這篇文章于2023年7月發(fā)表于Cancer Cell（IF=50.3，Clearance of senescent macrophages ameliorates tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer）荆几，是一篇用特殊工具小鼠探討衰老對腫瘤微環(huán)境組分細胞（主要是巨噬細胞和內(nèi)皮細胞）以及腫瘤進展的影響苹支，相關(guān)探究思路和發(fā)現(xiàn)比較新穎有趣，感興趣的同學(xué)可以參考一下俱济。

研究意義：細胞衰老是以細胞周期停滯并伴隨基因表達改變嘶是，但細胞活性和代謝正常為特征的過程，與癌癥和衰老有關(guān)蛛碌。以P16INK4A為代表的細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白表達上調(diào)聂喇、溶酶體擴張（β半乳糖苷酶活性增加）和衰老相關(guān)分泌物（SASP，包括促炎因子蔚携、生長因子和胞外組織重構(gòu)物質(zhì)等）的分泌上調(diào)是其主要分子特征希太。最初認為細胞衰老能抑制腫瘤細胞增殖所以具有抗腫瘤作用，但越來越多的研究表明酝蜒，細胞衰老可以通過SASP介導(dǎo)的細胞間相互作用促進機體衰老及癌癥等疾病進展誊辉。P16INK4A作為一個被廣泛認可的衰老標志物，在衰老和多種癌癥進展過程表達增加亡脑，而敲除該基因能緩解衰老并抑制腫瘤進展堕澄，但P16INK4A對腫瘤微環(huán)境（TME）的作用及其具體調(diào)控機制未知，且領(lǐng)域缺乏一個比較特異的轉(zhuǎn)基因工具小鼠以在體內(nèi)水平對其進行功能驗證霉咨。因此蛙紫，構(gòu)建理想的靶向P16INK4A的小鼠，并使用該小鼠揭示細胞衰老對TME的影響及其機制途戒，對腫瘤發(fā)病機制解析坑傅、新靶點的發(fā)現(xiàn)以及腫瘤的臨床治療具有重要意義。

研究策略： 這篇文章以“細胞衰老對腫瘤微環(huán)境的影響”為主要探究內(nèi)容喷斋，構(gòu)建了可以標記以及靶向去除衰老細胞的轉(zhuǎn)基因工具小鼠唁毒。利用該小鼠矢渊，作者實現(xiàn)了對衰老細胞的體內(nèi)追蹤和操縱，同時結(jié)合可標記癌細胞的轉(zhuǎn)基因小鼠枉证，找到了TME中與衰老相關(guān)的細胞群體矮男，并利用單細胞和免疫熒光等技術(shù)對其進行了鑒定。最后室谚，再在病人樣本中進行驗證毡鉴，增強故事的臨床意義。

研究方法：

1秒赤、Generation of the p16-FDR mouse model

作者首先構(gòu)建了p16-FDR轉(zhuǎn)基因小鼠模型猪瞬，在小鼠p16基因3’端插入Flippase重組酶（FLPo）-白喉毒素受體-mCherry融合蛋白編碼基因（圖1A，F(xiàn)LPo FLPo可以介導(dǎo)FRT序列間的基因重組入篮，從而激活或抑制基因表達陈瘦；白喉毒素受體可與白喉毒素結(jié)合誘導(dǎo)細胞凋亡；mCherry可以表達紅色熒光蛋白）潮售。對該質(zhì)粒系統(tǒng)進行檢測的結(jié)果顯示痊项，衰老p16FDR/+細胞表達mCherry熒光，且mCherry陽性細胞增殖減慢酥诽，p16FDR/+和mCherry表達增加（圖1B-C）鞍泉。RNA-seq結(jié)果表明，mCherry陽性細胞衰老相關(guān)基因表達增加肮帐，而增殖相關(guān)基因表達減少（圖1D）咖驮。進一步對插入的FLPo和白喉毒素受體進行檢測，向p16FDR/+細胞導(dǎo)入frt-STOP-frt-GFP報告質(zhì)裂凳啵可使GFP表達托修，而p16+/+細胞沒有GFP表達，而且用白喉毒素處理p16FDR/+細胞后細胞大量減少（圖1E-F）恒界。此外睦刃， p16FDR/+和p16+/+小鼠在生理和肺癌條件下的存活和腫瘤進展沒有顯著差異（見原文）。年輕和老年小鼠mCherry檢測結(jié)果顯示仗处，老年小鼠多個組織器官表達mCherry眯勾。因此，p16FDR/+小鼠適用于p16與癌癥及衰老相關(guān)性研究婆誓。

圖1

2、p16INK4a-Expressing cells with senescent features aremostly present in the lung TME

