Single-cell transcriptomics reveals the alteration of peripheral blood mononuclear cells driven by sepsis.
南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院和廣東省人民醫(yī)院急診與重癥醫(yī)學(xué)科
影響因子： 3.297谤牡，2020年1月13日提交，于2020年1月23日接受發(fā)布蠢挡，10天就接收了严蓖，嗚嗚泞当！
doi：10.21037 / atm.2020.02.35
背景：敗血癥是由感染引起的一種嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)綜合征胆绊，死亡率極高忽媒。外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在針對(duì)感染的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用膛锭，其組成和功能在敗血癥中發(fā)生了根本性的改變寓辱。在這里艘绍，作者想在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平上表征敗血癥中PBMC的變化。
方法：作者從7名敗血癥患者和4名捐獻(xiàn)者中分離了PBMC秫筏∮站希基于BD Rhapsody，通過單細(xì)胞RNA測序生成PBMC这敬，并通過無監(jiān)督聚類和注釋分析對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行聚類和命名航夺。
結(jié)果：對(duì)PBMCs進(jìn)行了6種細(xì)胞類型的分析，詳細(xì)顯示了T細(xì)胞和單核細(xì)胞的生物學(xué)特性崔涂。作者注意到阳掐，單核細(xì)胞可以聚集為6個(gè)子集，在敗血癥驅(qū)動(dòng)的組成冷蚂，基因譜和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變中具有很大的異質(zhì)性缭保。此外，代表性基因的表達(dá)與敗血癥臨床指標(biāo)在單核細(xì)胞簇（如NEAT1）中的表達(dá)高度相關(guān)蝙茶。
結(jié)論：盡管該研究是初步的艺骂，但作者揭示了敗血癥特異性的PBMC改變和相關(guān)途徑。這些結(jié)果提供了敗血癥驅(qū)動(dòng)的PBMC組成隆夯，基因譜和途徑特征的全景圖钳恕，這為了解臨床實(shí)踐中的疾病進(jìn)展或治療提供了獨(dú)特的視角。
在本研究中蹄衷，作者基于BD Rhapsody技術(shù)苞尝，采用了混樣的方法做的單細(xì)胞測序，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)敗血癥中PBMC的生物學(xué)特性進(jìn)行了全面的創(chuàng)新分析宦芦，著重觀察了單核細(xì)胞的變化宙址，在單核細(xì)胞的不同亞群中功能和生物學(xué)特性差異很大，某些代表性基因的表達(dá)很高调卑。與敗血癥驅(qū)動(dòng)的單核細(xì)胞簇中的敗血癥指標(biāo)有關(guān)抡砂。文章樣本疾病組7例，分析內(nèi)容較少恬涧，數(shù)據(jù)沒有做很深的挖掘注益，估計(jì)這也是沒有發(fā)更高分的原因吧。
方法
分離-PBMC-制備混懸液-上機(jī)測序（BD Rhapsody單細(xì)胞分析系統(tǒng)）-tSNE降維-標(biāo)記基因的鑒定和細(xì)胞類型注釋-信號(hào)通路分析（GSVA）-細(xì)胞類型比例分析
結(jié)果
1. PBMC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析溯捆，比較對(duì)照和敗血癥差異
從7名敗血癥患者（SP1-SP7）和4名對(duì)照（2名供體合并為1個(gè)樣品丑搔，總共2個(gè)用于測序的樣品厦瓢，CT1-CT2）和4個(gè)對(duì)照中分離了PBMC。
然后通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（BD Rhapsody）分析這些樣品（圖1A）啤月≈蟪穑回收的細(xì)胞總數(shù)為26,674，其中對(duì)照組為3,183谎仲，敗血癥患者為23,491浙垫，中位基因范圍正常（圖1B）。根據(jù)表達(dá)譜郑诺，PBMC聚類為9種細(xì)胞組成夹姥，這些組成由t分布隨機(jī)鄰居嵌入（tSNE）表示；每個(gè)細(xì)胞部分都用條形圖表示（圖1C）辙诞。所有細(xì)胞還通過疾病狀態(tài)（對(duì)照和敗血癥）進(jìn)行區(qū)分辙售，以顯示由敗血癥驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞簇的變化（圖1D）。
