hello，大家好赂蠢，周二了蚪缀，一周最黃金的學(xué)習(xí)時(shí)間，這一篇分享的文獻(xiàn)在Comprehensive dissection of immune microenvironment in the progression of early gastric cancer at spatial and single-cell resolution古程，用單細(xì)胞空間的技術(shù)來(lái)表征胃癌的免疫微環(huán)境，這篇文章是國(guó)內(nèi)的學(xué)者發(fā)表的喊崖，我們來(lái)看一下單細(xì)胞空間技術(shù)的運(yùn)用與科研成果挣磨。
Abstract
雖然腫瘤免疫微環(huán)境 (TME) 的變化對(duì)大多數(shù)腫瘤進(jìn)展具有重要意義，但仍需要能夠揭示 TME 的組成和免疫特征的工作荤懂。以單細(xì)胞分辨率分析胃惡性細(xì)胞顯示轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性表現(xiàn)在胃癌的不同狀態(tài)茁裙，這意味著可能存在不同的細(xì)胞狀態(tài)，包括免疫細(xì)胞节仿，all components in TME make some balances in early gastric cancer (EGC) progression晤锥。然而，目前尚不清楚免疫細(xì)胞如何促成惡性胃炎廊宪，構(gòu)成胃 TME 的一般特征矾瘾。此外眉踱，胃 TME 中細(xì)胞間特定相互作用的作用仍有待闡明。在這里霜威，對(duì) 18 個(gè)胃樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞 RNA-seq 分析，識(shí)別了 17 種細(xì)胞類(lèi)型并重建了它們的位置信息册烈。We found that immune cells represented different degree of dysregulations during the progression from non-atrophic gastritis (NAG), atrophic gastritis (AG) to EGC, including imbalance of cytotoxic and inhibitory effects in T cells, maturation inhibition in B cells and malignant genes up-regulated obviously in myeloid cells戈泼。此外，通路分析表明赏僧，缺氧大猛、活性氧和脂肪代謝信號(hào)從 AG 階段開(kāi)始被激活，這可能加速 EGC 的進(jìn)展淀零。此外挽绩，細(xì)胞相互作用進(jìn)一步確定了缺氧在胃 TME 中的作用〖葜校總體而言唉堪，本研究中提供的多組學(xué)數(shù)據(jù)提供了從 NAG、AG 到 EGC 進(jìn)展過(guò)程中胃組織內(nèi)免疫細(xì)胞類(lèi)型肩民、狀態(tài)變化和位置的全面視圖唠亚，促進(jìn)了我們對(duì)不同胃狀態(tài)的組成和免疫的理解，為 EGC 提供診斷和預(yù)防思路（最后都是要對(duì)臨床進(jìn)行指導(dǎo)）持痰。
Introduction
大多數(shù)腫瘤的進(jìn)展都是腫瘤細(xì)胞與其免疫微環(huán)境（包括EGC）之間動(dòng)態(tài)相互作用的結(jié)果灶搜。在此過(guò)程中，胃粘膜組織出現(xiàn)異質(zhì)性變化和惡性細(xì)胞工窍，這在以前已有報(bào)道割卖。然而，免疫微環(huán)境如何在 EGC 進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用仍不清楚患雏。結(jié)果表明鹏溯，正常胃黏膜、simple gastritis纵苛、AG和GC的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)剿涮、趨化因子和白細(xì)胞介素的表達(dá)存在差異。據(jù)報(bào)道攻人，IL33促進(jìn)metaplasia取试，其外源性表達(dá)可中度誘導(dǎo)表達(dá)解痙多肽的metaplasia（SPEM），可能代表慢性胃炎和IM的重要關(guān)節(jié)怀吻。巨噬細(xì)胞的典型二元 M1/M2 paradigm消失了瞬浓，and transcriptionally heterogenous among each cluster was in its place。此外蓬坡，建立了轉(zhuǎn)移性胃腺癌 (GAC) 的 12 基因預(yù)后特征猿棉。盡管報(bào)道的工作很少磅叛，它們不足以說(shuō)明從 NAG 到 EGC 的過(guò)程中的變化。
由于胃免疫微環(huán)境的復(fù)雜性和技術(shù)限制萨赁，以前很難對(duì)免疫微環(huán)境的組成弊琴、結(jié)構(gòu)和免疫進(jìn)行分析。最近開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）杖爽、VDJ和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）測(cè)序已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜免疫微環(huán)境的識(shí)別敲董。作為新技術(shù)，scRNA-seq需要消化細(xì)胞懸浮慰安，缺乏空間相對(duì)定位腋寨，而ST測(cè)序代表的是空間點(diǎn)圖像，細(xì)胞分辨率低化焕。然后萄窜，從多組學(xué)的維度綜合運(yùn)用，不僅用scRNA-seq在單細(xì)胞分辨率下準(zhǔn)確闡明細(xì)胞生物學(xué)撒桨，而且利用ST甚至免疫文庫(kù)獲取空間位置信息和細(xì)胞間相互作用獲得 T/B 細(xì)胞查刻。結(jié)合 scRNA-seq 和 ST 已成功闡明了幾種腫瘤和免疫微環(huán)境圖譜，包括胰腺癌元莫、鱗狀細(xì)胞癌以及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移赖阻。因此，考慮應(yīng)用組合方法來(lái)闡明從 NAG踱蠢、AG 到 EGC 的開(kāi)發(fā)過(guò)程中的微環(huán)境特征火欧。
