Evolutionary conservation analysis of human arachidonic acid metabolism pathway genes
1. Levels of sEH and Eicosanoid Metabolites Altered in Myocarditis
作者首先使用了靶向LC-MS/MS檢測(cè)了心肌炎患者樣本中 eicosanoids（包括環(huán)氧酶 COX, 脂氧酶 LOX 和 CYP 通路的代謝物的變化拯啦，也就是上圖）結(jié)果顯示EET是變化最顯著的(a)劳坑，出現(xiàn)了顯著下降(b)。而DHET/EET ratio則顯著上調(diào)宫患，提示sEH的活性上調(diào)(c)。在心肌炎小鼠樣本中也得到了一致的結(jié)果（d-f）魂奥。在心肌炎患者心臟樣本中宪潮，sEH蛋白表達(dá)顯著升高(g)求厕。在心肌炎小鼠樣本中也是一樣，造模后3天小鼠心臟中sEH水平即升高离唬，并主要是在心肌和成纖維中表達(dá)(h-k)后专。
2. sEH Inhibition Prevents Cardiac Dysfunction of CVB3-Induced Myocarditis by Promoting an Antiviral Response
為了確定EETs是否可以阻斷心肌炎的進(jìn)展，作者使用sEH抑制劑TPPU對(duì)心肌炎小鼠進(jìn)行了治療输莺。結(jié)果顯示心肌炎小鼠心功能改善戚哎，心臟炎癥浸潤(rùn)程度減輕裸诽，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞型凳、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少丈冬。心臟促炎因子的表達(dá)下降，而干擾素的表達(dá)上升甘畅，心臟病毒含量也下降埂蕊。Implying that the increased production of IFNs in sEH inhibitor–treated mice prevented viral replication.
為了更好的模擬臨床情況，作者在給予CVB3后第3天開(kāi)始給予TPPU疏唾，持續(xù)到4w蓄氧。結(jié)果也顯示了很好的治療效果。
3. 14,15-EET Positively Regulates Type I IFN Production
隨后槐脏，作者使用CVB3干預(yù)了原代心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞喉童。結(jié)果顯示干預(yù)12h后，sEH蛋白表達(dá)在兩種細(xì)胞中都顯著上調(diào)顿天。而sEH抑制劑減輕了CVB3干預(yù)后的病毒復(fù)制堂氯。在EET中，最顯著改變的是14,15-EET露氮，而14,15-EET 的 antagonist 14,15-epoxyeicosa- 5(Z)-enoic acid (EEZE; 1 μM) 抵消了TPPU的保護(hù)作用祖灰。
此外，和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致畔规，CVB3可以誘導(dǎo)I型和II型干擾素的表達(dá)局扶，而抑制 sEH 則以EEZE-sensitive manner增加了IFN-α 和 IFN-β的表達(dá)。其中IFN-β的變化更為顯著叁扫。IFN-β調(diào)節(jié)蛋白ISG15 和 CXCL10的表達(dá)也同樣sensitive to sEH inhibition and 14,15-EET三妈。同樣的， sEH inhibition 和14,15-EET 的功能 were sensitive to the EET antagonist莫绣。
阻斷IFNAR則消除了sEH inhibition 和 14,15-EET的保護(hù)作用畴蒲。Thus, the antiviral actions linked to sEH inhibition seem to be linked to 14,15-EET–dependent effects on IFN expres- sion and IFNAR activation.
