影響因子：27.7

研究概述：NK細(xì)胞是固有免疫淋巴細(xì)胞，能直接殺死病毒感染的細(xì)胞蒿赢，并調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)的早期階段润樱，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞通常分為兩類：CD56bright和CD56dim羡棵，但這種分類過于簡化壹若。通過單細(xì)胞技術(shù)的分析，健康個(gè)體中的NK細(xì)胞具有高達(dá)10萬個(gè)獨(dú)特亞群的廣泛表型多樣性。這種多樣性源于隨機(jī)表達(dá)的舌稀、胚系編碼的激活和抑制受體的組合啊犬，這些受體與HLA I類結(jié)合，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能壁查。另一層次的NK細(xì)胞多樣性是從初始CD56bright NK細(xì)胞到終末分化的適應(yīng)性CD62L?NKG2C+CD57+KIR+CD56dim NK細(xì)胞的連續(xù)分化觉至，與巨細(xì)胞病毒CMV感染有關(guān)。在本篇研究中睡腿，作者建立了NK細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄參考圖譜语御，解析了血液和正常組織中NK細(xì)胞分化期間的基因表達(dá)趨勢。通過參考圖譜分析各種條件下的細(xì)胞差異基因席怪，識別出新的NK細(xì)胞狀態(tài)应闯。作者使用來自44,640個(gè)PB-NK細(xì)胞和27,732個(gè)組織駐留TrNKNK細(xì)胞的數(shù)據(jù)，研究了來自427名患者的7種實(shí)體瘤中的腫瘤浸潤TiNK細(xì)胞挂捻。發(fā)現(xiàn)TrNK和TiNK細(xì)胞具有明顯的組織駐留特征碉纺。在泛癌圖譜中，作者確認(rèn)了六種NK細(xì)胞功能狀態(tài)刻撒，其中CD56bright和細(xì)胞毒性效應(yīng)CD56dim狀態(tài)在多種腫瘤類型中普遍富集骨田。患者生存數(shù)據(jù)分析顯示声怔，效應(yīng)CD56dim與CD56bright狀態(tài)的高比例與骨肉瘤和黑色素瘤患者的良好生存相關(guān)态贤。這揭示了TME如何導(dǎo)致NK細(xì)胞功能障礙，并可能為設(shè)計(jì)新的NK細(xì)胞治療策略提供靈感醋火。具體結(jié)果如下：

研究結(jié)果：

NK細(xì)胞亞群注釋

為了建立一個(gè)腫瘤浸潤NK細(xì)胞的泛癌圖譜悠汽，作者首先在轉(zhuǎn)錄水平上定義了NK細(xì)胞的分化。作者對七名健康供體的總NK細(xì)胞群體進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序芥驳，并整合了五個(gè)公開的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集成一個(gè)均勻的人群（圖a）柿冲。上文提及CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞代表兩個(gè)不同的分化階段，因此作者基于CD56 bright/ dim signature來對單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行評分兆旬，以識別CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞（圖b）姻采。CD56dim NK細(xì)胞異質(zhì)性較大的群體通常根據(jù)抑制性和激活性受體的選擇性表達(dá)來表征功能上不同的亞群。因此爵憎，為了識別與這些功能階段相關(guān)的預(yù)測基因特征，作者從兩名供體中分選了相等數(shù)量的CD56bright NK細(xì)胞和四個(gè)CD56dim NK細(xì)胞亞群（NKG2A+KIR-CD57-婚瓜，NKG2A-self-KIR+CD57-宝鼓，NKG2A-nonself-KIR+CD57-，NKG2A-self-KIR+CD57+或NKG2A-/+self-KIR+CD57+NKG2C+）（圖c）巴刻。這五個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的NK細(xì)胞亞群被重新命名以反映它們的成熟階段：‘CD56bright’愚铡、‘早期CD56dim’、‘中期CD56dim’、‘晚期CD56dim’和‘適應(yīng)性CD56dim’（圖c）沥寥。作者接下來訓(xùn)練了一個(gè)半監(jiān)督模型--scANVI碍舍，利用識別的NK細(xì)胞亞群基因特征來預(yù)測和推斷整理的整體NK細(xì)胞亞群注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)邑雅，轉(zhuǎn)錄上不同的亞群（CD56bright和適應(yīng)性NK細(xì)胞這兩個(gè)亞群）注釋準(zhǔn)確性高片橡，而轉(zhuǎn)錄重疊較高的亞群注釋準(zhǔn)確性略低（圖d）。使用該模型淮野，作者在亞群水平注釋包含12個(gè)患者的23,253個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的總NK細(xì)胞數(shù)據(jù)集捧书。scANVI模型捕獲了亞群的轉(zhuǎn)錄特征，并用于識別差異表達(dá)的基因（圖e-f）骤星。為了驗(yàn)證這一注釋模型经瓷，作者又對總NK細(xì)胞數(shù)據(jù)集（12個(gè)患者）進(jìn)行了無偏聚類分析（Leiden），識別了與前面注釋的5個(gè)NK細(xì)胞亞群緊密匹配的5個(gè)簇（圖g）洞难。部分中期CD56dim注釋的NK細(xì)胞與晚期CD56dim注釋的NK細(xì)胞在聚類4中聚集舆吮，可能對應(yīng)于群體中更成熟的細(xì)胞（圖h）。有/無適應(yīng)性NK細(xì)胞擴(kuò)展的患者對比中（NK細(xì)胞可以在遇到某些病毒感染如CMV后經(jīng)歷適應(yīng)性擴(kuò)展）队贱，晚期CD56dim和適應(yīng)性NK細(xì)胞亞群的頻率也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化（圖i）色冀。