在這項(xiàng)研究中，獲得了 21,848 個(gè)單細(xì)胞和 11,347 個(gè)空間spot茎截。 通過(guò)結(jié)合使用 scRNA-seq 和 ST 測(cè)序苇侵，表征了胃免疫微環(huán)境變化的失調(diào)。 多組學(xué)數(shù)據(jù)提供了從 NAG企锌、AG 到 EGC 進(jìn)展過(guò)程中免疫細(xì)胞類(lèi)型榆浓、狀態(tài)變化和胃組織內(nèi)位置的全面視圖，促進(jìn)我們對(duì)不同胃狀態(tài)的組成和免疫的理解撕攒， offering diagnostic and preventive thoughts for EGC陡鹃。
Results
Exploring the spatial architecture and single cell characteristics of the immune microenvironment in the progression of EGC
為了探索胃炎向 EGC 轉(zhuǎn)化的機(jī)制，分別確定了來(lái)自 NAG抖坪、AG 和 EGC 患者的 12 個(gè)組織樣本的空間特征萍鲸，這些樣本代表了胃癌發(fā)展的不同階段。識(shí)別出可區(qū)分的腫瘤區(qū)域擦俐、有或沒(méi)有 IM 的萎縮區(qū)域以及沒(méi)有明顯病變的區(qū)域脊阴。這些區(qū)域的相關(guān)性分析表明，各組的非病變區(qū)域之間存在差異，更不用說(shuō)可區(qū)分的病變區(qū)域嘿期。然后品擎，在全局范圍內(nèi)，空間區(qū)域的通路活動(dòng)概況顯示出特定的激活模式备徐。與 NAG 組相比萄传，EGC 組的 MYC 信號(hào)傳導(dǎo)、氧化磷酸化蜜猾、干擾素 α 反應(yīng)盲再、IL-1 信號(hào)傳導(dǎo)、mTORC1 信號(hào)傳導(dǎo)瓣铣、TNF 信號(hào)傳導(dǎo)和髓系白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫均上調(diào)，而 AG 中贷揽，脂肪酸代謝棠笑、異生素代謝和脂質(zhì)代謝上調(diào)。相反禽绪，在 NAG 組中上調(diào)的 KRAS 信號(hào)通路蓖救、天冬氨酸型肽酶活性、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路和細(xì)胞識(shí)別通路在 EGC 組中均下調(diào)印屁。雖然發(fā)現(xiàn)通路活動(dòng)部分與特定細(xì)胞類(lèi)型相關(guān)循捺，例如肌肉區(qū)域與活化的凝血通路一致。對(duì)于大多數(shù)通路雄人，它們的活性在每個(gè)點(diǎn)上是不均勻的从橘，并且難以與特定的細(xì)胞類(lèi)型匹配，一方面是技術(shù)限制础钠，另一方面是復(fù)雜的微環(huán)境恰力。此外，通過(guò)時(shí)間軌跡分析旗吁，從NAG踩萎、AG到EGC細(xì)胞有進(jìn)化趨勢(shì)，基因表達(dá)也有明顯變化很钓。鑒于此香府，使用 scRNA-seq 進(jìn)一步探索了三組細(xì)胞特征和基因表達(dá)譜的差異。使用 10x scRNA-seq 從 6 個(gè)新鮮的 NAG码倦、AG 和 EGC 胃鏡活檢標(biāo)本中收獲了 28,860 個(gè)細(xì)胞企孩。然后對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行合并、過(guò)濾叹洲、歸一化柠硕、批量校正、聚類(lèi)，最終確定了通過(guò)質(zhì)量控制的21848個(gè)細(xì)胞中的17種細(xì)胞類(lèi)型蝗柔。上皮細(xì)胞闻葵、T細(xì)胞、漿細(xì)胞占較大部分癣丧，成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量相近槽畔。此外還有內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞胁编、肥大細(xì)胞厢钧、杯狀細(xì)胞、主細(xì)胞等嬉橙，數(shù)量較少早直。不同組和樣本中每種細(xì)胞類(lèi)型的分布是均勻的，表明在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中沒(méi)有批次效應(yīng)市框。特征基因的表達(dá)表明注釋的正確性霞扬。
探索了每種細(xì)胞類(lèi)型的起源，發(fā)現(xiàn)不同組之間存在相當(dāng)大的異質(zhì)性枫振。上皮細(xì)胞在胃組織中的數(shù)量最多喻圃，其中大部分來(lái)自EGC。parietal cells存在于胃腺中粪滤，與標(biāo)本來(lái)源的上皮細(xì)胞一致斧拍。對(duì)于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和pericytes杖小，從 NAG肆汹、AG 到 EGC 減少，表明血管和平滑肌組織逐漸減少予权，這可能是由于活檢標(biāo)本的采樣差異略小县踢。對(duì)于chief cells，減少與 SPEM 的特征相符伟件。此外硼啤，探討了在 SPEM 的 GC 進(jìn)展中涉及的 TFF2 的表達(dá)，這意味著 SPEM 可能在我們的研究中發(fā)生斧账。此外谴返，值得注意的是，在 EGC 樣本中咧织，一組稱(chēng)為增殖細(xì)胞的比例最高嗓袱，表明在胃癌發(fā)展過(guò)程中增殖能力增強(qiáng)。同時(shí)习绢，增殖細(xì)胞顯著表達(dá)CD3D渠抹、CD3E等T細(xì)胞標(biāo)志物蝙昙，提示T細(xì)胞在胃癌進(jìn)展中的增殖能力受到刺激。
