CRISPR/Cas9的出現(xiàn)使得高效進(jìn)行精確、有針對性的基因組修改變得比以往更加容易缔逛。Cas9已被修改，使研究人員能夠敲除垦江，激活姑躲，抑制，甚至圖像你最喜歡的基因谦炬。但是悦屏，在提供如此廣泛的 Cas9 試劑時(shí)，您如何選擇適合您特定實(shí)驗(yàn)的 Cas9键思？此博客文章將幫助您熟悉通過 Addgene 存儲庫提供的廣泛 Cas9s础爬，并便于選擇適合您使用的 Cas9 試劑。
在任何CRISPR實(shí)驗(yàn)中吼鳞，要做的第一件事就是確定你到底想做什么看蚜。您是否試圖永久淘汰細(xì)胞類型或生物體中的基因？您是想在不永久修改基因組的情況下減少特定基因的表達(dá)嗎赔桌？嘗試在特定點(diǎn)激活是否更有意義供炎？在特定位置修改表觀基因組怎么樣渴逻？正如您所料，這個(gè)問題的答案將極大地影響您決定您的實(shí)驗(yàn)需要哪個(gè) Cas9音诫。以下是使用Cas9和特定Cas9進(jìn)行的幾種常見基因操作的簡要摘要裸卫。
為您的淘汰實(shí)驗(yàn)選擇 Cas9
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克里斯珀挖空一代
使用標(biāo)準(zhǔn) SpCas9 進(jìn)行基因淘汰
****敲出細(xì)胞或動(dòng)物是通過共同表達(dá)特定于要瞄準(zhǔn)的基因和內(nèi)分泌酶Cas9的gRNA而形成的∨ⅲ基因組靶點(diǎn)可以是任何 +20 核苷酸 DNA 序列墓贿，只要它滿足兩個(gè)條件： 1） 序列是獨(dú)特的相比，其余的基因組蜓氨。2） 目標(biāo)位于原空間器相鄰圖案 （PAM） 的正上游聋袋。SpCas9 是一個(gè)常見的選擇，當(dāng)有一個(gè)合適的目標(biāo)位點(diǎn)穴吹，很少關(guān)心偏離目標(biāo)的影響（例如幽勒，最佳 gRNA 設(shè)計(jì)與最小的同源位點(diǎn)在整個(gè)基因組）。Addgene 攜帶各種含有質(zhì)粒的 SpCas9港令，這些質(zhì)粒經(jīng)過優(yōu)化啥容，可在細(xì)菌、酵母顷霹、蠕蟲咪惠、果蠅和哺乳動(dòng)物中進(jìn)行基因組工程實(shí)驗(yàn)。****
對特異性的關(guān)注淋淀？考慮使用高特異性Cas9變種遥昧。
通過正確設(shè)計(jì)您的 gRNA 序列，可以增強(qiáng) Cas9 介質(zhì)的特異性朵纷。即選擇基因組中其他部位具有最小同源性的目標(biāo)序列炭臭。已采用各種方法進(jìn)一步提高Cas9的特異性。例如袍辞，Cas9-nickase （Cas9n） 利用了 Cas9 通過兩個(gè)核糖域（RuvC 和 HNH）的組合活動(dòng)進(jìn)行雙鏈斷裂 （DSB） 這一事實(shí)鞋仍。將兩個(gè)關(guān)鍵酶殘留物之一轉(zhuǎn)換為丙氨酸（D10A 或 H840A）會生成一個(gè)"刻痕"Cas9，無法生成雙鏈斷裂搅吁。因此威创，需要兩個(gè)正確定位的Cas9n分子才能在靶點(diǎn)高效創(chuàng)建DSB，與野生型SpCas9相比似芝，它大大提高了特異性那婉。
雖然Cas9n肯定比野生型SpCas9更具體，但當(dāng)只有一個(gè)gRNA與Cas9n表達(dá)時(shí)党瓮，在目標(biāo)地點(diǎn)仍然能夠檢測到DSB详炬。這意味著 Cas9n 有可能在其任何 gRNA 的偏離目標(biāo)站點(diǎn)之一綁定并導(dǎo)致一個(gè)因德爾。人們可以通過使用核酸酶死Cas9（dCas9）融合到非特異性內(nèi)分泌酶FokI來克服這一限制。盖好眨基只有在變暗時(shí)才會切開目標(biāo)DNA在跳。因此，dCas9-FokI基本上需要在發(fā)生任何裂痕之前隐岛，在目標(biāo)部位正確定位兩個(gè)dCas9-FokI分子;dCas9-FokI在單個(gè)gRNA指定的偏離目標(biāo)處切割的可能性比Cas9n要小得多猫妙。
