Cancer Cell 丨 條形碼揭示NE與非NE癌細胞空間演化特征

原創(chuàng)?珍奇?圖靈基因?2022-10-25 16:04?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：珍奇

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本研究利用EpicTags實現(xiàn)了條形碼細胞的原位追蹤；此外蚤蔓，EpicMIBI描述了克隆腫瘤斑塊的空間焕议、細胞類型和細胞狀態(tài)；其中非神經(jīng)內(nèi)分泌細胞顯示局部克隆性增長的增加屁魏；PTEN缺失可以促進非細胞自主的克隆性野生型細胞生長的增加。

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是人類腫瘤的一個重要特征，可促進腫瘤的發(fā)展。然而當(dāng)前技術(shù)在很大程度上仍不適合準(zhǔn)確追蹤腫瘤內(nèi)的表型和克隆演變冒晰，特別是對基因操作的反應(yīng)。2022年10月13日竟块，美國斯坦福大學(xué)Garry P. Nolan課題組于《Cancer Cell》雜志發(fā)表了一篇名為“Spatial epitope barcoding reveals clonal tumor patch behaviors”的研究型論文壶运。該文章介紹了利用組合標(biāo)記（EpicTag）開發(fā)的用于成像的表位，并將其與多重離子束成像（EpicMIBI）相結(jié)合彩郊，在組織微環(huán)境中對條形碼進行原位追蹤前弯。使用EpicMIBI，他們剖析了小細胞肺癌異種移植模型中的細胞系和表型的空間成分秫逝。在這些模型中，混合克隆導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）和非神經(jīng)內(nèi)分泌（non-NE）癌癥細胞狀態(tài)的克隆斑塊的優(yōu)先擴張询枚，從而產(chǎn)生了新的特性违帆。在部分PTEN缺陷癌細胞的腫瘤模型中，他們觀察到PTEN野生型癌細胞的克隆斑塊大小的非自主性增加金蜀。EpicMIBI促進了對參與瘤內(nèi)異質(zhì)性的細胞內(nèi)外過程的原位研究刷后。

為了利用表位編碼區(qū)分細胞群，研究者設(shè)計了一種與C端GFP報告相連的EpicTag載體渊抄，該標(biāo)簽由表位組合組成尝胆。隨后他們利用MIBI來區(qū)分細胞團切片中的條碼細胞。生成的細胞團由50%的野生型NCI-H82細胞和50%的20個EpicTag標(biāo)記的NCI-H82細胞系的集合群體組成护桦。MIBI識別了細胞的GFP表達情況含衔，并在GFP+的細胞中特異性地檢測到表位的表達。對每個表位的信號進行分析后發(fā)現(xiàn)，所有20個條形碼都是多色的圖像贪染。

為了進一步確定了EpicMIBI在體內(nèi)研究的潛力缓呛，他們將20個條碼細胞系集中起來在小鼠體內(nèi)生成腫瘤。所有的表位組合再次通過質(zhì)譜儀在離體腫瘤中檢測到杭隙，并通過MIBI在腫瘤切片上檢測到哟绊，這表明EpicTag表達在體內(nèi)是持久的。隨后他們通過混合mCherry+和GFP+癌細胞在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤痰憎，并通過MIBI進行識別票髓。多項實驗都證明了EpicTag系統(tǒng)的模塊化和可擴展性，它將表達良好的蛋白質(zhì)與廣泛的表位標(biāo)記進行了多樣化的組合铣耘。

越來越多的證據(jù)表明炬称，NE細胞和非NE細胞之間的相互作用對小細胞肺癌（SCLC）的腫瘤生長和演變至關(guān)重要。因此涡拘，他們使用EpicMIBI調(diào)查了NCI-H82異種移植中腫瘤異質(zhì)性的空間組織玲躯，特別是NE和非NE表型。通過使用一組抗體對NCI-H82腫瘤進行染色鳄乏，他們確定了腫瘤微環(huán)境中的細胞條形碼和各種細胞類型跷车，以及癌細胞的功能狀態(tài)侥衬。所有測試的抗體都產(chǎn)生了預(yù)期的細胞定位的可檢測信號双饥。NCI-H82細胞通過GFP表達被識別，并使用人類特異性線粒體標(biāo)記物進一步確認(rèn)可霎。對于確定的每個NCI-H82細胞水援，他們還分析了條形碼的表達密强，以及NE和非NE分化的標(biāo)記（分別為突觸蛋白和波形蛋白），表觀遺傳狀態(tài)（H3K4me2蜗元、H3K27ac和H4K8ac-與活躍轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾）或渤，和代謝狀態(tài)（分別為糖酵解和檸檬酸循環(huán)活動的GLUT1和檸檬酸合成酶標(biāo)記）。

此外奕扣，他們還確定了增殖細胞（Ki-67和組蛋白H3的有絲分裂標(biāo)志物phospho-Ser28薪鹦，pS28 HH3）和DNA損傷的細胞（phospho-Ser139H2AX，γH2AX）惯豆，以及小鼠內(nèi)皮細胞（CD31）和基質(zhì)細胞（α-平滑肌肌動蛋白[αSMA]）池磁。綜合分析結(jié)果表明，即使從一個成熟的癌細胞系中也能在體內(nèi)產(chǎn)生復(fù)雜的空間重排楷兽。由此他們提出了疑問，即癌細胞的克隆性擴張是否會驅(qū)動這種結(jié)構(gòu)的形成芯杀。

