hello，大家好术健，今天周日，太原出現(xiàn)了新的疫情粘衬，再次被封荞估，父母也都在家，介紹的好姑娘稚新，見的機(jī)會(huì)也推遲了勘伺，那我們?cè)撛趺崔k呢？褂删？只好看看文獻(xiàn)飞醉，好好學(xué)習(xí)了。

今天我們要繼續(xù)分享空間轉(zhuǎn)錄組的分析內(nèi)容屯阀，之前大部分都是分享的空間轉(zhuǎn)錄組需要和單細(xì)胞聯(lián)合分析缅帘，但是越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，空間轉(zhuǎn)錄組本身無窮的魅力已經(jīng)能夠解決大部分的問題难衰，今天分享的文章在Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment钦无，2022年3月發(fā)表于Cell,開發(fā)了一種新的空間功能基因組學(xué)方法——“擾動(dòng)圖譜（Perturb-map）”，結(jié)合CRISPR庫盖袭、多重成像和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)失暂，以識(shí)別腫瘤組成彼宠、組織和免疫的遺傳決定因素，從而在保留了空間結(jié)構(gòu)的同時(shí)弟塞，以單細(xì)胞分辨率為組織內(nèi)的功能基因組學(xué)建立了Perturb-map凭峡，并為癌細(xì)胞的TGFβ反應(yīng)性如何影響TME提出了新的見解。又是一篇高分文獻(xiàn)决记，科研工作者的努力研究成功一方面成就了自己摧冀，一方面也給10X打了不錯(cuò)的廣告，我還是希望國產(chǎn)平臺(tái)能夠崛起霉涨。

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腫瘤的細(xì)胞組成按价、空間結(jié)構(gòu)和組織定位對(duì)癌癥的進(jìn)展和治療反應(yīng)有著重要的影響，而這些因素與腫瘤免疫尤其相關(guān)笙瑟，因?yàn)槟[瘤微環(huán)境(TME) 內(nèi)的免疫細(xì)胞組成和定位是免疫治療反應(yīng)和患者預(yù)后的主要決定因素之一楼镐。空間分辨的單細(xì)胞基因組測序結(jié)果表明往枷，腫瘤附近存在著許多遺傳上不同的亞克隆框产，并且可能具有不同的TME組成，但是错洁，特定基因如何影響TME秉宿、相鄰克隆如何互相影響的都尚不清楚。事實(shí)上屯碴，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與協(xié)調(diào) TME 的基因描睦，但許多基因在影響不同腫瘤的結(jié)構(gòu)和免疫組成方面的潛在作用均尚未確定。

TME的組成是相當(dāng)復(fù)雜的导而，由許多不同的免疫和非免疫細(xì)胞類型組成忱叭，它們的比例、位置和運(yùn)動(dòng)都是相互依賴的因素今艺。許多基因的功能取決于組織的環(huán)境以及與特定細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)的空間接近程度韵丑。此外，雖然CRISPR篩選有助于發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)在過程的基因虚缎，但是現(xiàn)有方法對(duì)于識(shí)別細(xì)胞外的基因功能并不理想撵彻，尤其是在組織環(huán)境中。因此实牡，從腫瘤中表達(dá)的成百上千的基因中識(shí)別出會(huì)影響TME的組成和排列的基因是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)陌僵。

Pro-Code系統(tǒng)是一種基于蛋白質(zhì)的載體/細(xì)胞條形碼系統(tǒng)，由與支架蛋白dNGFR融合的線性表位（如FLAG创坞、HA等）的三聯(lián)體組合組成拾弃。本文研究人員首先構(gòu)建了表達(dá)不同Pro-Code的肺癌（KrasG12D以及p53缺失的KP肺癌）和乳腺癌（4T1）細(xì)胞系，以此構(gòu)建小鼠的肺癌和乳腺癌模型摆霉，通過多重成像原位檢測實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞分辨率和組織規(guī)模下豪椿，檢測到腫瘤內(nèi)120種不同的 Pro-Code 表達(dá)的癌細(xì)胞群奔坟，并且顯示了肺癌和乳腺癌的克隆性，證實(shí)了每種腫瘤背景的不同空間模式——KP 肺癌具有高克隆性和低混合性搭盾，4T1 原發(fā)性腫瘤具有彌漫性克隆性咳秉，4T1肺轉(zhuǎn)移瘤則呈克隆性發(fā)展，但也存在混合性轉(zhuǎn)移鸯隅。

