1. Itaconate activates Nrf2
在LPS-treated human macrophages中，衣康酸的豐度顯著升高 (a)渡嚣，小鼠BMDM在LPS刺激后，衣康酸也顯著升高亚皂，達(dá)到了5 mM (b, c)这橙。衣康酸含有一個親電子的α,β不飽和羧酸，使其具有通過Michael addition來烷基化蛋白的半胱氨酸殘基扭粱，形成 2,3-dicarboxypropyl adduct。而其可能進(jìn)行半胱氨酸烷基化的底物就是抗氧化反應(yīng)中的核心分子KEAP1 (d)(WHY?)震檩。NRF2的烷基化失活使得其可以Nrf2聚集琢蛤，并發(fā)揮抗氧化抗炎作用，因此作者檢測了KEAP2和NRF2是否是衣康酸的下游靶點(diǎn)抛虏。
Michael addition (邁克爾加成)：是指碳負(fù)離子（親核的負(fù)碳離子博其，電子給體）對 α、β-不飽和醛 迂猴、酮 慕淡、羧酸 、酯沸毁、腈峰髓、硝基化合物等（親電的共軛體系，電子受體）的共軛加成反應(yīng)息尺，該反應(yīng)是一類十分重要的有機(jī)反應(yīng)携兵。在有機(jī)合成上用以增長碳鏈，合成帶有各種官能團(tuán)的有機(jī)化合物掷倔。為最有價值的有機(jī)合成反應(yīng)之一眉孩，是構(gòu)筑碳-碳鍵的最常用方法之一。有時也稱為1勒葱，4-加成浪汪、共軛加成。是親核試劑對α凛虽，β-不飽和羰基化合物發(fā)生的β位碳原子發(fā)生的加成反應(yīng)死遭，在逆合成分析中屬于親核試劑對a3合成子發(fā)生的反應(yīng)。
Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是E3泛素連接酶的底物識別亞單位,在蛋白質(zhì)的泛素化修飾中起重要作用凯旋。 蛋白質(zhì)的泛素化修飾作為一種重要且復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在自噬和蛋白酶體系統(tǒng)中作為降解信號而被利用呀潭。
Nrf2是一種對氧化應(yīng)激高度敏感的轉(zhuǎn)錄因子,在正常生理狀態(tài)下,與其負(fù)調(diào)控蛋白Keap1結(jié)合,通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)被泛素化和降解钉迷。氧化應(yīng)激導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離，Nrf2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)钠署，與小Maf(sMaf)蛋白形成異二聚體并識別ARE序列糠聪，啟動下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮廣泛的抗氧化抗炎作用谐鼎。由于Nrf2處于復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心,其活性受到多個水平的嚴(yán)格調(diào)控,包括轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控舰蟆、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控、亞細(xì)胞定位調(diào)控和翻譯后修飾調(diào)控等（詳見文章末尾）狸棍。
衣康酸的類似物—4OI可以上調(diào)Nrf2的表達(dá)(e)身害，并且上調(diào)其下游靶基因，包括抗炎蛋白Hmox1的表達(dá)(f, g)草戈。而且4OI對Nrf2的激活效果比臨床上使用的Nrf2 activator DMF的效果更好(h)塌鸯。
Nrf2的靶基因：Nqo1，Gclm唐片，Gsr丙猬，Homox1，Pdg牵触，Taldo淮悼。
2. Itaconate alkylates cysteines
衣康酸由IRG1在線粒體基質(zhì)產(chǎn)生，必須跨過線粒體內(nèi)膜才可以在胞漿中影響Nrf2揽思。衣康酸在結(jié)構(gòu)上與蘋果酸類似，可以通過二羧酸dicarboxylate, 檸檬酸citrate 和 氧化戊二酸carriers穿過線粒體內(nèi)膜见擦。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示钉汗，這三個carrier都可以轉(zhuǎn)運(yùn)衣康酸，而其他轉(zhuǎn)運(yùn)體則不能(a)鲤屡。這個結(jié)果提示衣康酸在生成之后通過這些轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入胞漿活化Nrf2损痰。
作者的猜想是衣康酸活化Nrf2是通過烷基化KEAP1的半胱氨酸殘基（類似于延胡索酸對半胱氨酸的修飾）。半胱氨酸151 (Cys151)是KEAP1應(yīng)對sulforaphane和DMF的主要sensor酒来。與sulforaphane相似卢未，在共表達(dá)wild-type KEAP1 而不是 Cys151Ser mutant的COS1細(xì)胞中，OI 可以stabilize V5-tagged Nrf2 (Nrf2–V5) (b)堰汉。為了直接分析KEAP1的烷基化辽社，作者在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)了Myc-DDK-tagged KEAP1，并使用OI干預(yù)翘鸭。對免疫沉淀的KEAP1進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果顯示滴铅，OI處理將其質(zhì)量增加了242.15Da，與OI引起的烷基化相一致(c)就乓。此外汉匙，在LPS處理的BMDM中拱烁，衣康酸的半胱氨酸殘基部分來源于葡萄糖和谷氨酰胺(d)。These data suggest that itaconate activates Nrf2 by alkylating KEAP1 cysteine residues噩翠。此外戏自，LDHA (糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子) 在OI和LPS處理的巨噬細(xì)胞中也被烷基化了(e)。This modification, here defined as 2,3-dicarboxypropylation, generates a stable thioether. As there are no known pathways for the removal of such post-translational modifications, modified proteins are probably degraded, suggesting that this modification will have profound effects on macrophage function. ?
