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1. 大家好袁辈，今天主要圍繞大豆疫霉核心效應(yīng)子XEG1匯報寄主與病原之間的關(guān)系。
2. 為了確保XEG1的故事完整性珠漂，我將主要以第二篇文章為主晚缩，其余4篇文章作為支撐，從研究背景媳危，研究進(jìn)展橡羞，以及討論三個方面展開匯報。
3. 植物有免疫系統(tǒng)嗎济舆？我們知道卿泽，從植物免疫概念的提出，到現(xiàn)在不斷完善的植物免疫信號網(wǎng)絡(luò)滋觉，經(jīng)過三十年的研究签夭，已經(jīng)明確，除了物理防御外椎侠，植物具有兩層免疫系統(tǒng)第租。
4. 三十年來，植物免疫系統(tǒng)不斷豐富和完善我纪，近幾年的研究也明確了慎宾，植物兩層免疫系統(tǒng)并非涇渭分明丐吓，而是存在相互放大的協(xié)同關(guān)系。一層是由模式觸發(fā)的PTI趟据，另一層是由效應(yīng)子觸發(fā)的ETI券犁。而今天我們主要聚焦寄主與病原相互作用的第一戰(zhàn)場——質(zhì)外體。在第一戰(zhàn)場的研究焦點(diǎn)也無非是模式與受體的識別汹碱。
5. 過去三十年來粘衬，已有60多個已知配體的受體被鑒定，但是真正以效應(yīng)子作為pamp分子的受體其實(shí)只有少數(shù)幾個是明確的咳促。下面我們就舉例幾個模式和受體相互作用的模型作為引入稚新。
6. 通常來說，我們對模式和受體的關(guān)系跪腹，認(rèn)知是不足的褂删，或者說是單一的。一般冲茸，模式的受體大都是依賴共受體笤妙，僅有少數(shù)通過單一受體發(fā)揮識別作用。這都是作為典型PTI通路的認(rèn)識噪裕。比如右邊蘋果腐爛病菌valsa mali的一個激發(fā)子蹲盘，通過煙草VIGS，很容易就鑒定到了其受體是的RLP膳音。
7. 第二個例子是幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫模型召衔，稻瘟病菌會分泌幾丁質(zhì)酶Mochia1降解chitin，阻斷chitin觸發(fā)的免疫祭陷；但同時植物質(zhì)外體存在一種四胎重復(fù)蛋白TPR1苍凛，可以優(yōu)先識別這種幾丁質(zhì)酶，以保護(hù)chitin不被降解兵志，從而恢復(fù)幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫醇蝴。因為這里的TPR1未發(fā)現(xiàn)有其他生物學(xué)功能，因此mochia作為一個負(fù)調(diào)控植物免疫的因子想罕，其是否有真正的受體悠栓，還未知。同時按价，質(zhì)外體蛋白OsMBL1也發(fā)揮類似的功能惭适。
8. 第三個例子就比較神奇，壞死性病原菌分泌的Tox1被細(xì)胞壁相關(guān)受體激酶識別后會觸發(fā)寄主感病性楼镐。換句話說就是壞死性病原體（如結(jié)節(jié)狀芽孢桿菌）劫持了通常與生物營養(yǎng)性病原體抗性相關(guān)的分子途徑癞志。這也說明了壞死性和生物營養(yǎng)性病原菌與寄主植物相互作用的敏感性和抗性的復(fù)雜性。
9. 后面框产，我將圍繞這5篇文獻(xiàn)講述XEG1的故事凄杯。這些文獻(xiàn)都是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超老師團(tuán)隊發(fā)表的错洁。
10. 首先，通過質(zhì)譜鑒定到一個大豆疫霉激發(fā)子戒突，可以和卵菌INF1一樣引起煙草過敏性壞死屯碴，而且這種壞死是依賴信號肽的，也就是說XEG可能在質(zhì)外體作為pamp發(fā)揮功能妖谴。需要注意的是窿锉，這里XEG1有兩種亞型酌摇。
11. 通過外源施加純化蛋白膝舅，可以觸發(fā)多種植物的過敏性壞死，同時可以誘發(fā)煙草和大豆的抗病性窑多，這也進(jìn)一步表明XEG1是一個pamp分子仍稀。
12. 通常，作為pamp分子埂息，一般是由定位于膜上的模式識別受體識別技潘。為了鑒定XEG1的受體，他們首先驗證了XEG1觸發(fā)的過敏性壞死是否依賴共受體BAK1和SOBIR1,煙草VIGS實(shí)驗表明：XEG1依賴BAK1而不依賴SOBIR1千康。然后很快就明確了RXEG1是受體享幽。