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那么是否可以利用Pro-Code創(chuàng)建一個(gè)用于原位解析CRISPR篩選的平臺(tái)呢澜建？答案是肯定的，即Perturb-map——基于蛋白質(zhì)條形碼（Pro-Code）系統(tǒng)蝌以，利用少量線性表位的三重組合來創(chuàng)建一組更高階的獨(dú)特條形碼炕舵，從而可以標(biāo)記表達(dá)不同CRISPR gRNA的細(xì)胞。

研究人員構(gòu)建了一個(gè)靶向35個(gè)基因的核Pro-Code（nPC）/CRISPR慢病毒載體（LV）文庫跟畅，并將其應(yīng)用于小鼠肺癌模型中咽筋，這些基因編碼細(xì)胞因子信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子（包括IFNα、IFNγ徊件、TGFβ和TNFα的受體）以及參與免疫細(xì)胞相互作用的配體和分泌因子奸攻，并且參與了與人類對(duì)癌癥免疫療法的反應(yīng)相關(guān)的途徑。研究人員使用 Pro-Code 鑒定來確定每個(gè)腫瘤中表達(dá)的 CRISPR虱痕，在注射了nPC/CRISPR KP 細(xì)胞的 11 只小鼠中確定了約1,750 個(gè)不同的 Pro-Code 表達(dá)腫瘤睹耐。為了確定靶基因是否影響體內(nèi)腫瘤的發(fā)展，研究人員首先比較了攜帶特定nPC/CRISPR的腫瘤比例與預(yù)注射細(xì)胞混合物中相同nPC/CRISPR的相對(duì)頻率部翘。結(jié)果顯示許多 nPC/CRISPR 的頻率發(fā)生了顯著變化硝训，提示相關(guān)基因影響腫瘤生長。研究人員還發(fā)現(xiàn)除了能夠測量與基因敲除相關(guān)的腫瘤病變的數(shù)量和面積外新思，Perturb-map還有助于評(píng)估不同基因?qū)δ[瘤結(jié)構(gòu)的影響捎迫。基于Perturb-map的結(jié)果表牢，研究人員發(fā)現(xiàn)TGFβ受體2（Tgfbr2）基因和Socs1基因的敲除（KO）均具有生長優(yōu)勢(shì)，但是前者會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)重塑并誘導(dǎo)高纖維粘液性腫瘤的發(fā)展贝次，而后者則與兩種低分化的腫瘤病變類型——胸膜斑塊和鱗狀腫瘤的發(fā)生相關(guān)崔兴，由此表明Tgfbr2 和 Socs1 的缺失以截然不同的方式改變了 KP 肺腫瘤的結(jié)構(gòu)。