******Cas9n 或 dCas9-FokI 方法的一個(gè)明顯局限性是，它們都需要兩個(gè)合適的目標(biāo)序列才能有效地生成 DSB聚凹。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室割坠，包括張峰在布羅德研究所的實(shí)驗(yàn)室和Keith Joung在MGH的小組，已經(jīng)使用結(jié)構(gòu)生物學(xué)來識別關(guān)鍵殘留物妒牙，以調(diào)解Cas9的切開目標(biāo)點(diǎn)的能力彼哼。所謂的增強(qiáng) Cas9 （張）或高保真 Cas9 （ Joung ）在目標(biāo)點(diǎn)與野生型 SpCas9 具有可比的活動(dòng)，但大大減少了偏離目標(biāo)的活動(dòng)湘今。這些 Cas9 變種可增強(qiáng)特異性敢朱，而無需在目標(biāo)點(diǎn)內(nèi)需要兩個(gè)或多個(gè)相鄰目標(biāo)點(diǎn)。更多關(guān)于增強(qiáng)特異性Cas9變種的信息可以在我們的博客文章中找到摩瞎，題為"增強(qiáng)CRISPR目標(biāo)特異性與eSpCas9和SpCas9-HF1"拴签。******
當(dāng)沒有 5'NGG'3 PAM 序列存在時(shí)，我該怎么辦旗们？
- 合成Cas9s與新穎的PAM識別
通過一系列細(xì)菌中的陽性選擇屏幕蚓哩，Keith Joung 的小組識別出識別新型非 NGG PAM 序列的 S. Pyogenes Cas9 突變體（VQR、EQR 和 VRER Cas9 變種）蚪拦。重要的是杖剪，VQR、EQR 和 VRER Cas9 變種能夠修改無法使用野生型 SpCas9 進(jìn)行修改的基因組位點(diǎn)驰贷，并且它們對 PAM 變異的特異性類似于人類細(xì)胞中幾個(gè)基因組靶點(diǎn)的野生型 SpCas9。包括VQR洛巢、EQR和VRER SpCas9變種括袒，有效地使人類基因組中CRISPR/Cas9的目標(biāo)范圍翻倍。更多關(guān)于各種合成Cas9s可以通過Adgene可以找到我們的博客文章題為"PAM要求和擴(kuò)大CRISPR超越SpCas9"稿茉。
- 非 S. 皮奧根斯卡斯 9s
除了典型的 NGG PAM 序列之外锹锰，其他 Cas9 同源已從各種細(xì)菌物種和許多結(jié)合的 PAM 序列中分離出來。所謂的"非Sp"Cas9s可能更適合你的實(shí)驗(yàn)漓库，原因不是PAM序列恃慧。例如，金黃色葡萄球菌（SaCas9）的Cas9編碼序列比SpCas9小約1公斤基渺蒿，SpCas9允許包裝成腺相關(guān)病毒（AAV）痢士，這是目前基因治療的黃金標(biāo)準(zhǔn)。重要的是要記住茂装，非SpCas9s只與來自同一物種的tracRNA和crRNA（或合成gRNA）兼容怠蹂。更多有關(guān)通過Addgene提供的各種非SpCas9的信息善延，可以在我們的博客文章中找到題為"PAM要求和擴(kuò)大CRISPR超越SpCas9"。
- 非卡斯 9 克里斯普內(nèi)多內(nèi)分泌酶城侧， Cpf1
注意：Cpf1 也稱為 Cas12a易遣。
