2023年4月29日溜嗜，bioRxiv發(fā)表了Peter N. Dodds團(tuán)隊題為“Pooled effector library screening in protoplasts rapidly identifies novel Avr genes”的研究論文。該論文提出了一個利用植物原生質(zhì)體文庫篩選快速鑒定R-Avr的平臺。https://doi.org/10.1101/2023.11.21.567997
由于病原體毒力的快速進(jìn)化，持久抗病性的作物育種具有挑戰(zhàn)性。盡管近年來抗性 ( R ) 基因克隆和疊加方面的進(jìn)展有所加快北苟，但許多病原體中相應(yīng)無毒 ( Avr ) 基因的鑒定因缺乏高通量篩選方案而受到阻礙。為了解決這一技術(shù)差距打瘪，我們開發(fā)了一個平臺友鼻，用于植物原生質(zhì)體中的混合文庫篩選，以快速識別相互作用的R / Avr對闺骚。我們通過篩選設(shè)計的針對單個R基因的推定效應(yīng)子文庫彩扔，從小麥稈銹病菌中分離出已知和新型的Avr基因，從而驗證了該平臺僻爽。為快速Avr基因鑒定提供了分子工具虫碉，可通過基因型監(jiān)測來了解和跟蹤病原體毒力進(jìn)化，并優(yōu)化R基因部署和堆疊策略胸梆。該篩選平臺廣泛適用于許多作物病原體敦捧，同時也適用于篩選涉及其他原生質(zhì)體選擇性狀的基因。
目前稈銹菌種僅鑒定到3個相應(yīng)的Avr基因碰镜，分別是AvrSr27兢卵、AvrSr35、AvrSr50绪颖。其它銹菌中也僅在玉米銹菌P. sorghi中鑒定到AvrRppC和AvrRppK秽荤。
一般目前常用的鑒定Avr候選基因的方法包括通過 PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或葉農(nóng)桿菌滲透對單個R和Avr基因組合進(jìn)行成對瞬時共表達(dá)，以檢測免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡柠横。然而窃款，這些方法逐一分析候選效應(yīng)子，實現(xiàn)難度較大牍氛，費時費力雁乡。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高質(zhì)量的病原菌基因組不斷被測序糜俗、組裝并發(fā)布踱稍。與此同時真菌和卵菌效應(yīng)子預(yù)測的算法和各種工具不斷涌現(xiàn)曲饱，這為設(shè)計和合成效應(yīng)子文庫提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)≈樵拢基于此扩淀，作者開發(fā)一個用于在植物原生質(zhì)體中篩選混合效應(yīng)子文庫，以便能夠快速鑒定相互作用的R - Avr組合的平臺啤挎。以加速無毒基因的鑒定工作驻谆。
簡單理解就是準(zhǔn)備好兩組原生質(zhì)體，一份轉(zhuǎn)攜帶已知R基因的表達(dá)載體庆聘，一份轉(zhuǎn)空載EV胜臊，然后再分別轉(zhuǎn)染等量的效應(yīng)子文庫。如果有Avr能與已知R基因匹配伙判，則原生質(zhì)體破裂象对。隨后通過收集兩個群體的活原生質(zhì)體進(jìn)行靶向測序，通過比較兩個群體的測序結(jié)果宴抚，如果與轉(zhuǎn)染空載的群體相比勒魔，轉(zhuǎn)染了R基因的群體中缺少哪個效應(yīng)子，則初步鑒定為候選Avr基因菇曲。
但這一方法有諸多因素需要考慮冠绢。
1 轉(zhuǎn)染效率的問題
一般原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化都需要大提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率決定了實驗的成功與否常潮。隨后他們測試了共轉(zhuǎn)原生質(zhì)體的效率弟胀，結(jié)果表明其實在使用高濃度質(zhì)粒時，共轉(zhuǎn)效率還是可以的喊式，24%-40%邮利。
2 死細(xì)胞的檢測問題
以往對原生質(zhì)體中免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的測定依賴于熒光素酶報告基因與響應(yīng)的R-Avr基因的共表達(dá)。這一試驗方法的弊端在于垃帅，無法檢測單個細(xì)胞的死亡情況延届，因為熒光素酶報告系統(tǒng)反應(yīng)的時細(xì)胞懸浮液中綜的熒光素蛋白酶活性。
于是贸诚，作者對上述方法進(jìn)行改進(jìn)方庭。用YFP代替熒光素酶，并通過流式細(xì)胞術(shù)對轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體進(jìn)行單獨的熒光分析酱固。試驗發(fā)現(xiàn)：與表達(dá)單個R或Avr基因或不匹配的R-Avr對的對照相比械念，三個已知的小麥稈銹菌R-Avr配對Sr50-AvrSr50、Sr27-AvrSr27-2和Sr35-AvrSr35的共表達(dá)導(dǎo)致活細(xì)胞（碘化丙啶陰性运悲，碘化丙啶只能對死細(xì)胞染色龄减，無法穿透或細(xì)胞膜對活細(xì)胞染色。）群體中YFP陽性原生質(zhì)體的比例顯著降低班眯。該測定允許定量原生質(zhì)體懸浮液中顯示免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的細(xì)胞比例希停。
即使低濃度烁巫，也有差異，可以說這一方法對細(xì)胞死亡大致定量了宠能。
3 通過缺失表達(dá)或差異表達(dá)能否獨立篩選出Avr