3. OI limits IL-1β in an Nrf2-dependent manner and protects against LPS lethality
接著作者探究了衣康酸活化Nrf2是否可以抗炎伤锚。在BMDM中使用不影響細(xì)胞活性的OI浦妄，顯著降低了LPS誘導(dǎo)的Il1b的mRNA, pro-IL-1b, HIF-1a和IL10的蛋白水平(a, b)。OI還可以阻斷TLR2和TLR3激動劑干預(yù)的BMDM的IL1B表達(dá)(附圖)见芹。LPS誘導(dǎo)的ROS和iNOS在OI處理后也下降(c, d)剂娄。在人的外周血PBMC中OI也抑制了LPS誘導(dǎo)的IL1B的表達(dá)（e）。OI降低了lps誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的死亡率玄呛，降低了臨床評分阅懦，改善了體溫調(diào)節(jié)，降低了IL1B和TNF而不是IL10的表達(dá)(f-g)徘铝。而在Nrf2缺陷的巨噬細(xì)胞中耳胎，OI誘導(dǎo)HMOX1表達(dá)的能力下降，其降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的能力也下降(h)惕它。而再加入Nrf2的激活劑可以挽救上述效應(yīng)(附件)怕午。
4. A feedback loop exists between itaconate and IFN-β
We next investigated how switching from a pro- to an anti-inflammatory state might affect itaconate production from aconitate by IRG1.
此前一篇基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷的文獻(xiàn)報(bào)道，Irg1的表達(dá)受IRF1的調(diào)控(一篇plos one)淹魄。在這里郁惜，作者發(fā)現(xiàn)IFN-β處理可以增加衣康酸的水平(a)。同時甲锡，Irg1的底物兆蕉，檸檬酸和烏頭酸的水平下降。IFN-β處理可以增加基礎(chǔ)和LPS處理下的Irg1表達(dá)(b)缤沦。而敲除Irg1后虎韵，LPS和Poly(I:C)誘導(dǎo)Irg1的表達(dá)能力下降(c)，提示自分泌的IFN可以促進(jìn)IRG1的產(chǎn)生缸废。而OI可以抑制IFN反應(yīng)包蓝，降低IFN-β, IKK-ε, ISG20 和ISG15蛋白的表達(dá) (d-g)。
h: These data suggest the operation of a negative-feedback loop: itaconate is generated in response to LPS, in part through type I IFNs, and promotes an anti-inflammatory program by Nrf2 activation, as well as SDH inhibition. This limits further inflammatory gene expression and its own production by downregulating the IFN response. This helps to explain why Nrf2-deficient mice are more sensitive to septic shock, even though under certain circumstances these mice are protected from inflammation. Our identification of itaconate as an inflammatory regulator, that directly modifies proteins through a newly identified post-translational modification, unveils therapeutic opportunities to use itaconate or OI to treat inflammatory diseases.Furthermore, an intriguing link was recently made from itaconate to
vitamin B12, and this warrants further investigation in the context of inflammation and immunity. Further understanding the role of itaconate as an anti-inflammatory metabolite and regulator of type I IFNs is likely to yield new insights into the pathogenesis of inflammatory diseases.
其他知識點(diǎn)：
- Nrf2功能及信號通路
Nrf2是一個對于氧化應(yīng)激反應(yīng)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子企量，它會結(jié)合在位于許多細(xì)胞保護(hù)基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）上测萎。
在正常情況下，Nrf2會被BCR（KEAP1）復(fù)合體泛素化修飾并在細(xì)胞質(zhì)中降解梁钾。
在氧化應(yīng)激反應(yīng)中绳泉，親電子代謝物會抑制BCR（KEAP1）復(fù)合體活性，促進(jìn)NFE2L2/Nrf2與一類小的Maf蛋白形成異二聚體姆泻，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生聚集現(xiàn)象零酪。
Nrf2也會通過調(diào)節(jié)β-珠蛋白增強(qiáng)子活性參與β-珠蛋白簇基因的轉(zhuǎn)錄激活冒嫡。
應(yīng)激條件如接觸到毒素/ROS、致癌信號四苇、基因突變孝凌、自噬干擾、代謝變化等會破壞KEAP1-Nrf2復(fù)合物并導(dǎo)致Nrf2被激活月腋。激活后的Nrf2在細(xì)胞核中積累蟀架，并與其他轉(zhuǎn)錄因子、輔因子互作榆骚，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄片拍。Nrf2的活性受多水平調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控（NF-κB妓肢，AhR-ARNT捌省，ATF4等）、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（miRNA碉钠，RNA結(jié)合蛋白纲缓，可變剪切）、翻譯后調(diào)控（ERK喊废，JNK祝高，PKC，CK2污筷，PERK工闺，GSK3，p38）颓屑、自身穩(wěn)定性調(diào)控（KEAP1斤寂，βTrCP，HRD1揪惦，WDR23， CRIF1）罗侯。
Nrf2與 小Maf 蛋白形成異二聚體后能夠有效結(jié)合ARE / EpRE（抗氧化反應(yīng)元件/親電子反應(yīng)元件）器腋，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因會參與蛋白酶體組裝钩杰、自噬纫塌、預(yù)防細(xì)胞凋亡、維持氧化還原平衡讲弄、脂質(zhì)和碳水化合物代謝措左、血紅素代謝、鐵穩(wěn)態(tài)避除、藥物/異生物質(zhì)代謝怎披、其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和 DNA 修復(fù)（圖9）胸嘁。
正常情況下，Nrf2定位于胞質(zhì)凉逛；在氧化應(yīng)激反應(yīng)性宏，親電試劑，化學(xué)激活劑刺激下状飞，Nrf2在細(xì)胞核中聚集毫胜。