然后梧却，使用 SPOTlight(關(guān)于SPOTlight奇颠，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞空間分析回顧之SPOTlight)，對(duì)匹配 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 ST 數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積放航。結(jié)果烈拒，獲得了每個(gè)spot的細(xì)胞類(lèi)型成分。除肌層和淋巴細(xì)胞聚集區(qū)外广鳍，上皮細(xì)胞分布廣泛荆几。 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞相互靠近，我們觀察到在淋巴細(xì)胞聚集區(qū)赊时，T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞占據(jù)了較高的比例吨铸。與T細(xì)胞和B細(xì)胞相比，漿細(xì)胞存在于淋巴細(xì)胞聚集區(qū)的外側(cè)祖秒。平滑肌細(xì)胞主要存在于肌層焊傅，反映在HE上，在一定程度上證明了細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性狈涮。Schwann 細(xì)胞、pericytes 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共定位表明這些細(xì)胞和平滑肌可能是肌肉層的主要細(xì)胞成分鸭栖。與其他免疫細(xì)胞相比歌馍，巨噬細(xì)胞更傾向于存在于組織邊緣，chief細(xì)胞也避開(kāi)了淋巴細(xì)胞聚集的區(qū)域晕鹊，這與上皮細(xì)胞一致松却。此外，還注意到在 NAG 中溅话，增殖細(xì)胞主要聚集在淋巴細(xì)胞聚集區(qū)晓锻，而在其他兩組中則聚集在上皮區(qū)域，這表明增殖細(xì)胞可能具有不同的表型和功能飞几，包括 NAG 中的免疫細(xì)胞表型和上皮細(xì)胞表型砚哆。在 AG 和 EGC 中。還存在有趣的現(xiàn)象屑墨，NAG中淋巴細(xì)胞聚集面積最大躁锁，AG和EGC中淋巴細(xì)胞聚集面積減小，說(shuō)明NAG免疫防御功能最強(qiáng)卵史。
先前的研究表明战转，腫瘤進(jìn)展通常伴隨著增加的拷貝數(shù)變異 (CNV)。 然而以躯，CNVs 對(duì) GC 進(jìn)展幾乎沒(méi)有影響槐秧，部分原因是胃組織的全局差異很小。 與之前的工作一致，在從 NAG 到 EGC 的進(jìn)展過(guò)程中刁标，CNV 評(píng)分沒(méi)有顯著差異颠通。 數(shù)據(jù)表明，NAG命雀、AG和EGC組的基因表達(dá)譜和微環(huán)境細(xì)胞特征存在明顯變化蒜哀。
Different expression patterns of T cells from NAG to EGC
我們注意到，在腫瘤微環(huán)境中起關(guān)鍵作用的 T 細(xì)胞在免疫細(xì)胞中所占的比例最大吏砂。然后撵儿，從三組中提取所有 T 細(xì)胞，然后降低維數(shù)并重新聚類(lèi)它們狐血。根據(jù)基因表達(dá)淀歇，我們將 T 細(xì)胞分為八個(gè)clusters，包括細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (Cytotoxic T)匈织、輔助 T 細(xì)胞 (Th)浪默、自然殺傷細(xì)胞 (NK)、雙陰性 T 細(xì)胞 (DNT)缀匕、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Treg) 纳决、幼稚T細(xì)胞（naive T）、衰竭T細(xì)胞（Exhausted T）乡小，以及表達(dá)高水平上皮相關(guān)基因的一種特殊T細(xì)胞類(lèi)群阔加，稱(chēng)為上皮樣T細(xì)胞（epithium_like）。來(lái)自每位患者的 T 細(xì)胞分散分布满钟。在不同的 T 細(xì)胞樣本中發(fā)現(xiàn)了很大的異質(zhì)性胜榔。 T細(xì)胞的組成和比例在不同的疾病階段表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。例如湃番，在 NAG 和 AG 階段夭织，DNT 占較大比例。值得注意的是吠撮，一個(gè)樣本GN1_1尊惰，屬于AG重度IM患者，T細(xì)胞比例與GN1_3相似泥兰，而后者與AG相似择浊。這在一定程度上證明了AG是介于NAG和EGC之間的中間狀態(tài)，而IM是接近EGC的狀態(tài)逾条。對(duì)于 T 細(xì)胞亞群琢岩，DNT（CD3+CD4-CD8-T 細(xì)胞）在總 T 細(xì)胞中的比例最高。細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞僅存在于EGC和AG樣本中师脂，隨著疾病進(jìn)展担孔，DNT細(xì)胞比例逐漸降低江锨。 Na?ve T、Th糕篇、NK 細(xì)胞呈增加趨勢(shì)啄育。同時(shí)，使用經(jīng)典標(biāo)記來(lái)表征聚類(lèi)的正確性拌消√敉悖可以看出，標(biāo)記基因在特定的T細(xì)胞中呈現(xiàn)特異性表達(dá)墩崩。
