015, 7: 11.