隨后蛔翅，研究人員又證實(shí)敲茄，利用Perturb-map可以研究不同基因?qū)δ[瘤病灶內(nèi)和周圍免疫細(xì)胞的的招募和維持的影響。以在體內(nèi)均富集的Tgfbr2 KO和Socs1 KO損傷為例山析，兩者顯示出相反的免疫組分模式堰燎，Tgfbr2病灶明顯排除免疫細(xì)胞，尤其是CD4+和CD8+ T細(xì)胞笋轨，而Socs1病灶則表現(xiàn)出高度T細(xì)胞浸潤秆剪。除了量化免疫浸潤外赊淑，Perturb-map還可以用于評(píng)估每個(gè)腫瘤病灶內(nèi)免疫細(xì)胞的空間分布。一般來說仅讽，免疫細(xì)胞更集中在腫瘤的外部區(qū)域陶缺，尤其是 CD4+和CD11c+ 細(xì)胞，然而洁灵，研究人員發(fā)現(xiàn)在特定的KO病變中存在顯著差異饱岸。此外，通過Perturb-map研究相鄰腫瘤是否影響彼此的免疫浸潤徽千，研究人員發(fā)現(xiàn)苫费，毗鄰Socs1 KO腫瘤的腫瘤病灶并不傾向于顯示更高的T細(xì)胞浸潤，而毗鄰Tgfbr2 KO腫瘤的腫瘤病灶的T細(xì)胞也沒有更多地被排除双抽，由此表明百框，至少在IFNγ和TGFβ通路改變的情況下，在彼此緊密接觸的肺腫瘤病變中荠诬，免疫細(xì)胞的組成和空間排列是非常局部的琅翻。這些結(jié)果也證實(shí)，Perturb-map提供了一種規(guī)母陶辏化的方法來評(píng)估特定的基因改變?nèi)绾斡绊懢植糠阶怠⒔撕瓦h(yuǎn)端 TME 狀態(tài)。

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進(jìn)一步地钧嘶，研究人員將空間轉(zhuǎn)錄組與Perturb-map配對(duì)結(jié)合棠众，以確定不同基因擾動(dòng)對(duì)腫瘤狀態(tài)的影響，結(jié)果證實(shí)其可以識(shí)別與基因擾動(dòng)相關(guān)的分子特征有决。深入分析表明闸拿，KP肺癌細(xì)胞中Tgfbr2的缺失的一個(gè)結(jié)果是腫瘤中TGFβ表達(dá)增加以及TME中TGFβ通路的激活，這提示在Tgfbr2 KO病灶中觀察到的基質(zhì)重塑和免疫排斥的潛在機(jī)制是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的TGFβ的激活书幕。由此也證實(shí)新荤，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)整合到Perturb-map中，可以以空間分辨的方式提供不同基因擾動(dòng)的無偏倚分子分析台汇。

這個(gè)地方就是我們今天關(guān)注的重點(diǎn)

為了進(jìn)一步確定不同基因擾動(dòng)對(duì)腫瘤狀態(tài)的影響苛骨，將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與 Perturbmap 配對(duì)。將 10X Visium 技術(shù)應(yīng)用于小鼠肺的四個(gè)切片苟呐，這些切片上覆蓋了表達(dá) nPC/CRISPR 文庫的 KP 腫瘤痒芝。 k-means 衍生clusters的差異表達(dá)區(qū)分了與腫瘤病變相對(duì)應(yīng)的空間域中的特定基因特征。與健康的周圍肺組織相比牵素，腫瘤病變高度表達(dá)特定的角蛋白和上皮標(biāo)志物（例如严衬，Krt8、Krt18 和 Epcam)笆呆。還在 KP 病變中發(fā)現(xiàn)了 IFNγ 特征请琳，包括抗原呈遞途徑（例如粱挡，Nlrc5、Tap1单起、Psmb8 和 Psmb9）抱怔、IFNγ 信號(hào)通路（例如，Stat1嘀倒、Irf1 和 Socs1）和 IFNg 誘導(dǎo)的趨化因子（例如屈留， Cxcl9 和 Cxcl10）。值得注意的是测蘑，Pro-Code 轉(zhuǎn)錄本在腫瘤clusters區(qū)域內(nèi)被清晰且特異性地捕獲.