使用熱圖顯示了 T 細(xì)胞亞群的前 10 個(gè)DEGs氓英。 熱圖中 DEGs 的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了標(biāo)注的準(zhǔn)確性。 對(duì)于細(xì)胞毒T細(xì)胞鹦筹，除細(xì)胞毒基因外铝阐，KLRC1 25、ZNF68326也高表達(dá)铐拐，與NK細(xì)胞相互作用徘键。 細(xì)胞毒性T細(xì)胞和衰竭T細(xì)胞的基因表達(dá)有一定的相似性。 但 DUSP4 在耗盡的 T 細(xì)胞中較高遍蟋，而 DUSP2 在細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞中較高吹害。 激活NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的KIR2DL4在耗盡的T細(xì)胞中含量較高，表明細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡的T細(xì)胞都可以與NK細(xì)胞相互作用虚青。 DNT專(zhuān)注于熱休克蛋白相關(guān)基因它呀，包括HSPA1A、HSPA1B挟憔、DNAJB1、DNAJA1烟号。 DDX3X 與 NLRP3 炎性體的形成有關(guān)绊谭。 EZR和MYH9與遷移和侵襲等細(xì)胞極性有關(guān)。
對(duì)總 T 細(xì)胞的軌跡分析汪拥，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有明顯的發(fā)育模式达传。 然而，當(dāng)只關(guān)注細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡 T 細(xì)胞時(shí)迫筑，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞先于耗盡 T 細(xì)胞宪赶，并且大部分耗盡 T 細(xì)胞整體聚集在分支末端，這意味兩種細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化脯燃。 比較了細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞之間功能基因的表達(dá)搂妻。 對(duì)于包括IFNG、NKG7辕棚、PRF1欲主、GZMA邓厕、GZMB、GZMH在內(nèi)的細(xì)胞毒基因扁瓢，兩種細(xì)胞類(lèi)型之間沒(méi)有差異详恼。 但對(duì)于包括 LAG3、PDCD1引几、CTLA4 以及 TIGIT 在內(nèi)的免疫檢查點(diǎn)昧互，耗盡的 T 細(xì)胞的表達(dá)明顯更高。 相同的細(xì)胞cluster在不同的患者中可能表現(xiàn)出不同的狀態(tài)伟桅，通過(guò)尋找DEGs敞掘，得到了AG和EGC組中細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡T細(xì)胞DEGs的數(shù)量。
細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞之間的總通路激活模式相似贿讹，而后者的活性更高渐逃，除了用于 IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、WNT β-連環(huán)蛋白信號(hào)民褂、DNA 甲基化信號(hào)傳導(dǎo)主要富集在耗盡的 T 細(xì)胞中茄菊。 比較AG組細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞，EGC組細(xì)胞在TRAF6介導(dǎo)的IRF7激活通路赊堪、RUNX3通路面殖、INF信號(hào)通路、CXC趨化因子受體信號(hào)通路和對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)等通路中表現(xiàn)出更高的活性哭廉。
然后脊僚，使用 SPOTlight 定位細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞。 兩類(lèi)細(xì)胞分布有一定相似性遵绰，但細(xì)胞毒性T細(xì)胞分布范圍更廣辽幌。
在分析 T 細(xì)胞亞群時(shí)，發(fā)現(xiàn)一組既不表達(dá) CD4 也不表達(dá) CD8 的細(xì)胞椿访，稱(chēng)之為 DNT乌企。 同時(shí)，DNT的數(shù)量為1890個(gè)成玫，占T細(xì)胞的39%加酵，占所有細(xì)胞的8.7%。 雖然有一些關(guān)于 DNT 的報(bào)道哭当，但 DNT 的作用和效果還不是很清楚猪腕，而且迄今為止在 GC 中也沒(méi)有關(guān)于 DNT 的報(bào)道，那么下面重點(diǎn)介紹一下 DNT钦勘。
探討了 DNT 三組之間的差異陋葡。 軌跡分析表明，隨著疾病的發(fā)展彻采，DNT 會(huì)逐步改變脖岛。 檢查了 DNT 在偽時(shí)間的基因表達(dá)朵栖，熱休克蛋白相關(guān)基因如 HSPA9、HSPA1A柴梆、HSPA1B陨溅、HSP90AB1 以及 DEAD-box 解旋酶基因如 DDX5、DDX3X绍在、DDX3Y 逐漸減少门扇。 相反，隨著CD8A偿渡、GZMK的上調(diào)臼寄，CD8+ T細(xì)胞的表型逐漸顯現(xiàn)。 在偽時(shí)期后期溜宽，JCHAIN基因和IG相關(guān)基因在漿細(xì)胞中高表達(dá)吉拳。 DNT pseudotime的基因表達(dá)表明向CD8+ T細(xì)胞和漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)變可能發(fā)生在DNT的后期發(fā)育過(guò)程中。
SPOTlight 顯示 DNT 廣泛分布适揉。 但有趣的是留攒，與其他區(qū)域相比，淋巴細(xì)胞聚集區(qū)域聚集的 DNT 較少嫉嘀。 在癌變部位炼邀，DNT含量相對(duì)較多。 結(jié)合monocle的結(jié)果剪侮，我們猜測(cè)DNT可能轉(zhuǎn)化為CD8+T細(xì)胞拭宁，在病灶部位發(fā)揮抑癌作用。
