The single-cell transcriptional landscape of lung carcinoid tumors
肺類癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄景觀
發(fā)表期刊：Int J Cancer
發(fā)表日期：2022 Jun 15
影響因子：7.316
DOI:? 10.1002/ijc.33995
一昌跌、研究背景
????????肺癌是一種異質(zhì)性疾病土砂，包括不同的組織病理學(xué)亞型狸剃。除了腺癌和鱗狀細(xì)胞癌外危队，2021年WHO的分類中還包含了肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NENs）的類別。該類別包括高級神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NECs）剥啤、小細(xì)胞肺癌（SCLC）和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌（LCNEC）以及肺部低級和中級神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NETs）欺嗤，也分別稱為典型和非典型類癌。
????????傳統(tǒng)的肺癌亞型累驮，即腺癌和鱗狀細(xì)胞癌酣倾，以及NECs都與吸煙有關(guān)，并以高腫瘤突變負(fù)擔(dān)為特征谤专。相比之下躁锡，肺類癌影響年輕患者和非吸煙者，其突變負(fù)荷低得多置侍，致癌突變譜也不同映之。此外，預(yù)測現(xiàn)代靶向和免疫療法的療效受到腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的限制蜡坊，腫瘤內(nèi)可能藏有原發(fā)耐藥的腫瘤細(xì)胞亞克隆杠输，以及復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，調(diào)節(jié)著針對腫瘤的免疫反應(yīng)秕衙。單細(xì)胞基因表達(dá)分析可以克服這一限制抬伺，并且已經(jīng)為肺腺癌的細(xì)胞異質(zhì)性提供了寶貴的見解。
二灾梦、材料與方法
1峡钓、數(shù)據(jù)來源
1） 在術(shù)中病理學(xué)家會診時獲得約0.1至0.5cm的腫瘤組織和正常肺實(shí)質(zhì)的新鮮組織樣本
2） 從GitHub下載大塊樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)
2妓笙、分析流程
1） 組織解離和單細(xì)胞分離、單細(xì)胞RNA測序能岩、H&E和免疫染色
2） 單細(xì)胞基因表達(dá)分析：預(yù)處理寞宫、細(xì)胞類型注釋
3） 差異性基因表達(dá)分析：在對上皮細(xì)胞進(jìn)行差異化基因表達(dá)分析之前，對腫瘤樣本中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行亞組化拉鹃，并對基因表達(dá)進(jìn)行重構(gòu)辈赋；免疫和基質(zhì)亞群被分成淋巴、骨髓膏燕、內(nèi)皮和成纖維/平滑肌亞群钥屈，并重新調(diào)整基因表達(dá)；使用FindAllMarkers函數(shù)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)以計(jì)算每個細(xì)胞簇的標(biāo)記基因與該亞群的所有其他簇的關(guān)系
4） 功能分析：細(xì)胞周期階段是用CellCycleScoring函數(shù)分配的坝辫；使用AddModuleScore函數(shù)對功能相關(guān)的基因簽名的表達(dá)進(jìn)行評分篷就；將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分配給分子集群，選擇每個分子集群與另外兩個集群中上調(diào)幅度最大的50個基因近忙，并分別合并為一個基因組（A1 vs A2和A1 vs B為基因組A1竭业；A2 vs A1和A2 vs B為基因組A2；B vs A1和B vs A2為基因組B)及舍；使用AddModuleScore函數(shù)對得到的三個基因組（A1未辆、A2、B）的表達(dá)進(jìn)行評分
5） 大量基因表達(dá)和生存分析：在過濾掉位于性染色體和線粒體上的基因后锯玛，使用DESeq2工具包的VarianceStabilizingTransformation功能將大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化咐柜；單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)被分成骨髓、淋巴攘残、內(nèi)皮和成纖維/平滑肌子集拙友，并進(jìn)行了重新劃分；使用R工具包GSVA的gsva函數(shù)肯腕，對大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本基因集富集分析（ssGSEA）献宫；生存曲線钥平、對數(shù)統(tǒng)計(jì)和Cox回歸是用R軟件包survive和survminer計(jì)算的
三实撒、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - 單細(xì)胞RNA測序揭示了肺類癌的細(xì)胞多樣性
????????為了在單細(xì)胞水平上探索肺類癌及其腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞組成，作者從3名接受初治手術(shù)的肺類癌患者（患者1-3涉瘾，圖1A）收集了腫瘤組織和正常肺實(shí)質(zhì)的新鮮組織樣本知态。所有三名患者的腫瘤細(xì)胞都生長在固體巢中，并有神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記蛋白突觸素和色氨酸A的表達(dá)（圖1B）立叛。腫瘤包括一個典型的類癌（患者1）负敏，一個具有高增殖活性的非典型類癌（患者2）和一個具有局灶性腫瘤壞死的非典型類癌（患者3）。兩個非典型類癌病例（患者2和3）在診斷時都有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移秘蛇。在隨后的分析中包括了先前發(fā)表的隊(duì)列（患者4-10）的7個正常肺組織樣本的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)其做，總共分析了73 105個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組顶考，其中64 697個高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組在質(zhì)量控制和過濾后仍然存在（圖1C）。