由 Pro-Code 轉(zhuǎn)錄本定義的基于圖形的腫瘤點(diǎn)聚類揭示了肺切片中不同且重復(fù)的腫瘤基因表達(dá)特征灌危。與 KP 腫瘤的克隆發(fā)展一致，與給定病變相對(duì)應(yīng)的空間域通常聚集在一起碳胳，但也有與其他病變明顯聚集的特定病變勇蝙。為了識(shí)別每個(gè)病變中的基因擾動(dòng)，通過成像質(zhì)量流式細(xì)胞術(shù)對(duì)用針對(duì)每個(gè) Pro-Code 表位標(biāo)簽的金屬結(jié)合抗體染色的肺組織連續(xù)切片進(jìn)行成像挨约。組織內(nèi) nPC/CRISPR 的鑒定能夠用相應(yīng)的基因擾動(dòng)注釋每個(gè)基因特征味混，并揭示許多攜帶靶向 Tgfbr2 或 Ifngr2 的 CRISPR 的腫瘤與其他 KP 腫瘤相比呈現(xiàn)出不同的基因特征，如無偏聚類所示诫惭。還有一些與 KP 病變相對(duì)應(yīng)的clusters翁锡，但不是特定于任何基因 KO，因此將它們標(biāo)記為不同的 KP clusters（例如夕土，KP_1-2馆衔、KP_1-3 等）。應(yīng)該注意的是怨绣，由于 Visium 對(duì)每個(gè)擾動(dòng)的相對(duì)較少的病變進(jìn)行采樣角溃，這可能會(huì)影響為每個(gè) KO 解析不同clusters的能力。

對(duì)每個(gè) Visium 切片上的腫瘤clusters的基因表達(dá)進(jìn)行平均篮撑，該切片包含來自單獨(dú)注射的小鼠的荷瘤肺組織减细，然后分層聚類以揭示與特定組織區(qū)域或擾動(dòng)相關(guān)的切片的一致基因特征。 位于腫瘤病變外圍的空間域的特征是 Cxcl15赢笨、中性粒細(xì)胞引誘劑未蝌、Lyz2 和 Lamp3、骨髓細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)质欲，以及高水平的 MHC II 類機(jī)制，包括 H2-Ab1 和 Cd74糠馆。 這與成像數(shù)據(jù)中觀察到的腫瘤邊界周圍免疫細(xì)胞密度增加一致嘶伟。 Ifngr2 KO 腫瘤表現(xiàn)出 IFNγ 刺激基因 (ISG) 的表達(dá)顯著降低，包括 Irf1 和 Cxcl9又碌，以及許多參與抗原呈遞的基因九昧，如 H2-k1绊袋、H2-d1、Ciita铸鹰、Nlrc5癌别、Tap1、Psmb8 和 Psmb9.

在 Tgfbr2 KO 腫瘤中蹋笼，許多相同的 ISG 也被下調(diào)展姐，可能是由于腫瘤的 T 細(xì)胞排除狀態(tài)，并且各種膠原蛋白編碼基因增加剖毯，包括 Col1a1圾笨、Col6a1 和 Col6a2，與存在一致 纖維粘液基質(zhì)逊谋。 出乎意料的是擂达，在 Tgfbr2 靶向腫瘤中上調(diào)的許多基因表明 TGFβ 信號(hào)增加，包括由 TGFβ 誘導(dǎo)的 Tnc胶滋、Timp1 和 Arg1板鬓，以及由癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)的 TGFβ 誘導(dǎo)基因 Cald1。 彈性蛋白 (Eln) 是一種在肺成纖維細(xì)胞中被 TGFβ 高度特異性上調(diào)的基因究恤，在 Tgfbr2 KO 腫瘤中也被上調(diào)俭令。 受 TGFβ 負(fù)調(diào)控的 Sftpb 被下調(diào)。 值得注意的是丁溅，TGFb 受體的配體 Tgfb1 和 Tgfb3 在 Tgfbr2 病變中也上調(diào)唤蔗。