The dysregulation of B cells development during EGC progression
與 T 細(xì)胞相比瓣俯，B 細(xì)胞群在亞組之間表現(xiàn)出較少的數(shù)量和多樣性杰标。 根據(jù)獨(dú)特的標(biāo)記基因，這些細(xì)胞分為B細(xì)胞（CD19彩匕、CD20/MS4A1腔剂、FCER2和MHC II分子）和plasmas（TNFRSF17、SLAMF7推掸、XBP1桶蝎、SDC1和IGHs）驻仅。 與以往胃組織中含有大量plasmas的研究一致谅畅，也發(fā)現(xiàn)了迄今為止機(jī)制未知的現(xiàn)象。 空間位置也表明plasmas的擴(kuò)散分布噪服，而 B 細(xì)胞稀少毡泻。 然而，在 NAG粘优、AG 和 EGC 組之間仇味，B 細(xì)胞和plasmas的細(xì)胞數(shù)量分別相當(dāng)呻顽。
更高分辨率的聚類(lèi)顯示 B 細(xì)胞中有 7 個(gè)不同的亞組。 B-c0和B-c5主要來(lái)源于非EGC組丹墨，而在B-c1、B-c2、B-c3衙解、B-c4和B-c6中把将，EGC和AG組細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。基因表達(dá)分析顯示B-c0和B-c5王财、DDX5卵迂、DDX3X和NCL之間相似的上調(diào)基因均為抗病原體和抗腫瘤基因。由于大量癌基因在 B-c1 clusters中顯著上調(diào)绒净，推斷它正在惡化由腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞群见咒。然后，通路活性分析表明促腫瘤信號(hào)的活性高度上調(diào)挂疆，這也顯示了這些細(xì)胞的惡性潛能改览。對(duì)于B-c2 cluster，RGS13囱嫩、MEF2B恃疯、GCSAM和LRMP這些germinal center發(fā)育的必需基因被上調(diào)。然而墨闲，通常在受感染的記憶 B 細(xì)胞上表達(dá)的 FCRL4今妄，它的過(guò)度表達(dá)也可能阻礙抗原誘導(dǎo)的 BCR 信號(hào)傳導(dǎo)。此外鸳碧，據(jù)報(bào)道促進(jìn)腫瘤發(fā)展的 ACTG1 和 FAM3C 在該cluster中也上調(diào)盾鳞。對(duì)于B-c3，它被定義為表達(dá)IGHD和FCER2的濾泡B細(xì)胞瞻离。 TCL1A腾仅、TNFAIP3、BTG1 和 TXNIP套利、促腫瘤或促炎基因也在該cluster中表達(dá)推励。對(duì)于 B-c4，它被定義為記憶 B 細(xì)胞肉迫，標(biāo)記基因 FABP5 據(jù)報(bào)道調(diào)節(jié)脂肪酸代謝验辞。在 B-c6 中，據(jù)報(bào)道 SIK2 通過(guò) PI3K/AKT/HIF 軸調(diào)節(jié)代謝重編程喊衫，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展; WDR76可以激活脂肪代謝限制跌造； CNR2可能抑制抗體反應(yīng)，據(jù)報(bào)道是B細(xì)胞限制葡萄糖和能量供應(yīng)的中樞效應(yīng)物，這反過(guò)來(lái)表明該cluster與B細(xì)胞的代謝變化有關(guān)壳贪。
TF 分析確定了 IRF8陵珍、PAX5 和 SPIB，這是眾所周知的對(duì) B 細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的 TF违施，CREB3L2 和 XBP1 對(duì)漿細(xì)胞的成熟互纯。 此外，EGR3磕蒲、KLF12伟姐、MECP2、HDAC1 和 SOX5 的轉(zhuǎn)錄活性在 c0-mermory B 細(xì)胞和 c5-na?ve B 細(xì)胞中更高亿卤。 相反愤兵，F(xiàn)OXP1、HMGB1排吴、EGR1 和 BCL11A 在這些clusters中較低秆乳，但在其他 B 細(xì)胞cluster中較高。 據(jù)報(bào)道钻哩，F(xiàn)OXP1 在germinal center B 細(xì)胞中表現(xiàn)出生理性減少屹堰，這意味著 FOXP1 的高活性導(dǎo)致 B 細(xì)胞幼稚化。 HMGB1 可在缺氧或炎癥刺激后被激活街氢。 BCL11A可以在B細(xì)胞的早期發(fā)揮作用扯键。 EGR3可以通過(guò)抗原受體信號(hào)傳導(dǎo)和控制炎癥來(lái)調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖。 HDAC1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)變珊肃，它的消融在早期阻斷了B細(xì)胞荣刑。 SOX5對(duì)記憶B細(xì)胞的發(fā)育很重要。
隨著對(duì)漿細(xì)胞的進(jìn)一步解剖伦乔，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有從漿母細(xì)胞厉亏、短期漿細(xì)胞到長(zhǎng)期漿細(xì)胞的進(jìn)化軌跡。 考慮到親和力成熟期間的體細(xì)胞超突變 (SHM) 和類(lèi)別轉(zhuǎn)換烈和，漿細(xì)胞可以獲得比 B 細(xì)胞更多的變異爱只，inferCNV 分析也表明了這些差異。
有趣的是招刹，空間特征圖像顯示了胃組織中漿細(xì)胞和上皮細(xì)胞的彌散分布恬试，另一方面，兩種細(xì)胞類(lèi)型之間難以清晰的聚類(lèi)疯暑。 因此训柴，使用 IF 來(lái)確定它們的空間位置。 我們發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞類(lèi)型之間存在大量鄰域關(guān)系缰儿，尤其是在 EGC 患者中畦粮。