以非小細胞肺癌為模型也颤，以p16FDR/+小鼠為工具洋幻，作者探究了p16對肺癌進展的影響。這里作者使用KrasG12D/+翅娶；p16FDR/+文留；Rosa26loxP-STOP-loxP-YFP/+三雜合小鼠（KY-FDR）進行探究（外源導(dǎo)入表達Cre酶的病毒可誘導(dǎo)KRAS-G12D和YFP表達好唯，從而構(gòu)建癌癥模型同時使用YFP對腫瘤細胞進行追蹤）。用過表達Cre的腺病毒感染小鼠誘導(dǎo)KRAS-G12D和YFP表達后第8周燥翅，KY-FDR小鼠開始表達mCherry骑篙，且大部分mCherry陽性細胞表達p16和p21，但不表達Ki67和pRb等增殖標志物森书，表明細胞處于非增殖/衰老狀態(tài)（圖2A-B）靶端。在感染Cre腺病毒第2周，mCherry與YFP存在明顯共定位凛膏，表達p16和p21杨名，增殖標志物表達較少。但在感染后第8周猖毫，mCherry和YFP共定位顯著減少台谍，mCherry陽性細胞表達p16和p21，但不表達增殖標志物（圖2C）吁断。用RNA-seq對KY-FDR小鼠來源的三群細胞進行測序和分析（mCherry陽性細胞趁蕊、YFP陽性細胞以及mCherry和YFP雙陰細胞）：mCherry陽性細胞的細胞周期抑制蛋白、SASP以及溶酶體相關(guān)基因表達增加仔役，促細胞周期進展基因表達減少介衔，而YFP單陽細胞則相反，雙陰細胞則主要富集了免疫細胞相關(guān)基因（圖2D-G）骂因。因此炎咖，非小細胞肺癌TME存在很多p16陽性的衰老非腫瘤細胞。

圖2

3寒波、Macrophages and endothelial cells are the predominant senescent cell types found in KRAS-driven tumor-bearing lungs

接下來乘盼，作者用探究了mCherry和YFP陽性細胞的類型。YFP陽性腫瘤細胞表達上皮細胞特征性基因俄烁，不表達間質(zhì)細胞和淋巴細胞特異性基因绸栅，而雙陰細胞則表達淋巴、內(nèi)皮和間質(zhì)細胞特異性基因页屠，mCherry陽性細胞表達單核/巨噬等髓系細胞以及內(nèi)皮細胞特異性基因（圖3A）粹胯。免疫熒光結(jié)果顯示，mCherry與巨噬細胞和內(nèi)皮細胞有明顯共定位辰企，且mCherry陽性巨噬細胞大多為M2型巨噬細胞（圖3B-C）风纠。所以，TME中的衰老細胞主要是巨噬細胞和內(nèi)皮細胞牢贸。對衰老巨噬細胞的動態(tài)改變進行檢測發(fā)現(xiàn)竹观，mCherry陽性細胞在腺病毒誘導(dǎo)腫瘤后第2、8和16周明顯增加，表達mCherry的巨噬細胞比例在誘導(dǎo)后第2周和第8周顯著增加（第2周到第16周逐漸減少）（圖3D-E）臭增。最后懂酱，作者比較了正常年輕和年老p16FDR/+小鼠mCherry陽性細胞及巨噬細胞改變。結(jié)果顯示誊抛，年老小鼠mCherry陽性細胞比例列牺、巨噬細胞比例以及mCherry陽性巨噬細胞數(shù)目均顯著高于年輕小鼠，這與腫瘤衰老巨噬細胞增加的現(xiàn)象一致（圖3D-E）拗窃。因此瞎领，衰老和患肺癌小鼠的肺部組織表達p16的巨噬細胞增加。

圖3

4并炮、Tumor- and age-associated p16INK4a-expressing macrophages in the lung share a unique senescence signature

作者用單細胞測序?qū)ME的衰老細胞進行進一步鑒定（圖4A）默刚。大部分mCherry陽性的細胞屬于間質(zhì)/肺泡巨噬以及毛細血管/血管內(nèi)皮細胞（圖4B）。mCherry陽性的間質(zhì)巨噬細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞其衰老相關(guān)基因表達更顯著（圖4C-F）逃魄。通過分析荤西，作者找到了衰老巨噬細胞特異的表面標志物以及和其SASP表型相關(guān)的因子。驗證結(jié)果表明伍俘，IL10和CCL2能夠顯著促進腫瘤細胞增殖邪锌，但沒有在衰老內(nèi)皮細胞找到可調(diào)控腫瘤細胞生長的相關(guān)因子（圖4G-H）。對年老p16FDR/+小鼠肺部細胞進行單細胞測序和分析發(fā)現(xiàn)癌瘾，年老p16FDR/+小鼠mCherry陽性細胞分群與腫瘤類似觅丰，且腫瘤間質(zhì)巨噬細胞特征性的SASP相關(guān)因子和表面標志物年老小鼠也有表達（圖4I-J）。因此妨退，非小細胞肺癌TME的衰老細胞主要是巨噬細胞和內(nèi)皮細胞妇萄，且衰老巨噬細胞的SASP表型相關(guān)分子和表面特異性標志物在腫瘤和年老小鼠肺部組織具有保守性。

