細(xì)胞凍存技術(shù)
1. 細(xì)胞凍存是將細(xì)胞儲存在低溫環(huán)境中，減少細(xì)胞代謝，實(shí)現(xiàn)長期儲存的一種技術(shù)复凳。
2. 在大多數(shù)細(xì)胞系中，細(xì)胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變灶泵，造成表型和基因型的“培養(yǎng)漂移”育八，在凍存過程中，適當(dāng)?shù)牟僮骱秃线m的凍存條件可以減少細(xì)胞特性的改變或丟失丘逸，起到細(xì)胞保種的作用单鹿。因而，正確且成功的凍存對于細(xì)胞的長久應(yīng)用起著非常重要的作用深纲。
細(xì)胞凍存原理
1. 當(dāng)溫度低至-70℃時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性全部停止劲妙，代謝活動停止湃鹊，故實(shí)現(xiàn)長期保存的目的。
2. 隨著溫度降低镣奋，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)晶币呵，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞，從而引起細(xì)胞死亡，特別是0~-20℃的階段余赢，冰晶呈針狀芯义，及其引發(fā)細(xì)胞損傷。在不加任何保護(hù)劑條件下直接凍存細(xì)胞時妻柒，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶扛拨，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高举塔、滲透壓改變绑警、脫水、pH改變央渣、蛋白變性等计盒，能引起細(xì)胞死亡。
3. 常見的冷凍保護(hù)劑是甘油或二甲基亞砜（DMSO）芽丹。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞北启，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過程拔第，同時增加細(xì)胞膜的通透性咕村，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成楼肪，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的培廓。
保護(hù)劑的選擇
1. 細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑春叫。在細(xì)胞凍存中肩钠， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到暂殖。
2. 對特別敏感的細(xì)胞在凍存時需測試適用的凍存液价匠。例如神經(jīng)元細(xì)胞凍存時需選擇無血清凍存液，避免復(fù)蘇后分化呛每。
為什么要進(jìn)行細(xì)胞凍存踩窖？
·?有限細(xì)胞系形態(tài)及代謝活動維持
·?珍貴細(xì)胞保種
·?細(xì)胞株標(biāo)準(zhǔn)品制備
·?臍帶血干細(xì)胞、NK細(xì)胞凍存
細(xì)胞凍存的最佳時期
1. 用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞對數(shù)生長期晨横，匯合度約 90% 的時候洋腮，這時細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多手形，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液啥供。
2. 對培養(yǎng)物進(jìn)行微生物污染物檢測，特別是支原體库糠，確保細(xì)胞沒有任何的污染伙狐。在細(xì)胞的收集過程中，實(shí)驗(yàn)操作要盡可能的溫和，避免細(xì)胞受損贷屎。
細(xì)胞凍存的速率
1. 細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害罢防。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的唉侄。
2. 梯度降溫法：4℃-30 min咒吐，20℃- 2h，-80℃冰箱冷凍過夜美旧，次日將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存渤滞。
3. 細(xì)胞程序降溫盒，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞凍存管放進(jìn)凍存盒榴嗅，直接在-80℃過夜后就可以轉(zhuǎn)移至液氮罐中妄呕。
4.?在轉(zhuǎn)移存放位置的過程中一定要迅速，轉(zhuǎn)移時建議將凍存管放在干冰中恒溫嗽测，盡量避免轉(zhuǎn)移過程因溫度變化對細(xì)胞活力的影響绪励。
凍存環(huán)境
1. 細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。
2. 細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低唠粥。
3. 液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間疏魏，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層晤愧，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮大莫，需要經(jīng)常添加)。
HyCyte?一步凍存液
HyCyte?凍存液是一種即用型官份、無血清只厘、無需程序降溫的細(xì)胞“長期”凍存液，該產(chǎn)品配方使用已超過15年舅巷，原料均從日本進(jìn)口羔味，凍存品質(zhì)與日本產(chǎn)品一致。
·?安全：無血清钠右，不含異種動物成份
·?廣譜：適合多種細(xì)胞類型
·?高效：復(fù)蘇后細(xì)胞保持高活性及快速增殖? 能力赋元，不影響細(xì)胞功能
·?方便：即用型，無需額外配制飒房，無需程序降溫盒及稀釋
一步凍存液使用流程
一步凍存液的作用機(jī)理:
細(xì)胞膜保護(hù)劑—可在細(xì)胞膜外瞬間形成一層保護(hù)膜搁凸，保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞外冰晶的損害。
滲透性保護(hù)劑—可迅速滲透至細(xì)胞內(nèi)部狠毯，防止細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量冰晶坪仇，同時可保護(hù)細(xì)胞器，減少其在低溫下的損傷垃你。
細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑—可平衡細(xì)胞沉降速度，防止細(xì)胞在凍存過程中聚集成團(tuán)。