由于 NAG散址、AG 和 EGC 患者之間的 TCR 克隆型不同乖阵，分析還確定了 BCR 信息宣赔。 從 NAG、AG 到 EGC 組瞪浸，克隆型的多樣性增加儒将。 此外，三組中無(wú)論是重鏈還是輕鏈的V-J對(duì)都是獨(dú)特且不同的对蒲。
Characteristics of myeloid cells in the TME of EGC
然后钩蚊，剖析了本研究中揭示的骨髓亞群的基因特征。 兩個(gè)肥大細(xì)胞clusters表達(dá)了典型的基因模式蹈矮，例如 TSPAB1砰逻、TPSB2、CPA3 和 KIT泛鸟，并通過(guò) PGA3蝠咆、NEAT1、HSP90AB1 和 TNFAIP3北滥、AREG刚操、MIF 的獨(dú)特表達(dá)進(jìn)一步區(qū)分。 值得注意的是再芋，先前的研究表明菊霜，TNFAIP3的上調(diào)可以促進(jìn)胃癌的發(fā)展，而AREG可以增強(qiáng)Tregs的抑制功能济赎。 這兩個(gè)集群在 EGC鉴逞、AG 和 NAG 組中顯示出不同的富集。 Mast c0 集群在所有三個(gè)組中或多或少均勻地存在司训，而 mast c1 在 NAG 組中幾乎消失华蜒。 特定的分布可能意味著它們發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。通路評(píng)分顯示肥大 c0 cluster與 KRAS 信號(hào)通路豁遭、腸道吸收叭喜、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 Hedgehog 信號(hào)通路相關(guān)。 Mast c1 cluster傾向于成為惡性細(xì)胞群蓖谢，并顯著富集 PI3K-AKT-mTOR捂蕴、ɑ-TNF、脂肪酸代謝闪幽、缺氧啥辨、炎癥反應(yīng)和 IFN-γ 信號(hào)蛋白。
TF分析表明JUND盯腌、MAFF溉知、PRDM1、FOSL2、TCF7L2和HES1在巨噬細(xì)胞c0 cluster中被激活级乍，而FOXO1舌劳、FOXO3和MEF2A的TF活性在巨噬細(xì)胞c1 cluster中較高。 對(duì)于肥大細(xì)胞玫荣，AHR甚淡、GATA1、GATA2 是眾所周知的 TF捅厂，而 RELA贯卦、EGR3 和 ZC3H11A 在肥大 c0 clusters中較高。 HIVEP2焙贷、ATF4撵割、VDR、ATF5 和 IRF4 在中性粒細(xì)胞/DC 細(xì)胞中具有更高的活性辙芍。
根據(jù)C1QA睁枕、C1QB、C1QC和CD163的特異性表達(dá)鑒定了兩個(gè)巨噬細(xì)胞cluster沸手。其中外遇，三組中顯示顯著（巨噬細(xì)胞c0 cluster）或輕微（巨噬細(xì)胞c1 cluster）偏態(tài)分布的cluster。 在巨噬細(xì)胞c0 cluster中觀察到MMP9契吉、CXCL2跳仿、MMP12和CTSH的表達(dá)，兩者在巨噬細(xì)胞c1 cluster中均表現(xiàn)出較低的表達(dá)捐晶。 其余 cluster 是中性粒細(xì)胞/DC 群菲语，其特征是 S100A8、A100A9惑灵、G0S2 和 LSP1 的高表達(dá)山上。 大部分 cluster 起源于EGC患者，基因表達(dá)以及富集途徑的活動(dòng)也偏向于促腫瘤英支。 巨噬細(xì)胞和DC群均表現(xiàn)出抗原呈遞細(xì)胞（APC）的特征佩憾，具有抗原加工和呈遞的能力。 除此之外干花，細(xì)胞粘附分子 cams妄帘、用于 IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)和補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)也在這些細(xì)胞中被激活。
The ligand-receptor interactions of immune cells along with EGC progression（通訊分析）
至于組織微環(huán)境池凄，尤其是腫瘤組織中復(fù)雜且高頻的相互作用抡驼。進(jìn)一步評(píng)估了 NAG、AG 和 EGC 組之間的細(xì)胞相互作用肿仑。三組間分泌信號(hào)致盟、細(xì)胞間接觸信號(hào)和ECM受體信號(hào)的相互作用強(qiáng)度和數(shù)量均不同碎税。與 NAG 組相比，AG 和 EGC 組之間的相互作用數(shù)量和強(qiáng)度是可比較的馏锡，表明 AG 患者含有驅(qū)動(dòng)早期腫瘤發(fā)生的條件雷蹂。配體-受體的差異分析表明，LGALS9_CD44眷篇、LGALS9_CD45、LGALS9 - HAVCR2(TIM-3)荔泳、MIF-CD74/CD44蕉饼、MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL是主要的相互作用。我們發(fā)現(xiàn) LGALS9 在肥大細(xì)胞玛歌、巨噬細(xì)胞昧港、壁細(xì)胞和杯狀細(xì)胞中上調(diào)。據(jù)報(bào)道支子，LGALS9_CD45 可抑制 B 細(xì)胞受體信號(hào) 64创肥。LGALS9_CD44 可增強(qiáng) Treg 的穩(wěn)定性和功能。此外值朋，LGALS9 可以與 HAVCR2 (TIM-3) 相互作用叹侄，以保護(hù)乳腺癌免受 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性殺傷，部分通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或效應(yīng) T 細(xì)胞耗竭昨登。