13. 然后作者進(jìn)一步明確了，XEG1對RXEG1的唯一依賴性和RXEG1對XEG1的唯一識別性拾弃。雙向證明RXEG1就是XEG1的受體值桩。
14. IP實(shí)驗也證實(shí)了前面煙草沉默的結(jié)果.
15. 前面是壞死的情況，那從觸發(fā)免疫反應(yīng)方面豪椿，也明確了XEG1觸發(fā)的植物免疫是依賴RXEG1的奔坟。講到這里，這個故事主要的內(nèi)容似乎已經(jīng)結(jié)束了搭盾。盡管我沒有按照文章發(fā)表的時間順序來說咳秉，但是從邏輯上來說鑒定到一個激發(fā)子的受體，就到此為止了鸯隅。但是后面的故事才是寄主和病原協(xié)同進(jìn)化的核心澜建。
16. 實(shí)際上，該團(tuán)隊同時還通過IP-MS檢測到一種與番茄木葡聚糖特異性內(nèi)切葡聚糖酶抑制劑蛋白XEGIP具有37%氨基酸同一性的蛋白蝌以，將其命名為大豆葡聚糖酶抑制蛋白1（GmGIP1）霎奢。pull down和co-IP證實(shí)了PsXEG1和GmGIP1之間的相互作用。GmGIP1與天冬氨酸蛋白酶相似饼灿，但缺乏關(guān)鍵的催化天冬氨酸殘基幕侠。當(dāng)GmGIP1在本氏煙中表達(dá)時，未檢測到PsXEG1的不穩(wěn)定性碍彭。此外晤硕，還證實(shí)了XEG1-GmGIP1相互作用是特異性的悼潭。
17. 通過蛋白結(jié)構(gòu)同源建模發(fā)現(xiàn)GmGIP1與PsXEG1互作中存在5個可能的關(guān)鍵互作區(qū)段，將這幾個區(qū)段的氨基酸替換為丙氨酸后舞箍，通過Co-IP發(fā)現(xiàn)G5區(qū)域在互作中發(fā)揮決定作用舰褪。
18. 到這里，就有一個問題疏橄，既然XEG1可以被RXEG1識別占拍，以觸發(fā)寄主的PTI反應(yīng)，這里的GmGIP1與XEG1互作又如何解釋捎迫？因為GmGIP1是一個葡聚糖酶抑制蛋白晃酒。接下來作者研究了GmGIP1是否可以抑制PsXEG1對木葡聚糖的水解。與GmGIP1G5突變體的作用相比窄绒，增加純化的GmGIP1蛋白的量強(qiáng)烈抑制了PsXEG1催化的木葡聚糖體外解聚贝次。PsXEG1活性較低并非由于GmGIP1引起的不穩(wěn)定性，因為PsXEG1與GmGIP1孵育6小時后依然穩(wěn)定彰导。這些結(jié)果表明蛔翅，GmGIP1可以作為PsXEG1葡聚糖酶活性的抑制劑。
19. 也正因此位谋，過表達(dá)GmGIP1能夠介導(dǎo)大豆對大豆疫霉病的抗性山析，而過表達(dá)G5突變體不能增強(qiáng)抗性。同時沉默GmGIP1掏父，顯著增加了對大豆疫霉的易感性笋轨。
20. 前面是從寄主的角度出發(fā)，探索了寄主對XEG1的抑制作用损同。而從XEG1對大豆疫霉毒力貢獻(xiàn)的角度看,兩個酶活位點(diǎn)的突變顯著減弱了其毒,XEG1對毒力的貢獻(xiàn)依賴酶活翩腐。
21. 為了確定GmGIP1是否可能抑制其他PsXEG1家族成員，通過Co-IP分析膏燃。在測試的10個蛋白中茂卦，只有一個叫PsXEG1樣蛋白1（PsXLP1）顯示出與GmGIP1的相互作用。PsXLP1與PsXEG1具有約67%的氨基酸序列一致性组哩。然而等龙，PsXLP1比PsXEG1短52個殘基，因為在C端附近的缺失導(dǎo)致了對酶活性至關(guān)重要的一個殘基的丟失（E222）伶贰。這兩種蛋白都靶向質(zhì)外體蛛砰。
22. 鑒于他們的序列相似性，評估PsXLP1的水解酶活性黍衙。結(jié)果表明泥畅，PsXLP1缺乏與PsXEG1相當(dāng)?shù)乃饷富钚浴?