????????通過UMAP對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行可視化妖泄，發(fā)現(xiàn)正常和腫瘤組織樣本之間有明顯的變化（圖1D）驹沿。不同患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在許多集群中重疊，排除了不同樣本的系統(tǒng)性批次效應(yīng)（圖1E）蹈胡。在上皮細(xì)胞渊季、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞區(qū)塊中，由典型標(biāo)記基因的基因表達(dá)定義罚渐，觀察到腫瘤特有的變化(圖1F)却汉。在腫瘤組織樣本中，大多發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組荷并，而免疫單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在正常組織樣本中更為豐富（圖1G）合砂。
02 - 肺類癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性反映了臨床病理特征和分子亞型
????????為了進(jìn)一步分析上皮細(xì)胞區(qū)塊，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組被亞組化并重新聚類璧坟。在正臣饶拢或腫瘤組織樣本中過度代表的上皮細(xì)胞簇被分別指定為正常或腫瘤細(xì)胞簇（圖S2A,B）雀鹃。觀察到正常細(xì)胞簇由不同的病人共享幻工，而腫瘤細(xì)胞簇則具有高度的患者特異性（圖2A）。在正常細(xì)胞簇中黎茎，使用規(guī)范標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因特征囊颅，確定了肺泡上皮1型和2型、纖毛細(xì)胞傅瞻、棒狀細(xì)胞（club cell）和基底細(xì)胞（圖2A,B）踢代。正如高度患者特異性的腫瘤細(xì)胞集群所表明的那樣，在不同患者的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)的基因（圖2C）嗅骄，如CD44胳挎、TFF3和EGFR，這些基因與不同的蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)溺森，如免疫組織化學(xué)所示（圖2D）慕爬。患者1的典型類癌中的高表達(dá)基因包括許多與良好預(yù)后相關(guān)的基因屏积，如MT1G医窿、MT1M、MT1X炊林、PCK1姥卢、LPL、CD44。雖然發(fā)現(xiàn)不同腫瘤病例之間存在明顯的轉(zhuǎn)錄差異独榴，但單個腫瘤內(nèi)的轉(zhuǎn)錄譜是相當(dāng)均勻的僧叉，主要取決于每個細(xì)胞的讀數(shù)和基因數(shù)量（圖S2C-F）。
????????為了進(jìn)一步探索病人之間的異質(zhì)性棺榔，作者從單細(xì)胞基因表達(dá)譜推斷出不同的功能特征彪标，即細(xì)胞周期階段、線粒體讀數(shù)比例和信號通路活性掷豺±萄蹋患者2的腫瘤細(xì)胞在S期的比例最高，同時在免疫組化中顯示最高的Ki67增殖指數(shù)（圖2E）当船。在患者3的腫瘤細(xì)胞中觀察到最高比例的線粒體讀數(shù)题画，其特點(diǎn)是局灶性腫瘤壞死（圖2F）〉缕担患者3的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在表皮生長因子受體通路活性方面有很高的得分苍息，并且在蛋白質(zhì)水平上有很強(qiáng)的表皮生長因子表達(dá)（圖2D,G）。雌激素和雄激素受體信號傳導(dǎo)的通路活性得分與患者的性別相關(guān)（圖2G壹置；并見圖1A的臨床特征）竞思。最近，有研究表明钞护，根據(jù)轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征盖喷，肺類癌可以被細(xì)分為三個不同的分子簇。在本研究單細(xì)胞基因表達(dá)譜中难咕，可以將患者2和3的腫瘤歸入A1簇课梳，而患者1的腫瘤則同時歸入A2簇和B簇（圖2H）。值得注意的是余佃，免疫和基質(zhì)細(xì)胞區(qū)塊只表現(xiàn)出分子簇基因特征的少量表達(dá)分?jǐn)?shù)暮刃。
03 - 肺類癌的免疫微環(huán)境以非炎癥性單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞為特征
????????為了發(fā)現(xiàn)免疫微環(huán)境的細(xì)胞組成，對免疫單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了亞組化和重新聚類爆土。作者利用典型的標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因簽名（圖3A,B）椭懊，確定了免疫細(xì)胞區(qū)間內(nèi)各種不同的細(xì)胞類型。
????????????確定了不同的淋巴細(xì)胞步势，如常規(guī)T細(xì)胞氧猬、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞立润、B細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖3A和S4A,B）狂窑。平均而言媳板，腫瘤組織中淋巴細(xì)胞類型的比例與正常組織非常相似桑腮，同時也注意到腫瘤和正常組織中存在一些患者間的異質(zhì)性。反映淋巴細(xì)胞的幼稚性蛉幸、細(xì)胞毒性或衰竭的基因特征在正常和腫瘤組織中表現(xiàn)出相似的表達(dá)分?jǐn)?shù)（圖3C）破讨。在所有的淋巴細(xì)胞類型中丛晦，衰竭的簽名得分都很低√崽眨總之烫沙，肺癌的淋巴細(xì)胞微環(huán)境與正常肺實(shí)質(zhì)的淋巴細(xì)胞區(qū)相類似。