據(jù)報(bào)道趾代，TIM-3是Th1細(xì)胞的一種特異性表面分子，可介導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)丰辣，其失調(diào)可導(dǎo)致抑制炎癥反應(yīng)甚至逃避腫瘤撒强。它可以促進(jìn) CD8+ T 細(xì)胞耗竭并誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞 (MDSCs) 的產(chǎn)生。在我們的研究中笙什，TIM-3 主要在骨髓細(xì)胞中表達(dá)飘哨，這與之前的報(bào)道一致，即 TIM-3 表達(dá)主要定位于人和小鼠腫瘤中的骨髓細(xì)胞琐凭。肥大細(xì)胞中的 TIM-3 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡芽隆。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 (MIF) 是適應(yīng)性和先天免疫的上游調(diào)節(jié)因子，但如果失調(diào)统屈，它是急性或慢性炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素摆马，并在白細(xì)胞募集中起作用。 MIF發(fā)生在AG組和EGC組的多種免疫細(xì)胞中鸿吆。 CXCR4是MIF的受體之一囤采，在EGC組，尤其是B細(xì)胞和T細(xì)胞群中高表達(dá)惩淳。據(jù)報(bào)道蕉毯，CXCR4可以阻礙其他腫瘤的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫治療乓搬。 CD74/CD44作為MIF的受體復(fù)合物，其激活可觸發(fā)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路代虾，包括ERK通路进肯、PI3K/AKT信號(hào)、NFκB和MAPK通路棉磨。由于缺氧通路在胃炎條件下被激活江掩，據(jù)報(bào)道，HIF-1α-和 HIF-2α-依賴(lài)性 MIF 可以部分通過(guò)與 CD74/CXCR4 復(fù)合物相互作用來(lái)調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的功能乘瓤，然后激活 p38/MAPK 和 PI3K- AKT 信號(hào)环形。另一方面，該復(fù)合物還可以作為 B 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和成熟的正調(diào)節(jié)劑衙傀。據(jù)報(bào)道抬吟，Midkine (MDK) 支持胃癌的進(jìn)展，部分是通過(guò)抑制顆粒酶 B (GZMB) 的表達(dá)和 NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性统抬，以及通過(guò)與表面核仁素 (NCL) 相互作用在缺氧條件下增加表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR) 信號(hào)傳導(dǎo)）火本。它還被鑒定為有助于 GC 細(xì)胞中的多藥耐藥性。此外聪建，MDK 重新連接黑色素瘤和膽囊癌的免疫抑制環(huán)境钙畔。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)與 NAG 患者相比金麸，MDK 在 EGC 和 AG 患者中過(guò)表達(dá)刃鳄。 MDK 的受體之一是 NCL，它是生長(zhǎng)細(xì)胞的主要核仁蛋白钱骂，也可作為細(xì)胞表面受體在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭叔锐，從而為細(xì)胞外調(diào)節(jié)核事件提供機(jī)制。
Discussion
為了探索從胃炎到早期胃癌的免疫微環(huán)境變化见秽，首先綜合運(yùn)用單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)免疫細(xì)胞成分和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解剖愉烙。 雖然之前有過(guò)一些胃癌相關(guān)的研究，但它們要么集中在胃癌中的惡性細(xì)胞解取，要么僅以單細(xì)胞分辨率關(guān)注胃癌中的其他非免疫細(xì)胞步责，或者用其他空間方法如 DSP 代替 ST。
全局通路富集和空間區(qū)域分析表明禀苦，與NAG組相比蔓肯，AG階段激活了缺氧條件、活性氧通路和脂肪代謝等多個(gè)通路振乏，均有利于EGC的進(jìn)展和抑制性免疫微環(huán)境的形成蔗包。 雖然 MYC、INFα慧邮、IL-1 和 TNF 信號(hào)傳導(dǎo)调限，但所有腫瘤相關(guān)通路在 EGC 組中均被激活舟陆。 整體變化暗示了組合物的異質(zhì)性。 然后在這項(xiàng)研究中耻矮，發(fā)現(xiàn)了多種免疫細(xì)胞秦躯，包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞裆装，它們?cè)?EGC踱承、AG 和 NAG 患者中具有不同的狀態(tài)和表達(dá)模式。