作者確定了6種主要細(xì)胞類型飞涂，包括：
B細(xì)胞（MS4A1 +）旦部，
DC細(xì)胞（CD11b +），
單核細(xì)胞（CD68 +）封拧，
自然殺傷細(xì)胞（CD3D-和NKG7 +）志鹃，
自然殺傷性T細(xì)胞（CD56 +），
圖1來自單細(xì)胞水平的對(duì)照組和敗血癥患者的PBMC的轉(zhuǎn)錄組圖譜
（A）顯示PBMC轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)的示意圖泽西；
（B）通過質(zhì)量過濾的細(xì)胞數(shù)量和基因的中位數(shù)（2個(gè)對(duì)照樣品CT1-CT2曹铃； 7個(gè)敗血癥患者SP1-SP7）；
（C）PBMC的tSNE圖可視化顯示了6種細(xì)胞類型（左）捧杉，條形圖顯示了正常對(duì)照和敗血癥患者的細(xì)胞比例（右）陕见；
（D）正常起源對(duì)照的受試者和敗血癥患者以明顯的顏色顯示；
（E）二維tSNE可視化顯示的已建立細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平味抖。
2. 敗血癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄組特征中T細(xì)胞亞群的改變
T細(xì)胞是巨大的細(xì)胞類型评甜，似乎能夠聚集成更多子集（圖1C）。為了進(jìn)一步了解T細(xì)胞的特定種群遷移仔涩，作者使用Seurat R包從對(duì)照和敗血癥中提取了所有T細(xì)胞忍坷。T細(xì)胞被分為2個(gè)子集（細(xì)胞毒性T和輔助T）（圖2A）。正常對(duì)照和敗血癥之間在代表性選定基因的表達(dá)分布上沒有顯著差異（圖2B）熔脂。比較對(duì)照組和患者之間的顯著差異基因佩研，作者發(fā)現(xiàn)RPS26，HLA-C霞揉，RBM38等被下調(diào)旬薯，而TXNIP，PPPDF适秩，PINM2等上調(diào)绊序。敗血癥相對(duì)于對(duì)照在敗血癥中高表達(dá)硕舆，表明敗血癥誘導(dǎo)的基因表達(dá)發(fā)生更廣泛的變化（[圖2C] (http://atm.amegroups.com/article/view/37087/html#figure2)）。
為了評(píng)估正常和敗血性T細(xì)胞之間的獨(dú)特生物學(xué)特性骤公，作者進(jìn)行了GSVA分析標(biāo)志信號(hào)通路抚官。敗血癥驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞在代表性途徑中不同于正常途徑，例如淋样，敗血癥與對(duì)照的T細(xì)胞形成對(duì)比耗式，雌激素反應(yīng)胁住，p53途徑和細(xì)胞凋亡均被富集趁猴，但I(xiàn)L-6途徑被顯著抑制（圖2D）。一起彪见，T細(xì)胞可以進(jìn)一步聚類為正常情況下幾乎相同種群的細(xì)胞毒性T和輔助T儡司，敗血癥患者T細(xì)胞的基因表達(dá)和信號(hào)通路與正常人不同。
圖2T細(xì)胞的單細(xì)胞分析
(A) 2個(gè)T細(xì)胞簇的二維tSNE可視化余指，不同的顏色代表不同的簇（細(xì)胞毒性T和輔助細(xì)胞）捕犬，（頂部和底部）分別顯示對(duì)照和敗血癥；
（B）通過小提琴圖顯示與對(duì)照和敗血癥中的T細(xì)胞相關(guān)的代表性選擇基因的表達(dá)分布酵镜；
（C）熱圖代表來自對(duì)照和敗血癥的T細(xì)胞中表達(dá)最高的差異基因碉碉，正常組中高表達(dá)20個(gè)基因，敗血癥中高表達(dá)20個(gè)基因淮韭；
（D）正常和敗血癥誘導(dǎo)的T細(xì)胞之間信號(hào)途徑差異的條形圖垢粮。
3.敗血癥促使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平改變單核細(xì)胞亞群
作者進(jìn)一步將單核細(xì)胞聚集成6個(gè)子集，然后評(píng)估敗血癥對(duì)單核細(xì)胞的影響靠粪。與對(duì)照相比蜡吧，敗血癥中5個(gè)單核細(xì)胞亞群的擴(kuò)增顯著，包括
CD14 + NEAT1 + SELL +單核細(xì)胞占键，