23. 為了鑒定結(jié)合GmGIP1所需的PsXLP1的氨基酸，作者通過三維結(jié)構(gòu)建模預(yù)測PsXLP1的五個區(qū)域（X1至X5）與GmGIP1相互作用琅翻，其中一些相互作用殘基與PsXEG1共享位仁，一些不同柑贞。接下來，測試五個區(qū)域中每一個區(qū)域的丙氨酸取代突變破壞與GmGIP1相互作用的能力聂抢。Co-IP結(jié)果表明：X1钧嘶、X2、X3和X5都是PsXLP1與GmGIP1的完全結(jié)合所必需的琳疏。
24. 那XEG1和XLP1存在怎樣的關(guān)系呢有决？作者發(fā)現(xiàn)：PsXLP1的表達(dá)模式與PsXEG1的表達(dá)模式十分相似。
25. 此此外空盼，PsXEG1和PsXLP1基因在大豆疫霉基因組中相距2370個堿基對书幕，頭對頭排列，這種頭對頭排列廣泛存在于已測序的幾乎所有疫霉我注。
26. 鑒于XLP1與XEG在某些方面的相似性按咒，毒力測定表明：活性位點(diǎn)突變體及關(guān)鍵互作位點(diǎn)突變體過表達(dá)后對大豆表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒力迟隅。而PsXLP1缺失表現(xiàn)出更弱的毒力但骨。
27. 兩個實(shí)驗的結(jié)果是一致的。即智袭，GmGIP1結(jié)合PsXLP1所需的殘基對于PsXLP1對毒力的貢獻(xiàn)至關(guān)重要奔缠。但PsXLP1的酶活性不參與對毒力的貢獻(xiàn)。
28. 由于PsXLP1的GmGIP1結(jié)合活性是其毒力貢獻(xiàn)所必需的吼野，因此接下來測試了GmGIP-PsXEG1復(fù)合物是否可以被PsXLP1破壞校哎。結(jié)果表明，PsXLP存在時瞳步，PsXEG1-GmGIP1相互作用顯著降低闷哆，但在PsXLP1X123存在時，其相互作用不變单起。PsXEG1和GmGIP1相互作用的減少不是由于蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性抱怔，因為PsXLP1蛋白質(zhì)存在時蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化。為了測試PsXLP1如何從GmGIP1復(fù)合物中取代PsXEG1嘀倒，通過ITC測定了GmGIP對PsXEG1和PsXLP 1的體外結(jié)合親和力屈留。解離常數(shù)（Kd）表明，PsXLP1與GmGIP1的結(jié)合強(qiáng)度是PsXEG1的5倍测蘑。這些結(jié)果表明灌危，PsXLP1可能保護(hù)PsXEG1免受GmGIP1結(jié)合。
29. 大豆疫霉PsXLP1的過表達(dá)可中和轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中GmGIP1的過表達(dá)所提供的防御碳胳。同時勇蝙，毛狀根中的PsXLP1過表達(dá)不會增加對大豆疫霉PsXEG1敲除株的敏感性。
30. XLP1對XEG1的這種保護(hù)機(jī)制可能被許多疫霉屬物種使用挨约。
31. 總的來說大豆疫霉部署了誘餌（PsXLP1）來破壞植物防御味混。
32. 前面提到藕帜，XEG1有兩種亞型，XEG1在質(zhì)外體被降解惜傲。其中較小亞型比較大亞型對降解更敏感洽故，表明較大亞型被翻譯后修飾。用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）阻斷新蛋白質(zhì)合成后盗誊，瞬時表達(dá)的PsXEG1迅速降解时甚。較小的亞型對降解特別敏感。此外哈踱，天冬氨酸蛋白酶抑制劑PepA顯著抑制了PsXEG1的降解荒适。
33. 質(zhì)外體定位的PsXEG1抑制劑GmGIP1是一種非活性天冬氨酸蛋白酶樣蛋白，它與PsXEG1直接相互作用开镣。為了確定GmGIP1的酶活性同源物是否靶向PsXEG1降解刀诬，全基因組分析了可能的活性天冬蛋白酶澈蚌。其中有兩個表現(xiàn)出與PsXEG1相似的表達(dá)特征章姓，Co-IP結(jié)果表明，GmAP5可以與PsXEG1結(jié)合共郭，Western也證實(shí)了GmAP5對PsXEG1的降解树埠，但其他共表達(dá)大豆蛋白沒有降解糠馆。并且GmAP5在體外只能與PsXEG1的較小亞型互作。此外怎憋，消除GmGIP1結(jié)合的PsXEG1突變PsXEG1X1又碌，2，3不影響與GmAP5的結(jié)合绊袋，表明GmAP5和GmGIP1與PsXEG1的結(jié)合不同毕匀。