在 Tgfbr2 腫瘤中誘導(dǎo) TGFβ 誘導(dǎo)的基因促使我們測試 KP/Tgfbr2 CRISPR 細(xì)胞對(duì) TGFβ 的反應(yīng)性。 這證實(shí)了它們沒有響應(yīng) TGFβ 激活 TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)（通過 SMAD2/3 的磷酸化測量）窟赏，并且 TGFBR2 在這些細(xì)胞中確實(shí)被功能性敲除妓柜。 因此，我們?cè)噲D了解 Tgfbr2 KO TME 中的哪些其他細(xì)胞類型可能對(duì) TGFβ 有反應(yīng)涯穷。 盡管 Visium 尚未提供單細(xì)胞分辨率棍掐，但來自純化群體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于推斷細(xì)胞類型反應(yīng)。 為了做出這個(gè)推斷拷况，我們使用了 CytoSig 數(shù)據(jù)庫作煌。 在相關(guān)治療和細(xì)胞類型對(duì)之間創(chuàng)建代表性基因集，然后進(jìn)行基因集富集分析 (GSEA) 以識(shí)別不同腫瘤簇中的這些特定細(xì)胞因子特征赚瘦。

Tgfbr2 KO 損傷中最豐富的基因特征對(duì)應(yīng)于 TGFβ 激活的肺成纖維細(xì)胞粟誓。 盡管肺腫瘤細(xì)胞 TGFb 特征也被富集，但誘導(dǎo)的基因在很大程度上與成纖維細(xì)胞中的基因重疊起意。 由于 Tgfbr2 KO KP 癌細(xì)胞對(duì) TGFβ 沒有反應(yīng)鹰服，并且一些上調(diào)基因?qū)?TGFβ 激活的成纖維細(xì)胞（包括 Cald1 和 Eln）具有特異性，這使得 TGFβ 特征很可能源自 Tgfbr2 KO 腫瘤中的成纖維細(xì)胞。

這些發(fā)現(xiàn)表明悲酷，KP 肺癌細(xì)胞上 Tgfbr2 缺失的結(jié)果是腫瘤中 TGFβ 表達(dá)增加以及 TME 中 TGFβ 通路激活套菜。 這表明我們?cè)?Tgfbr2 KO 病變中觀察到的基質(zhì)重塑和免疫排斥的潛在機(jī)制是癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的 TGFβ 激活。 還證明设易，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以整合到 Perturb-map 中逗柴，以空間分辨的方式提供不同基因擾動(dòng)的無偏分子分析。

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這部分有幾個(gè)問題需要大家注意：

• 第一個(gè)顿肺，k-means聚類戏溺，這個(gè)地方相信大家都知道稀疏性矩陣不適合kmean聚類，作者這里這么用挟冠，大家理解么于购？？
• 第二個(gè)知染，對(duì)腫瘤的spot使用的是graph-base clustering的方法肋僧，為什么不重復(fù)使用kmeans聚類了？控淡？而且注意這里的聚類跟空間相關(guān)性特別強(qiáng)嫌吠，這也是空間聚類區(qū)別于單細(xì)胞的地方。
• 第三個(gè)掺炭，注意對(duì)空間的運(yùn)用辫诅，腫瘤內(nèi)和腫瘤外圍的特征基因分析，不同的區(qū)域空間信息是不同的涧狮，這也是異質(zhì)性的體現(xiàn)炕矮。

最后，研究人員通過小鼠肺癌模型者冤，在體內(nèi)驗(yàn)證了與Tgfbr2 KO腫瘤相關(guān)的Perturb-map表型肤视。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Perturb-map的觀察結(jié)果一致涉枫，與對(duì)照病灶相比邢滑，Tgfbr2 KO腫瘤的病灶明顯增大，覆蓋肺部區(qū)域也明顯增多愿汰，而且許多 Tgfbr2 腫瘤具有纖維粘液基質(zhì)困后，Tgfbr2 腫瘤內(nèi)CD4+和CD8+ T細(xì)胞浸潤也顯著減少，由此證實(shí)了Tgfbr2的缺失重塑了KP肺癌的TME衬廷。

Method（重點(diǎn)已經(jīng)標(biāo)注）

Clonality assessment

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Spatial transcriptomics analysis

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生活很好摇予，有你更好