????????在骨髓細(xì)胞區(qū)隙笆，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞锌蓄、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在腫瘤和正常組織中的豐度不同（圖3A和S4A撑柔，C）瘸爽。在單核細(xì)胞中，經(jīng)典的單核細(xì)胞群2在腫瘤組織中富集（圖3D）铅忿。傳統(tǒng)的樹突狀細(xì)胞包括兩個集群剪决，其中CD141+集群1主要在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)（圖3E）。除此之外檀训，還發(fā)現(xiàn)了一個腫瘤富集的細(xì)胞群柑潦，它同時具有高表達(dá)水平的單核細(xì)胞標(biāo)志物，如CD14和LGMN峻凫，一個在分化的單核細(xì)胞中上調(diào)的基因（圖3B）渗鬼，結(jié)論是這個細(xì)胞簇代表了單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的譜系，或分化為樹突狀細(xì)胞（圖S4D）荧琼。雖然單核細(xì)胞和傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞的比例在不同患者的腫瘤與正常組織中異質(zhì)性增加乍钻，但在分析的所有三種類癌腫瘤中，單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞持續(xù)增加铭腕。單核細(xì)胞源性骨髓細(xì)胞的進(jìn)一步特征是SELENOP银择、C1QA、C1QB累舷、C1QC和趨化因子CCL3和CCL4的高表達(dá)（圖3F）浩考。與正常組織相比，腫瘤組織中的單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞顯示出與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的各種基因簽名的表達(dá)分?jǐn)?shù)相同或略低（圖3G）被盈。結(jié)果表明析孽，肺類癌的免疫微環(huán)境以非炎癥性單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞為主。
????????通過單細(xì)胞RNA測序分析的三個肺類癌只怎，骨髓細(xì)胞區(qū)的組成在一定程度上是異質(zhì)的袜瞬。為了在更大的隊(duì)列中研究患者間的異質(zhì)性，作者在已發(fā)表的肺類癌的大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中量化了特征性免疫細(xì)胞類型的標(biāo)記基因的表達(dá)身堡。在此邓尤，發(fā)現(xiàn)腫瘤富集的單核細(xì)胞源性髓系細(xì)胞群2和3的標(biāo)記基因與非典型類癌相關(guān)，與總生存期無關(guān)（圖S4E），表明肺類癌亞型之間的微環(huán)境差異汞扎。
04 - 血管細(xì)胞和CAF樣肌成纖維細(xì)胞構(gòu)成肺類癌的基質(zhì)微環(huán)境
????????????為了深入了解基質(zhì)微環(huán)境的組成季稳，對基質(zhì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了亞組化和重新聚類，作者使用典型的標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因簽名（圖4A,B）澈魄，確定了內(nèi)皮細(xì)胞景鼠、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的不同集群。
????????在內(nèi)皮細(xì)胞中痹扇，可以根據(jù)預(yù)定的標(biāo)記基因簽名區(qū)分支氣管铛漓、毛細(xì)血管、動脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（圖4A）鲫构。雖然不同亞型的內(nèi)皮細(xì)胞存在于正常肺實(shí)質(zhì)中票渠，但腫瘤組織中支氣管型內(nèi)皮細(xì)胞明顯富集（圖4A和S5A）。這里芬迄，大部分內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來自患者1的腫瘤问顷，與免疫染色顯示的密集血管相關(guān)（圖S5B）。腫瘤組織中的內(nèi)皮細(xì)胞顯示出INSR的高mRNA表達(dá)禀梳，INSR是腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記基因杜窄，和INSR蛋白的高表達(dá)（圖S5C，D）算途。此外塞耕，發(fā)現(xiàn)與血管生成有關(guān)的基因的高表達(dá)，如VWA1嘴瓤、COL15A1扫外、IGFBP7和GSN10（圖S5D）。
????????在腫瘤組織的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞區(qū)廓脆，發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞筛谚、血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞與正常組織相比明顯減少（圖4A）停忿。肌成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中強(qiáng)烈富集驾讲，并顯示出細(xì)胞外基質(zhì)成分的高表達(dá)，如COL1A1席赂、COL3A1和COL6A3吮铭，以及基質(zhì)降解酶，如SULF1（圖4C）颅停，表明這些細(xì)胞可能參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑谓晌。此外，肌成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)是TGFβ信號的高活性（圖4D）癞揉。在肌成纖維細(xì)胞內(nèi)纸肉，與肌成纖維細(xì)胞群2和其他成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞群相比溺欧，群1顯示了FAP和MMP11的特異性過表達(dá)，以及各種膠原蛋白的高表達(dá)（圖4E）毁靶。在一個獨(dú)立的肺類癌隊(duì)列中，肌成纖維細(xì)胞群1的標(biāo)記基因特征與非典型類癌明顯相關(guān)逊移，并與較差的總生存率相關(guān)（圖S5E）预吆。這些數(shù)據(jù)共同表明，肺類癌腫瘤組織中的肌成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征胳泉。