廣科研究所的張實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)現(xiàn)了一種新的CRISPR內(nèi)分泌酶。這種非Cas9CRISPR內(nèi)膜酶嫌佑，稱為Cpf1豆茫，是一種2級CRISPR內(nèi)分泌酶，能夠以RNA依賴的方式切割目標(biāo)DNA屋摇。使 Cpf1 如此有趣的不是與 Cas9 的相似之處 （它有很多）揩魂， 而是區(qū)別。Cpf1 的 PAM 序列為 5' TTN 3'摊册，位于目標(biāo)站點(diǎn)的 5'（與目標(biāo)站點(diǎn)的 Cas9 PAM 3' 相反）肤京。內(nèi)分泌酶包含兩種類似于 Cas9 （ D917 和 E1006 ）的酶殘留物，但這兩種殘留物都位于 RuvC 域（ Cpf1 缺乏 HNH 域）中茅特，任一殘留物的突變完全消除 DNA 忘分。與SpCas9相反，SpCas9可以通過變異單一的酶殘留物而轉(zhuǎn)化為尼卡酶白修。有趣的是妒峦， Cpf1 導(dǎo)致 PAM 序列中的 5 核苷酸 5 ' 懸垂 18 堿基對。這與Cas9切割不同兵睛，后者導(dǎo)致鈍DNA結(jié)束3個(gè)堿基對遠(yuǎn)端到PAM序列肯骇。Cpf1 的交錯(cuò)切割模式是否允許研究人員避免使用基因編輯的低效HDR依賴途徑仍有待證明，無論如何祖很，Cpf1最令人興奮的應(yīng)用可能尚未到來笛丙。你可以找到Cpf1質(zhì)粒和鏈接到出版物在Adgene網(wǎng)站上，并閱讀更多關(guān)于我t在我們的博客上假颇。
********上述大多數(shù)Cas9變種已用于通過同源定向修復(fù)（HDR）途徑生成特定的基因編輯胚鸯。有關(guān)如何使用 CRISPR 生成特定基因編輯的更多信息，請參閱我們的CRISPR 指南頁面笨鸡。********
使用Cas9激活和抑制目標(biāo)基因
Cas9的一個(gè)獨(dú)特方面是它能夠結(jié)合目標(biāo)DNA姜钳，而獨(dú)立于它切割目標(biāo)DNA的能力。換句話說形耗，含有破壞 DNA 的突變的 Cas9 （ SpCas9 的 D10A 和 H840A ）仍然能夠結(jié)合目標(biāo) DNA 哥桥。此外，所謂的核糖核酸死Cas9或"dCas9"可以用作平臺激涤，通過將各種貨物直接融合到dCas9拟糕，將各種貨物運(yùn)送到特定的DNA位位。dCas9的這一特性已被利用來定位各種蛋白質(zhì)以靶向基因，包括轉(zhuǎn)錄活化劑和轉(zhuǎn)錄抑制劑已卸。
使用基于 dCas9 的抑制器抑制目標(biāo)基因
早期在細(xì)菌中使用 dCas9 的實(shí)驗(yàn)表明佛玄，將 dCas9 定位為轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)點(diǎn)足以通過阻止轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)來"抑制"或"擊倒"轉(zhuǎn)錄。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中累澡，強(qiáng)力抑制需要將帶有轉(zhuǎn)錄抑制劑標(biāo)記的dCas9定位到感興趣的基因的發(fā)起區(qū)域梦抢。在敲除目標(biāo)基因?qū)?xì)胞有毒時(shí)，您可能需要考慮使用基于 dCas9 的抑制劑愧哟，包括 dCas9-KRAB奥吩。在Addgene的網(wǎng)站上可以找到抑制各種物種和細(xì)胞類型目標(biāo)基因的質(zhì)粒。
使用基于 dCas9 的激活器激活目標(biāo)基因
