說起Western blot，雖是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)就谜，但還是讓很多研究生頭疼怪蔑，我第一次做WB時(shí)的丑圖至今歷歷在目。圖丑點(diǎn)倒也就算了丧荐，怕就怕實(shí)驗(yàn)快做完了缆瓣，卻沒有十足的勇氣去顯影。生怕忙活了幾天又是大白板篮奄。
這一類型的實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力捆愁，一著不慎，滿盤皆輸窟却。因此每一步都需要謹(jǐn)慎謹(jǐn)慎再謹(jǐn)慎昼丑。
最好是慢慢的想，想清楚了就快快的做夸赫。所以有必要對WB有更深一層的理解和認(rèn)識菩帝。
所謂知己知彼，百戰(zhàn)不殆茬腿！
【進(jìn)入正題】
1 背景介紹
蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot呼奢。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法切平。
蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的握础。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。
現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究悴品、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個(gè)方面禀综。
2 基本原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)苔严，“探針”是抗體定枷，“顯色”用標(biāo)記的二抗。
經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品届氢，轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF或NC膜上欠窒，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變退子。
以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原岖妄，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)寂祥，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分衣吠。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
圖片來源：Bing
3 主要步驟及說明
（這里只對主要步驟的原理進(jìn)行說明壤靶，切不可作為protocol）
第一步：SDS-PAGE電泳
具體原理可見
第二步：轉(zhuǎn)膜
我們把經(jīng)轉(zhuǎn)膜操作后的NC膜就成為一個(gè)印跡（blot），WB中常用的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物有硝酸纖維素膜（NC）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）惊搏。那這兩種膜各有什么特點(diǎn)呢贮乳？
NC膜：
在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下忧换，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與NC膜發(fā)生疏水作用而結(jié)合在一起，具有很高的親和力向拆。且易于封閉非特異性結(jié)合亚茬。在非離子去污劑的作用下，結(jié)合的蛋白易于被洗脫浓恳。當(dāng)然刹缝，根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的NC膜颈将。
PVDF膜：
PVDF膜是一種疏水性聚合物梢夯，在水溶液中不會被浸濕，為了在水性緩沖液中使用PVDF膜晴圾，首先需將其浸泡在50%（v/v）的醇溶液中（甲醇颂砸、乙醇和異丙醇），浸泡后會活化膜上的正點(diǎn)基團(tuán)死姚，使其更易與帶負(fù)電荷的蛋白結(jié)合人乓。
同樣，根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小都毒，要選擇不同孔徑的PVDF膜色罚。
第三步：封閉
脫脂奶粉或5%BSA溶液處理，以封閉膜上的疏水結(jié)合位點(diǎn)账劲。
第四步：孵一抗
這里的一抗是目的蛋白的一抗戳护。孵育時(shí)只有目的蛋白才能與一抗結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣在清洗出去未結(jié)合一抗后涤垫，只有目的蛋白上結(jié)合有一抗姑尺。
第五步：孵二抗
這里的二抗是指一抗的抗體。如一抗是鼠一抗蝠猬，則二抗就是抗鼠IgG的抗體切蟋。孵育后的帶有酶（堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶）標(biāo)記的二抗（也是俗稱的酶標(biāo)二抗）與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物榆芦，至此可用來指示一抗的位置柄粹，也即指示了目的蛋白的位置。
那到底什么是抗體呢匆绣？
抗體（antibody）驻右，又稱免疫球蛋白（immunoglobulin，簡稱Ig）崎淳，是一種主要由漿細(xì)胞分泌堪夭，被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等病原體的大型Y形蛋白質(zhì)，僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動物的血液等體液中森爽，及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面恨豁。抗體能通過其可變區(qū)唯一識別特定外來物的一個(gè)獨(dú)特特征爬迟，該外來目標(biāo)被稱為抗原橘蜜。
蛋白上Y形的其中兩個(gè)分叉頂端都有一被稱為互補(bǔ)位（抗原結(jié)合位）的鎖狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)僅針對一種特定的抗原表位付呕。這就像一把鑰匙只能開一把鎖一般计福，使得一種抗體僅能和其中一種抗原相結(jié)合。
抗體和抗原的結(jié)合完全依靠非共價(jià)鍵的相互作用徽职，這些非共價(jià)鍵的相互作用包括氫鍵象颖、范德華力、電荷作用和疏水作用活箕。
哺乳類動物抗體的種型
（請放大后查看圖片）
1.?抗原結(jié)合區(qū)（Fab）
2.?抗原結(jié)晶區(qū)（Fc）
3. 藍(lán)色的重鏈有一個(gè)可變區(qū)（VH）力麸，緊隨其后的一個(gè)恒定區(qū)（CH1），一個(gè)樞紐區(qū)育韩，以及另兩個(gè)恒定區(qū)（CH2 and CH3）組成
4. 綠色的輕鏈包含一個(gè)可變區(qū)（VL）以及一個(gè)恒定區(qū)（CL）
5. 抗原結(jié)合點(diǎn)6. 樞紐區(qū).
4 常見問題及解決方法
這部分關(guān)于WB常見問題及解決方法克蚂，經(jīng)總結(jié)之后發(fā)現(xiàn)，由于該實(shí)驗(yàn)周期長筋讨，環(huán)節(jié)多埃叭，任何一步出問題都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以在這里也沒辦法一一羅列悉罕。
總的來說赤屋，從蛋白的制備，轉(zhuǎn)膜壁袄，抗體孵育到顯影类早，只要每一步都精細(xì)操作，在合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的情況下都問題不大嗜逻。如果遇到千奇百怪的情況涩僻，還需從自身出發(fā)反思實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。
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