壹、高保真酶擴增目的片段
啟動子等：用Genome DNA模板擴增
CDS等：用cDNA模板擴增
PS:根據(jù)實驗在設(shè)計引物時在5端和3端添加相應(yīng)的酶切位點及其保護堿基
貳地来、目的片段和對應(yīng)載體雙酶切
DNA（50 μL）:
DNA product---------------20 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
滅菌水-----------------------22 μL載體（50 μL）:
質(zhì)粒------------------------10 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
滅菌水-----------------------32μL
叁壳贪、雙酶切的目的片段和對應(yīng)載體T4連接
體系（10 μL）
DNA---------------7.7 μL
質(zhì)粒-----------------0.3 μL
T4 DNA ligase---1 μL
10X T4 buffer----1 μL連接時間： 16℃/室溫 2 h
肆密末、轉(zhuǎn)化告希、涂板樟凄、挑單克隆驗證、陽性菌落測序
伍薄坏、序列截斷趋厉、質(zhì)粒修復(fù)、去除酶切位點
設(shè)計相應(yīng)的截斷引物胶坠、修復(fù)引物君账、點突變引物
高保真酶擴增整個質(zhì)粒（18 cycles）
DpnI消化正常質(zhì)粒 (2 μL DpnI; 5 μL 10X buffer; --37℃ 1h); 膠回收（Y/N均可）
轉(zhuǎn)化（優(yōu)選5 μL）、挑單克隆驗證涵但、陽性菌落測序
OTHER
高保真酶PCR后杈绸，TA克隆加A：
純化產(chǎn)物-------------20 μL
10XTaq Buffer--------3 μL
Taq enzyme ----------1 μL
dNTP-------------------5 μL
滅菌水------------------1μL
Note:一般定點突變后的氨基酸的密碼子遵循在人類中表達概率最高[密碼子優(yōu)化表]
[ other ] 同源重組法分子克隆
方法：含有載體同源片段的PCR產(chǎn)物 + 線性化的質(zhì)粒載體
目的DNA片段：5’端加入14-26bp與載體切口兩端相同的堿基序列（如HindIII 酶切位點和>14bp載體序列，這樣可以確保重組方向）
載體：線性化（限制性內(nèi)切酶單酶切割）
位點選擇：無重復(fù)序列且GC含量適中
Note: 偷懶法可以直接用PCR產(chǎn)物直接重組
如何避免形成菌落星斑
氨芐青霉素抗性基因通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶分解抗生素矮瘟，保護細菌瞳脓。長時間培養(yǎng)時，細菌會分泌出大量的β-內(nèi)酰胺酶破壞培養(yǎng)基中氨芐青霉素澈侠，導(dǎo)致不含質(zhì)粒的空菌落生長成菌落星斑劫侧。縮短培養(yǎng)時間可以避免產(chǎn)生菌落星斑哨啃。