當(dāng)胃病從 NAG 進(jìn)展到 EGC 時(shí)哨免，T 細(xì)胞的效應(yīng)和抑制狀態(tài)之間的平衡逐漸受損茎活。具體而言，在AG和EGC階段出現(xiàn)耗竭的T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞铁瞒，在NAG狀態(tài)下不存在妙色，免疫反應(yīng)明顯激活桅滋。這與先前的研究一致慧耍，即早期腫瘤進(jìn)展伴隨著免疫反應(yīng)激活。除了存在耗盡的T細(xì)胞外丐谋，TME芍碧、Tregs的另一個(gè)天然抑制作用，在NAG階段上調(diào)HIVEP1和STAT3的轉(zhuǎn)錄活性号俐，而在AG狀態(tài)增強(qiáng)IRF4和IKZF2的活性泌豆，并具有更高的FOXP3轉(zhuǎn)錄活性, BATF, 和 EGC 時(shí)期的 PRDM1。其中吏饿，HIVEP1 是 Tregs 中新發(fā)現(xiàn)的 TF踪危，剛剛報(bào)道它在 TNFRSF9+ Treg 細(xì)胞中高度激活，在軌跡的后期猪落，呈現(xiàn)出與我們的結(jié)果不同的模式贞远。正如之前的報(bào)道，PRDM1 通常在晚期或終末期上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性笨忌，這意味著免疫效果更差蓝仲。從 NAG 到 EGC 進(jìn)展過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子活性的這些變化可能表明 T 細(xì)胞的抑制作用是早期胃癌的促成因素之一。以上也表明官疲，AG患者已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)衰竭或抑制性免疫反應(yīng)袱结，暗示EGC的預(yù)防措施可能應(yīng)從這個(gè)階段開(kāi)始實(shí)施。此外途凫，我們?cè)赥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種罕見(jiàn)的細(xì)胞類(lèi)型垢夹，即DNT細(xì)胞，它占據(jù)了很大一部分维费，但具有不確定的標(biāo)記基因來(lái)定義它們棚饵，這與之前的報(bào)道一致煤裙。時(shí)間軌跡顯示了DNT從NAG、AG到EGC的不斷演變噪漾，沒(méi)有足夠的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證硼砰，因此它們存在的意義尚不清楚，值得未來(lái)進(jìn)一步研究欣硼。
然后题翰，與 T 細(xì)胞一樣，B 細(xì)胞也出現(xiàn)了失調(diào)诈胜。 FOXP1 和 BCL11A 在cluster（B-c1豹障、B-c2、B-c3焦匈、B-c4 和 B-c6）中較高的轉(zhuǎn)錄活性血公，在 AG 和 EGC 組中富集更多，代表 B 細(xì)胞的幼年化缓熟。 此外累魔，SOX5的轉(zhuǎn)錄抑制表明成熟記憶B細(xì)胞的喪失，以及正調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的EGR3和HDAC1活性較低的成熟障礙够滑。 比較 B 細(xì)胞垦写，漿細(xì)胞中富含胃組織，與之前的報(bào)道相同彰触。 我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象梯投，即漿細(xì)胞共定位或伴有上皮細(xì)胞，特別是在 EGC 組中况毅，這通過(guò)標(biāo)記基因表達(dá)的 ST 圖像和 IF 染色證實(shí)分蓖。 然而，細(xì)胞相互作用無(wú)法找到該現(xiàn)象的線索尔许，顯示出進(jìn)一步深入探索的可能性么鹤。
有兩個(gè)惡性clusters，Mast c1 和巨噬細(xì)胞 c0母债，主要富集于 AG 和 EGC 組午磁，表達(dá)高水平的基因，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并抑制有效的免疫反應(yīng)毡们。 至于在 Mast c1 中上調(diào)的 AREG迅皇，可以與 EGFR 相互作用以執(zhí)行 Tregs 的功能。 主要在骨髓細(xì)胞中表達(dá)的 LGALS9 可以與 TIM-3 相互作用發(fā)揮免疫抑制作用衙熔。 此外登颓，MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL均可在缺氧條件下激活，分別調(diào)節(jié)T細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的功能红氯。
這項(xiàng)研究的優(yōu)勢(shì)來(lái)自于組合技術(shù)的應(yīng)用：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)框咙、scRNA-seq 和 VDJ 分析咕痛。 Visium ST 使我們能夠確定不同組織中細(xì)胞類(lèi)型的位置； 雖然 scRNA-seq 無(wú)法像普通 RNA-Seq 那樣獲得足夠深度的基因表達(dá)喇嘱，但它使我們能夠確認(rèn)胃癌進(jìn)展過(guò)程中免疫微環(huán)境中的已知細(xì)胞類(lèi)型茉贡，以及單獨(dú)的稀有細(xì)胞類(lèi)型，如雪旺細(xì)胞和 DNT 細(xì)胞者铜。
Overall, we characterized the dysregulation of immune microenvironment changes both in single-cells and spatial transcriptome resolution, the multi-omics data presented in this study offer a comprehensive view of immune cell types, states change and locations within the gastric tissues during the progression from NAG, AG to EGC, advancing our understanding of the composition and immunity of different gastric states, offering diagnostic and preventive thoughts for EGC.
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