????????類癌的基質(zhì)微環(huán)境以血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞為主拐叉。被診斷為典型類癌的病例1中的周細(xì)胞比例最高，而被診斷為非典型類癌的患者2和3中的周細(xì)胞較少（圖4A）扇商。相應(yīng)地凤瘦，在一個獨(dú)立的肺類癌隊(duì)列中，周細(xì)胞標(biāo)記基因特征與典型類癌相關(guān)案铺，并與更好的總生存率相關(guān)（圖S5F）蔬芥。腫瘤組織中的周細(xì)胞顯示了RGS5（一種參與周細(xì)胞發(fā)育的基因）和ACTA2（一種平滑肌標(biāo)志基因）的高表達(dá)（圖4F）。平滑肌細(xì)胞表達(dá)低水平的周細(xì)胞標(biāo)記基因控汉，如COX4I2和PDGRB（圖4C）笔诵。作者發(fā)現(xiàn)這些基因以一種分級的方式表達(dá)，表明在腫瘤組織中姑子，周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞形成一個連續(xù)體乎婿，而不是獨(dú)立的細(xì)胞類型（圖4G）。這些結(jié)果表明街佑，肺癌的基質(zhì)微環(huán)境是由讓人聯(lián)想到癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞谢翎，以及血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞組成的。肌成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞可能分別與較差和較好的總生存率有關(guān)沐旨。
05 - 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞之間的相互作用可能激活NOTCH森逮、VEGF、TGFβ和JAK/STAT信號
????????作者觀察到磁携，不同的細(xì)胞類型在肺癌微環(huán)境中被特異性地富集（圖5A）吊宋。為了劃定微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞之間的功能關(guān)系，量化了潛在的旁分泌受體-配體相互作用颜武。大多數(shù)潛在的相互作用是在基質(zhì)微環(huán)境的細(xì)胞類型之間發(fā)現(xiàn)的璃搜，涉及腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞鳞上、血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞这吻，而腫瘤細(xì)胞較少參與潛在的旁分泌相互作用（圖5B）。潛在相互作用的數(shù)量與每個細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)或mRNA計(jì)數(shù)的平均數(shù)無關(guān)篙议。專注于最相關(guān)的信號通路唾糯，作者發(fā)現(xiàn)許多可能激活NOTCH怠硼、TGFβ、VEGF和JAK/STAT信號的相互作用（圖5C）移怯。腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞可能接受VEGF香璃、TGFβ和NOTCH通路的激活信號，而肌成纖維細(xì)胞主要接受TGFβ通路的激活信號舟误，都是通過各種旁分泌和自分泌的相互作用葡秒。樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞主要通過與其他免疫細(xì)胞的自分泌和旁分泌相互作用接受潛在的JAK/STAT途徑激活信號嵌溢。這些結(jié)果表明眯牧，各種基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的自分泌和旁分泌相互作用可能塑造了肺類癌腫瘤的微環(huán)境。
四赖草、結(jié)論
????????在這項(xiàng)研究中学少，通過對三個類癌腫瘤和正常肺組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，全面分析了肺類癌的細(xì)胞組成秧骑。表明類癌細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜反映了臨床病理特征版确，并允許分配到最近定義的分子集群中。此外乎折，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)是具有非炎癥特征的單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞阀坏、腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、一系列血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞以及具有癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞特征的肌成纖維細(xì)胞笆檀。本研究分析為進(jìn)一步研究肺類癌腫瘤微環(huán)境忌堂、潛在的預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物以及新的治療目標(biāo)提供了基礎(chǔ)。