CD14 + NEAT1 + CCR1單核細(xì)胞昔善，
NEAT1 + CD163 +單核細(xì)胞，
CCL3L1 +單核細(xì)胞畔乙，
CD16 +單核細(xì)胞君仆，
而巨噬細(xì)胞簇分布的改變?yōu)樵趯?duì)照和敗血癥中沒有明顯的數(shù)量差異（圖3A）。CD14牲距，S100A8和S100A9在正常和敗血癥驅(qū)動(dòng)的單核細(xì)胞中均大量表達(dá)****返咱，在轉(zhuǎn)錄水平上顯示出經(jīng)典的單核細(xì)胞譜（圖3B）。此外嗅虏，敗血癥驅(qū)動(dòng)的單核細(xì)胞中的HLA-DRB1和HLA-DRA與正常相比顯著下調(diào)洛姑，這提示單核細(xì)胞的免疫衰竭（圖3B，C）皮服。炎癥相關(guān)蛋白在化膿性單核細(xì)胞（如CCL3楞艾，IL1B参咙，CCL4，NLRP3）中被急性激活并增加（圖3D）硫眯。同樣蕴侧，敗血癥的單核細(xì)胞中炎癥相關(guān)的途徑（IL-6信號(hào)途徑和補(bǔ)體反應(yīng)等）也得到增強(qiáng)。同時(shí)两入，單核細(xì)胞的凋亡被激活净宵，氧化磷酸化被明顯抑制（圖3D）。有趣的是裹纳，雄激素反應(yīng)也明顯降低（圖3D）择葡。
圖3單核細(xì)胞細(xì)胞簇的單細(xì)胞分析
（A）6個(gè)單核細(xì)胞簇的二維tSNE可視化，不同的顏色代表不同的簇（CCL3L1 +單核細(xì)胞剃氧，CD14 + NEAT1 + CCR1 +單核細(xì)胞敏储，CD14 + NEAT1 + SELL +單核細(xì)胞，CD16 +單核細(xì)胞朋鞍，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞已添，NEAT1 + CD163 +單核細(xì)胞/ DC ）（頂部和底部）分別顯示對(duì)照和敗血癥；
（B）對(duì)照和敗血癥中與單核細(xì)胞相關(guān)的代表性選擇基因的表達(dá)滥酥，用小提琴圖表示更舞；
（C）熱圖代表來自對(duì)照和敗血癥的單核細(xì)胞中表達(dá)最高的差異基因，正常組中高表達(dá)20個(gè)基因坎吻，敗血癥中高表達(dá)20個(gè)基因缆蝉；
（D）正常和敗血癥誘導(dǎo)的單核細(xì)胞之間信號(hào)途徑差異的條形圖。
來自敗血癥的單核細(xì)胞聚集成6個(gè)子集禾怠，其中大多數(shù)細(xì)胞增殖很明顯（圖3A返奉，4A）。值得詳細(xì)研究每個(gè)樣本中每個(gè)子集的變化吗氏。6個(gè)簇中的細(xì)胞比例在敗血癥中劇烈波動(dòng)（圖4B）芽偏。與其他子集相反，聚類8（單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）和聚類11（CD16 +單核細(xì)胞）都引人注目弦讽。作者分別比較了正常和敗血癥中簇8和簇11的重要基因特征污尉，以評(píng)估其由敗血癥驅(qū)動(dòng)的獨(dú)特生物學(xué)特性（圖4C，D）往产。值得注意的是被碗，與對(duì)照相比，總共7個(gè)敗血癥中HLA-DQB1和HLA-DRA均被下調(diào)（圖4C）仿村。在這里锐朴，敗血癥的CCL家族（CCL4L，CCL3蔼囊，CCL4焚志，CCL3L）與正常人相比有所增加衣迷，但是在7名敗血癥患者中其表達(dá)水平的差異是顯著的（圖4D）。此外酱酬，與對(duì)照有關(guān)的患者中TNF的表達(dá)顯著上調(diào)壶谒，在所有敗血癥樣品中高度一致（圖4D）。分層聚類分析顯示膳沽，在敗血癥驅(qū)動(dòng)的單核細(xì)胞的6個(gè)子集之間汗菜，代表性信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間存在顯著差異，例如挑社，在大多數(shù)典型途徑中陨界，簇5被激活，而簇3和簇7均被強(qiáng)烈抑制（圖4E）滔灶。
圖4單核細(xì)胞簇在基因表達(dá)和信號(hào)通路中的變化
（A）單核細(xì)胞的tSNE可視化普碎，不同顏色代表6個(gè)簇（簇3CD14 + NEAT1 + SELL +）吼肥；群集5（CD14 + NEAT1 + CCR1 +）; 集群6（CCL3L1 +）; 群集7（NEAT1 + CD163 +）; 第8類（巨噬細(xì)胞）; 群集11（CD16 +）录平，針對(duì)于于原始群集。右（上和下）分別顯示正常對(duì)照和敗血癥患者缀皱。
（B）PBMC中群集百分比的條形圖斗这；