4. EETs Enhanced Type I IFN Signaling After CVB3 Infection by Targeting TBK1
由于IRF3在病毒感染時(shí)誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)中發(fā)揮著重要作用，因此作者探究了14,15EET和IRF3活化間的潛在關(guān)系对室。結(jié)果顯示模燥，CVB3感染的AC16細(xì)胞引起IRF3 Ser396位點(diǎn)的磷酸化，IRF3dimer形成增加和核轉(zhuǎn)位增加(a-d)掩宜。14,15EET（以及11,12EET）干預(yù)AC16也得到了一致的結(jié)果蔫骂。
CVB3激活I(lǐng)RF3的主要途徑包括e圖中的兩條（下圖的左部分，漏掉了cGAS）牺汤。
Nucleic Acid Sensors as Therapeutic Targets for Human Disease
si掉MDA5顯著下調(diào)了CVB3和EET誘導(dǎo)IRF3磷酸化的能力(f)辽旋，而si掉TLR3則沒(méi)有得到類(lèi)似的效果(g)。隨后作者進(jìn)行了熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。顯示過(guò)表達(dá)MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D都可以增強(qiáng)熒光素酶IFNB活性补胚，而且EETs可以在過(guò)表達(dá)MDA5, MAVS, 和 TBK1的細(xì)胞中顯著增強(qiáng)熒光素酶活性码耐，但是在過(guò)表達(dá) IRF3- 5D mutant中則沒(méi)有(h)。另一方面溶其，reduced IRF3 phosphorylation in response to CVB3 and abrogated the effects of the sEH inhibitor and EETs(I)骚腥。 Overall, these findings suggest that EETs are able to promote type I IFN signaling by targeting TBK1.
5. EETs Positively Regulated TBK1 Activation via Enhancing the Interaction Between GSK3β and TBK1
接著，作者探究了14,15-EET 和 11,12-EET 是怎樣增加TBK1的活化并調(diào)控 type I IFN 通路的握联。使用CVB3感染桦沉、TPPU干預(yù)、EET干預(yù)都不影響TBBK1的表達(dá)金闽，EET干預(yù)后的AC16也不存在TBK1磷酸化增加纯露，提示存在著其他調(diào)控機(jī)制。隨后代芜，作者使用了IP-MS檢測(cè)了與TBK1結(jié)合的蛋白埠褪。結(jié)合磷酸化質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定出GSK3β與TBK1相互作用挤庇，并且在11,12-EET and 14,15-EET刺激后的AC16中其磷酸化增加钞速。
si掉GSK3b后，CVB3和EET誘導(dǎo)的IRF3活化減低(a)嫡秕。而且CVB3誘導(dǎo)的IRF3 磷酸化并沒(méi)有受到影響渴语，提示EETs 的功能依賴(lài)于這個(gè)激酶的表達(dá)。而且CVB3干預(yù)后AC16的GSK3b磷酸化增加昆咽，EET刺激后驾凶，其磷酸化也增加(b)。此外掷酗，14,15-EET 在CVB3感染后增強(qiáng)了GSK3β 和 TBK1 的互作(c)调违。因此，作者通過(guò)replacing Tyr216 with aspartate (Y216D) or phenylalanine (Y216F)構(gòu)建了GSK3β的 nonphosphorylatable 和 phosphomimetic 突變體泻轰，結(jié)果顯示在病毒感染后的細(xì)胞中技肩，Y216D mutant 誘導(dǎo)了了的TBK1磷酸化(d)。Con- sistent with these observations, 14,15-EET increased TBK1 phosphorylation in CVB3-infected cells express- ing the wild-type GSK3β but not in cells expressing the nonphosphorylatable GSK3β mutant(e, f)浮声。
Thus, in the course of CVB3 infection, EETs are able to positively regulate TBK1 activity by eliciting the phos- phorylation of GSK3β to enhance its interaction with
TBK1.
隨后虚婿，作者構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性sEH敲除的小鼠。結(jié)果顯示敲除鼠給予CVB3后其心功能改善泳挥，心臟炎癥減輕然痊，TBK1和GCSK3B表達(dá)和磷酸化均增加。
最后羡洁，作者探究了是否抑制GSK3β可以影響EET的保護(hù)作用(a)玷过，結(jié)果顯示給予了AAV9-U6-shGSK3B的小鼠顯著降低了心臟GSK3β的表達(dá)(b)爽丹，并阻斷了EET的保護(hù)效應(yīng)(c,d)筑煮。給予GSK3β抑制劑也得到了一致的結(jié)果(e-g)辛蚊。同時(shí) GSK3β 抑制劑降低了sEHiΔMyh6心肌細(xì)胞中TBK1 和 GSK3β 的磷酸化。Collectively, these data indicate that EETs exert a cardioprotective effect during CVB3 infection through a GSK3β-dependent signaling cascade involving the type I IFN pathway.