**********基于 dCas9 的激活器陣列非常多樣化蕊梧。最簡單的激活器由 dCas9 融合到單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域（通常為 VP64）霞赫。最近開發(fā)出第二代活化劑，這些激活器使用幾種不同的方法改變基因表達(dá)肥矢。例如端衰，"SunTag"系統(tǒng)通過共同表達(dá)標(biāo)記為 dCas9 的表位和抗體活化劑融合蛋白，促進(jìn)將多個(gè)激活領(lǐng)域招募到同一遺傳細(xì)胞位甘改。協(xié)同激活介導(dǎo)器復(fù)合物由 dCas9-VP64 融合和能夠與附加的 RNA 綁定轉(zhuǎn)錄激活器交互的修改 gRNA 組成旅东。額外的質(zhì)粒激活各種物種和細(xì)胞類型的靶基因可以在Addgene的網(wǎng)站上找到。**********
好吧十艾，我選了一個(gè)Cas9抵代！我下一步做什么？
您選擇了適合您的實(shí)驗(yàn)的 Cas9忘嫉。你接下來做什么荤牍？這里有一些考慮，這將有助于您推進(jìn)您的CRISPR實(shí)驗(yàn)庆冕。
設(shè)計(jì)或選擇 gRNA - Addgene 可能已經(jīng)攜帶了來自您最喜愛的物種的"驗(yàn)證 gRNA"康吵。 經(jīng)過驗(yàn)證的 gRNA 已在實(shí)驗(yàn)中成功使用，并發(fā)表在同行評審的期刊上访递，在開始 CRISPR 實(shí)驗(yàn)時(shí)將節(jié)省您的實(shí)驗(yàn)室時(shí)間和資金涎才。如果您需要為您的實(shí)驗(yàn)生成新的 gRNA，您可以從各種"空 gRNA 向量"中進(jìn)行選擇力九，并使用眾多免費(fèi) gRNA 設(shè)計(jì)程序之一設(shè)計(jì)您的 gRNA 定位序列。
我應(yīng)該使用哪種類型的表達(dá)系統(tǒng)或交付方法邑闺？為您的實(shí)驗(yàn)選擇合適的Cas9試劑只是一半的戰(zhàn)斗 - 現(xiàn)在你必須選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)跌前，并將Cas9交付給你的目標(biāo)細(xì)胞！Addgene 攜帶各種 Cas9陡舅，其中含有質(zhì)粒抵乓，這些質(zhì)粒經(jīng)過優(yōu)化，可在不同物種和細(xì)胞類型中表達(dá)，包括（但不限于）細(xì)菌灾炭、酵母茎芋、植物、果蠅蜈出、蠕蟲和哺乳動(dòng)物（這里按模型有機(jī)體瀏覽質(zhì)粒）田弥。對于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，您可能需要考慮使用倫蒂病毒將Cas9傳送到目標(biāo)細(xì)胞铡原。更多關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞各種輸送系統(tǒng)的信息可以在我們的博客文章中找到偷厦，題為"CRISPR 101：哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和交付方法"。
************驗(yàn)證您的基因組編輯 - 一旦您將 Cas9 和 gRNA 傳送到目標(biāo)細(xì)胞燕刻，是時(shí)候確認(rèn)目標(biāo)序列已修改只泼！確切的協(xié)議可能因您的特定實(shí)驗(yàn)而異，但在我們的博客文章"CRISPR 101：驗(yàn)證您的基因組編輯"中可以找到您驗(yàn)證基因組編輯的各種方式的廣泛概述卵洗。************