（C，D）熱圖代表每個(gè)樣品（2個(gè)對(duì)照組和7個(gè)敗血癥患者）單核細(xì)胞簇8和簇11中表達(dá)的最高差異基因啤斗，正常組中20個(gè)基因高表達(dá)表箭，而20個(gè)基因高表達(dá)敗血癥
（E）6個(gè)單核細(xì)胞簇中差異信號(hào)途徑的分層聚類分析，紅色和藍(lán)色分別表示增強(qiáng)和抑制途徑活性钮莲。
綜上所述免钻，單核細(xì)胞進(jìn)一步聚集為6個(gè)亞群，它們大量增殖并在敗血癥的驅(qū)動(dòng)下改變了生物學(xué)特性崔拥。
4. 敗血癥指標(biāo)與單核細(xì)胞簇的相關(guān)性
為了研究敗血癥指標(biāo)與單核細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)极舔，作者進(jìn)行了Spearman秩相關(guān)分析。PBMC中第7類和第11類的比例分別與ICU中的NEWS得分第一天和ICU中的PaO 2 / FiO 2第一天顯著正相關(guān)（圖5A）链瓦。此外拆魏，詳細(xì)證明了臨床指標(biāo)與化膿性單核細(xì)胞簇中代表性基因表達(dá)之間的相關(guān)性（圖5B）。
圖5 敗血癥中敗血癥臨床指標(biāo)與單核細(xì)胞簇之間的關(guān)聯(lián)
（A）PBMC中臨床指標(biāo)與簇的百分比之間的相關(guān)性慈俯；
（B）在簇6渤刃、7、8贴膘、11中臨床指標(biāo)與代表性基因表達(dá)之間的相關(guān)性卖子。Spearman等級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析（校正后的P <0.05）；紅色和藍(lán)色分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)刑峡。
總結(jié)
在本文中洋闽，作者收集了來自供體和敗血癥患者的PBMC璃哟，然后通過基于BD Rhapsody的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析了敗血癥驅(qū)動(dòng)的PBMC的功能和組成的變化。PBMC分為6種細(xì)胞類型喊递，包括B細(xì)胞随闪，DC，單核細(xì)胞骚勘，NK細(xì)胞铐伴，NKT細(xì)胞和T細(xì)胞。作者進(jìn)一步分析了敗血癥驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞和單核細(xì)胞的變化俏讹。值得注意的是当宴，單核細(xì)胞可以詳細(xì)分為6個(gè)子集（CD14 + NEAT1 + SELL +單核細(xì)胞，CD14 + NEAT1 + CCR1 +單核細(xì)胞泽疆，NEAT1 + CD163 +單核細(xì)胞户矢，CCL3L1 +單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞殉疼，CD16 +單核細(xì)胞）梯浪，其中大多數(shù)在敗血癥中增殖。顯示了T細(xì)胞和單核細(xì)胞的生物學(xué)特性（種群遷移瓢娜，基因表達(dá)挂洛，信號(hào)通路），其中大多數(shù)與免疫力和炎癥有關(guān)眠砾。最后虏劲，作者進(jìn)一步分析了單核細(xì)胞簇中代表性基因譜與患者臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。一些基因的表達(dá)與敗血癥臨床指標(biāo)高度相關(guān)褒颈，這提示可能通過單細(xì)胞測序找到新的診斷或治療敗血癥的靶標(biāo)柒巫。這個(gè)想法是新穎的，需要進(jìn)一步研究谷丸。
出乎意料的是堡掏，諸如NEAT1（圖3B），MALAT1和LINC01871之類的LncRNA被單核細(xì)胞淤井，DC和其他細(xì)胞（簇7定義為NEAT1 + CD163 +單核細(xì)胞/ DC布疼；簇17，NEAT1 + CD1c + DC）覆蓋币狠。高表達(dá)LncRNA敗血癥是零星報(bào)道（24游两，25）提出了敗血癥的診斷生物標(biāo)志物，并涉及NF-κB炎癥信號(hào)通路漩绵。在這項(xiàng)研究中贱案，作者顯示至少在四個(gè)單核細(xì)胞簇中，尤其是單核細(xì)胞和DC中，NEAT1升高宝踪，暗示在不同的單核細(xì)胞中具有正功能侨糟。
參考：
1.單細(xì)胞（BD Rhapsody）分選系統(tǒng)操作質(zhì)控流程
http://www.novelbio.com/blog/c2/8.html
2.揭秘單細(xì)胞測序黑馬BD的5大隱藏技能 - 新聞 - 儀器譜