34. 進(jìn)一步用糖苷酶A或者F處理后，較大亞型的PsXEG1顯著減少癌别，同時用糖基化抑制劑突尼斯霉素TM處理后皂岔，只有較小亞型的PsXEG1表達(dá)。這些結(jié)果表明规个，較大亞型是糖基化的PsXEG1,較小亞型是非糖基化的PsXEG1凤薛。為了研究糖基化在PsXEG1毒力貢獻(xiàn)中的作用，作者分別創(chuàng)制了兩個糖基化位點(diǎn)替換的轉(zhuǎn)化子诞仓，發(fā)現(xiàn)他們的毒力均減弱缤苫。這些結(jié)果表明，PsXEG1的兩個糖基化位點(diǎn)是其對大豆疫霉毒力的完全所必需的墅拭。我們先前表明活玲，木糖葡聚糖酶活性是PsXEG1毒力貢獻(xiàn)所必需的。我們通過體外木糖葡糖酶活性測定證明，木糖聚糖的酶降解不需要PsXEG1的N-糖基化舒憾。
35. PsXEG1分泌不需要N-糖基化镀钓。然而，在CHX阻斷新蛋白質(zhì)的合成后镀迂，瞬時表達(dá)的PsXEG1N174A和N190A-HA迅速降解丁溅。在使用與純化的PsXEG1蛋白混合的大豆質(zhì)外體液的體外試驗中，PsXEG1N174Q和N190Q（由大豆生產(chǎn)）在質(zhì)外體液體存在下迅速降解探遵，但天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pep A基本上阻止了這種降解窟赏。為了確認(rèn)這些突變蛋白的不穩(wěn)定性是由于缺乏糖基化所致，還測試了去糖基化的PsXEG1箱季；當(dāng)與大豆質(zhì)外體液混合時涯穷，其也被降解，但在Pep A的存在下不被降解藏雏】娇觯總之，這些結(jié)果表明天冬氨酸蛋白酶參與了細(xì)胞外液對非糖基化PsXEG1的降解掘殴。
36. N-糖基化在大豆疫霉感染期間保護(hù)PsXEG1不被GmAP5降解赚瘦。為了評估GmAP5和PsXEG1之間的特異性相互作用是否發(fā)生在大豆疫霉感染期間，我們用CRISPR引入的兩種攜帶PsXEG1基因突變的大豆疫霉菌杯巨，即T91（PsXAG1N174A和N190A）和T3（PsXEG1Δ）蚤告，接種過表達(dá)或沉默GmAP5的大豆毛狀根努酸。當(dāng)GmAP5在根中過表達(dá)時服爷，與WT分離物相比，T91感染顯著減少获诈。相反仍源，表達(dá)未糖基化的PsXEG1的T91轉(zhuǎn)化體在GmAP5沉默的轉(zhuǎn)基因植物上恢復(fù)了毒力。然而舔涎，PsXEG1敲除系T3引起了大豆毛狀根的類似感染笼踩，無論GmAP5是沉默還是過度表達(dá)。這些結(jié)果表明亡嫌，GmAP5在大豆防御中的作用取決于PsXEG1的存在嚎于，并且N-糖基化在大豆疫霉感染期間保護(hù)了PsXEG1免受GmAP5的攻擊。
37. 總的來說挟冠，大豆疫霉菌進(jìn)化出一個PsXEG1的同源蛋白PsXLP1于购，PsXLP1通過C端缺失喪失了酶活性但逃避了GmAP5的識別，以“誘餌模式”與PsXEG1競爭性結(jié)合GmGIP1知染，從而掩護(hù)PsXEG1對寄主的進(jìn)攻肋僧。同時，PsXEG1通過糖基化修飾武裝自己不被寄主分泌的保外天冬氨酸蛋白酶降解。這些研究全面闡明了寄主與病原菌在質(zhì)外體間發(fā)生的多重復(fù)雜免疫模式嫌吠。
38. 最后的兩張片子通過結(jié)構(gòu)的解析明確：RXEG1與XEG1的結(jié)合止潘，抑制了XEG1的酶活和毒力水平。
39. 并解釋了RXEG1識別XEG1后招募共受體BAK1的結(jié)合辫诅。
40. 總的來說：大豆疫霉進(jìn)化出誘餌蛋白凭戴，以保護(hù)自身核心毒力因子的致病功能，以此抵御寄主的防御輸出炕矮。然而寄主與病原協(xié)同進(jìn)化過程中的復(fù)雜關(guān)系還有待更多的研究簇宽。
41. 謝謝大家。

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