圖4

5咬荷、Pharmacogenetic ablation of mCherry (p16INK4A)-expressing cells or senolytic treatment ameliorates lung tumor burden

這部分衰老細胞在腫瘤進展過程發(fā)揮什么功能呢冠句？于是作者用白喉毒素DT以及靶向衰老細胞并導(dǎo)致其凋亡的ABT-737（Senolytics）處理腫瘤小鼠，DT或ABT-737處理使衰老巨噬顯著減少（圖5A）幸乒。更重要的是懦底，DT/ABT737處理使小鼠肺部腫瘤細胞顯著減少（圖5B-C）。用KrasFSFG12V/+小鼠構(gòu)建的肺癌模型檢測結(jié)果顯示罕扎，ABT-737處理顯著抑制腫瘤生長并延長小鼠存活（圖5D-E）聚唐。因此，靶向去除TME的衰老細胞抑制腫瘤生長并促進小鼠存活腔召。

圖5

6杆查、Removal of CSFR1-expressing macrophages with senescent features decreases lung tumor burden & Senescent cell ablation in the TME promotes immunoregulation and reduces tumor vasculature

作者用CSFR1抗體靶向去除巨噬細胞。結(jié)果顯示宴咧，CSFR抗體處理有效去除巨噬細胞并抑制腫瘤細胞生長根灯，但對內(nèi)皮細胞沒有顯著影響（圖6A-C）。那么衰老巨噬細胞是如何影響TME的呢掺栅？文獻報道指出烙肺，去除肺部駐留巨噬細胞可降低TME中的調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs），增加CD8+T細胞氧卧，從而抑制非小細胞肺癌桃笙。事實上，DT和ABT-737處理小鼠后沙绝，腫瘤組織的Tregs和內(nèi)皮細胞均減少搏明，而CD4+和CD8+T細胞增加（圖6D）。此外闪檬，用CSFR處理小鼠后星著，TME的CD8+T細胞顯著增加（圖6E）。因此粗悯，去除衰老細胞（主要是衰老的巨噬細胞）通過改變TME的T細胞亞群種類并抑制腫瘤血管生成延緩腫瘤進展虚循。

圖6

7、Human pre-cancerous lung lesions contain a cell population of macrophages exhibiting senescence features

最后样傍，作者用人非小細胞肺癌組織對小鼠體內(nèi)結(jié)果進行驗證（AAH横缔、AIS和ADC分別代表該肺癌的早、中衫哥、晚期）茎刚。結(jié)果顯示，p16和p21在早期AAH和中期AIS表達最高撤逢，而Ki67早膛锭、中期表達低，但在晚期ADC中表達高（圖7A）蚊荣。AAH和AIS的巨噬細胞表達大量的p16和p21初狰，但ADC的巨噬細胞表達低水平的p16和p21（圖7B）。此外妇押，AAH和AIS衰老巨噬細胞表達衰老巨噬細胞特異性標志物（CD163和FOLR2）跷究，但ADC的巨噬細胞不表達該標志物（圖7C-D）。因此敲霍，人非小細胞肺癌的早中期階段與TME的衰老巨噬細胞有關(guān)俊马。

圖7

Take-home message：

這個故事詮釋了好的實驗工具和實驗動物對課題的作用，雖然沒有特別深入的分子機制探索肩杈，但是作者利用p16-FDR轉(zhuǎn)基因小鼠這一可追蹤靶細胞并可隨時對目的細胞進行操作的強力工具柴我，實現(xiàn)了對衰老細胞的追蹤、分離扩然、分選和分析以及去除艘儒，極大方便了實驗操作且增強了實驗結(jié)果的可信性。因此，除了“腫瘤微環(huán)境衰老巨噬細胞促進腫瘤進展界睁，是重要的治療靶點”這一發(fā)現(xiàn)外觉增，該動物模型也是本文的一大亮點。所以翻斟，平臺/資源對課題進展以及文章的發(fā)表逾礁，大多數(shù)時候還是挺有用的。例如這個故事访惜，工具小鼠的使用決定了其最后文章的檔次不會太低嘹履。此外，這篇文章也能給我們提供一些其它研究方向债热，例如砾嫉，為什么腫瘤細胞微環(huán)境里的巨噬細胞會衰老，是誰分泌的什么因子介導(dǎo)了這種促衰老作用窒篱，為什么這種因子只特異性促進巨噬細胞和內(nèi)皮細胞衰老焕刮？好的故事應(yīng)該是在關(guān)上一扇門時，為我們打開更多的門舌剂，而非形成封閉的閉環(huán)济锄，suffocate the followers。