通過整合基于細胞和像素的解碼方法，研究者進一步開發(fā)了克隆腫瘤地圖跛梗，以表示條形碼細胞的空間位置。他們推測诚欠，確定NCI-H82異種移植中每個癌細胞周圍的細胞的祖先將對塑造腫瘤結(jié)構(gòu)過程提供見解。因此他們使用該渠道確定了NCI-H82異種移植中的20個可能的表位組合漾岳，每個解編碼的細胞系都表達了預(yù)期的表位，這表明基于表位的圖像計算解構(gòu)確定了腫瘤內(nèi)癌細胞群的共同祖先左腔。

每一個NCI-H82異種移植數(shù)據(jù)集中的細胞可提取出三個基本層次的信息：細胞所屬的同源細胞系（EpicTag條碼）液样，其類型和狀態(tài)（表型簇）巧还，以及表達的功能標(biāo)記麸祷〗纂梗空間部分提供了更深層次的信息走孽，即每個細胞周圍的細胞類型和狀態(tài)（即CN）融求，推斷周圍癌細胞的克隆性（即腫瘤斑塊）生宛，以及標(biāo)記物的亞細胞位置。分析結(jié)果表明肮柜，各集群和CN的條形碼之間有良好的標(biāo)記表達一致性审洞。

PTEN是SCLC中腫瘤抑制因子，但SCLC腫瘤內(nèi)PTEN突變體克隆的演變還未被充分研究创淡。因此琳彩，他們在表達EpicTags 1和20的NCI-H82細胞中通過Cas9-sgRNA核糖核酸蛋白（RNP）傳遞敲除PTEN（PTEN-/-）露乏，并通過傳遞非靶向RNPs產(chǎn)生六個對照細胞系（EpicTags 2, 4, 14, 16, 17,?和18）瘟仿。然后將這8個細胞系與剩余的12個野生型EpicTag編碼的NCI-H82細胞系集合起來劳较，產(chǎn)生一個由20個細胞系組成的群體（"PTEN-/-池"）观蜗，并將20個原始EpicTag編碼的細胞系作為對照嫂便。正如質(zhì)譜結(jié)果所評估的那樣毙替，在PTEN-/-池中厂画，EpicTag 1和20在培養(yǎng)中比其他系生長得更快袱院，在實驗結(jié)束時分別占群體的15%和29%忽洛。原先的（PTEN野生型）EpicTag 1和20沒有競爭優(yōu)勢欲虚。這些觀察結(jié)果驗證了PTEN在SCLC細胞培養(yǎng)中的預(yù)期腫瘤抑制作用复哆。

總之梯找，PTEN在體外對NCI-H82和NJH29細胞系都是一種有效的腫瘤抑制因子锈锤，它的缺失導(dǎo)致NJH29的腫瘤生長有限地增加牙咏，但對NCI-H82異種移植沒有生長優(yōu)勢妄壶。許多生物學(xué)觀察結(jié)果在這兩個SCLC模型中都得到了重現(xiàn)丁寄。EpicMIBI對NCI-H82和NJH29 PTEN基因敲除細胞的體內(nèi)生長差異的機制提供了獨特的見解：在PTEN-/-NCI-H82群體中盛正，NE H3K27aclow細胞的比例較高屑埋，NCI-H82異種移植中NE H3K27aclow細胞有強烈的區(qū)隔摘能，PTEN野生型細胞與PTEN-/-NCI-H82細胞混合的斑塊大小增加严望。

通過在SCLC異種移植中應(yīng)用條形碼原位追蹤的策略像吻，作者表明基于條形碼的多路復(fù)用與單細胞拨匆、深度原位組織表征相結(jié)合涮雷，可以揭示對腫瘤結(jié)構(gòu)和進化的新見解洪鸭。他們的數(shù)據(jù)顯示览爵，即使是成熟的細胞系也能形成復(fù)雜的腫瘤結(jié)構(gòu)蜓竹，其中一個或多個表型狀態(tài)傾向于或產(chǎn)生附近的不同表型狀態(tài)俱济，具有相互依賴性蛛碌。在這些結(jié)構(gòu)中蔚携，他們確定了克隆斑塊的局部生長酝蜒，并檢測了腫瘤內(nèi)細胞表型的不同空間動態(tài)亡脑。通過將條形碼的表達與特定的基因組編輯聯(lián)系起來霉咨，他們進一步擴展了該系統(tǒng)的能力躯护，為原位研究腫瘤生長過程中復(fù)雜的自主和非自主的細胞效應(yīng)提供了新的機會。

教授介紹：

Garry Nolan继准，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教授移必。他的研究領(lǐng)域包括造血崔泵、癌癥和白血病憎瘸、自身免疫和炎癥幌甘，以及網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)免疫學(xué)的計算方法锅风。近期Nolan博士的工作重點是使用質(zhì)譜-流式細胞儀混合設(shè)備進行單細胞分析皱埠，即所謂的?"CyTOF "和?"多參數(shù)離子束成像儀"（MIBI）泪姨，該設(shè)備由Mike Angelo博士在其實驗室所開發(fā)肮砾。這些方法使用先進的離子等離子體源來確定與細胞結(jié)合的標(biāo)記試劑的水平仗处，它們擴大了流式細胞儀（CyTOF）和癌癥成像平臺（MIBI）中每個細胞可測量的參數(shù)的數(shù)量婆誓。它們與另一個名為CODEX（Akoya, Inc.）成像平臺的共同發(fā)展將有可能使熒光鏡以廉價的方式轉(zhuǎn)換為高維成像平臺洋幻。

參考文獻：

Rovira-Clavé X, Drainas AP, Jiang S, et al. Spatial epitope barcoding reveals clonal tumor patch behaviors [published online ahead of print, 2022 Oct 12]. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00443-3. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.014