作者測試了差異效應(yīng)基因表達(dá)是否可用于鑒定Avr候選基因亚隙。為此，我們用模擬文庫轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體违崇，該模擬文庫由編碼AvrSr50阿弃、AvrSr27-2（每個以0.14M的MOT遞送）和AvrSr35（以100M的MOT）的三個構(gòu)建體以及Sr50、Sr27或空載體（以36M）組成羞延。轉(zhuǎn)染后24小時原生質(zhì)體中Avr基因表達(dá)的RNA-Seq分析（圖2c）顯示渣淳，當(dāng)模擬文庫與空載體共轉(zhuǎn)化時，AvrSr27-2和AvrSr50都表達(dá)伴箩。然而入愧，當(dāng)與Sr50但不與Sr27共表達(dá)時，AvrSr50的表達(dá)顯著降低赛蔫，并且當(dāng)與Sr27而不與Sr50共表達(dá)時AvrSr27-2的表達(dá)降低砂客。這清楚地表明泥张，當(dāng)作為模擬文庫的一部分共同遞送時呵恢，每個Avr基因的作用可以通過它們的相對表達(dá)來獨立評估。
牛刀小試
試驗1
在建立并優(yōu)化了文庫篩選的實驗條件后媚创，合成了一個由696個預(yù)測的Pgt效應(yīng)子組成的文庫渗钉，這些效應(yīng)子選自Pgt21-0參考基因組注釋，作為編碼分泌蛋白的基因钞钙，其表達(dá)模式類似于已知的Avr基因鳄橘。將該文庫合并并與空載體或編碼Sr50、Sr27芒炼、Sr13c瘫怜、Sr21、Sr22本刽、Sr26或Sr61的七個分離的R基因構(gòu)建體之一共轉(zhuǎn)化（每個構(gòu)建體MOT 0.14M）到原生質(zhì)體中鲸湃。使用RNA-Seq分析來鑒定當(dāng)與相對于空載體的特定R基因共表達(dá)時表現(xiàn)出降低表達(dá)的效應(yīng)物。兩個獨立的篩選正確地將AvrSr50鑒定為僅在Sr50存在下表現(xiàn)出顯著降低表達(dá)的單個基因子寓。
試驗2
因此暗挑，從篩選的七個Sr基因中的四個中鑒定Avr基因候選代表高檢測率，并且合成更大的效應(yīng)文庫可以允許鑒定額外的候選斜友。
試驗3
Sr13c和Sr22分別對AvrSr13和AvrSr22候選物的特異性識別通過原生質(zhì)體與單個Avr候選基因和相應(yīng)的R基因的共轉(zhuǎn)化得到證實炸裆，與單獨的R或Avr基因相比，這導(dǎo)致YFP陽性細(xì)胞的顯著減少鲜屏。
試驗5
類似地烹看，在來源于表達(dá)Sr13c或Sr22的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因小麥系的原生質(zhì)體以及來源于表達(dá)Sr13a或Sr22的天然小麥系的質(zhì)體轉(zhuǎn)化后国拇，也觀察到這些Avr候選基因的特異性識別。
試驗6
煙草和本氏N.benthamiana中的瞬時農(nóng)桿菌表達(dá)測定也顯示听系，當(dāng)AvrSr13與Sr13c或AvrSr22與Sr22共表達(dá)時贝奇，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)，但不與不匹配的R-Avr基因?qū)脖磉_(dá)時靠胜。
AvrSr13由PGT21_021053在PGT21-0基因組參考的1A號染色體上編碼掉瞳，1B號染色體上的一個無效等位基因表明該菌株對Sr13無毒性是雜合的。然而浪漠，Ug99 Pgt分離株（小種TTKSK）在A和C單倍型中對相同的AvrSr13基因（PGTUg99_007363陕习，未標(biāo)記）是純合的，因此可能對Sr13無毒性是純合址愿。AvrSr22由PGT21-0基因組參考中染色體16B上的PGT21_017626編碼该镣，并且PGT21-0中染色體16A上的替代等位基因包含未注釋的相關(guān)序列，但編碼與AvrSr21具有9個氨基酸差異的成熟蛋白响谓。來自Pgt21-0吸器和受感染植物樣品22的RNA-seq定位數(shù)據(jù)證實了該轉(zhuǎn)錄物在感染期間的表達(dá)水平與AvrSr22相似损合，表明它是一個我們指定為AvrSr22b等位基因的功能基因。Ug99基因組包含與AvrSr22（PGTUg99_032354）和AvrSr22b（tig00002160娘纷，未標(biāo)記）相同的序列嫁审。
AvrSr22b與Sr22在小麥原生質(zhì)體中的共表達(dá)導(dǎo)致YFP陽性原生質(zhì)體的比例降低，并在瞬時轉(zhuǎn)化的煙草和本氏煙草葉片中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡赖晶。由于兩個AvrSr22等位基因都被Sr22識別律适，因此Pgt21-0和Ug99可能是Sr22無毒性的純合子。Ug99菌株對Sr13c和Sr22的無毒性是純合的遏插，這一觀察結(jié)果表明捂贿，與Sr27、Sr35或Sr50相比胳嘲，這些抗性基因更有可能對Ug99衍生的Pgt菌株提供持久的抗性厂僧，其中該菌株對無毒性是雜合的。
例如了牛，Ug99莖銹病菌株對Sr13c和Sr22識別的Avr基因的純合性為在育種計劃中優(yōu)先考慮這些抗性基因和針對該種族群體的持久抗性的R基因堆疊方法3提供了基本原理颜屠。這里開發(fā)的原生質(zhì)體文庫篩選平臺也可以用于鑒定控制原生質(zhì)體中具有可檢測表型的其他重要生物性狀的基因，或者與細(xì)胞死亡/存活或熒光報告基因輸出有關(guān)的基因白魂。
利用這一方法或可加速許多關(guān)鍵植物病原菌avr基因的鑒定和克隆汽纤。利用R-Avr這一基本原理，或可為加速和改進(jìn)育種提供基礎(chǔ)信息福荸。
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