特定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了在轉(zhuǎn)錄水平上解析驅(qū)動(dòng)NK細(xì)胞分化的調(diào)控基因路徑，作者使用Palantir和RNA velocity進(jìn)行了擬時(shí)間分析露筒。作者基于最低CD56dim評分定義起始細(xì)胞呐伞，識別了兩個(gè)終末期的細(xì)胞（橙色），預(yù)測屬于晚期CD56dim和適應(yīng)性CD56dim細(xì)胞亞群（圖a）慎式。作者為了驗(yàn)證這一軌跡伶氢，利用scVelo27中的動(dòng)態(tài)模型計(jì)算剪接與未剪接RNA速度，在沒有預(yù)定義類似上面起始細(xì)胞的情況下推斷擬時(shí)間瘪吏，結(jié)果確認(rèn)了從CD56bright NK細(xì)胞亞群開始并終止于適應(yīng)性CD56dim細(xì)胞亞群的軌跡（圖b）癣防。既然識別了兩種不同的終末期的細(xì)胞：晚期CD56dim和適應(yīng)性CD56dim細(xì)胞亞群。作者對這兩細(xì)胞進(jìn)一步分析其來源掌眠。在兩種來源類型中蕾盯，早期CD56dim NK細(xì)胞形成了CD56bright和其余CD56dim亞群之間的連接環(huán)節(jié)（圖c,d）。雖然適應(yīng)性分化中NK細(xì)胞向中期CD56dim細(xì)胞進(jìn)展蓝丙；常規(guī)分化中則轉(zhuǎn)向中期/晚期CD56dim群體（圖c,d）级遭。在建立了NK細(xì)胞分化的時(shí)間軸后，作者利用廣義加性模型（GAMs）計(jì)算每個(gè)基因隨時(shí)間變化的基因表達(dá)趨勢渺尘，這些基因聚集成五個(gè)不同的趨勢（圖e）挫鸽。在常規(guī)和適應(yīng)性分化中表達(dá)差異的基因（如KLRC2、CD52和IL32）在常規(guī)晚期CD56dim分化中聚集于趨勢1鸥跟，在適應(yīng)性分化中聚集于趨勢4（圖e）丢郊】基于雙分化模型，作者構(gòu)建了按五個(gè)基因趨勢分層的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRNs）枫匾，識別了跨偽時(shí)間的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）及其已知的下游靶基因（圖f）架诞。趨勢1由從CD56bright到CD56dim細(xì)胞分化過程中下調(diào)的基因主導(dǎo)，包括先前報(bào)道的TFs（MYC干茉，LEF1谴忧，RUNX2），涉及Notch信號通路的RBPJ等脂，視黃酸受體（RXRA）和調(diào)節(jié)ID2表達(dá)的TFs（HOXA9俏蛮，HOXA10）。

通過遷移學(xué)習(xí)生成泛癌圖譜

在外周血（PB）中轉(zhuǎn)錄定義NK細(xì)胞分化后上遥，作者繼續(xù)使用scVI訓(xùn)練第二個(gè)模型M2搏屑，結(jié)合136名患者的6個(gè)健康組織（前列腺、肺粉楚、胰腺辣恋、皮膚、乳腺模软、大腦）scRNA-seq數(shù)據(jù)伟骨，生成健康人群的PB-NK + TrNK參考圖譜（圖a）。使用scANVI對組織特定數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合和注釋燃异，并在泛組織水平（圖b）和各個(gè)組織內(nèi)識別感興趣的免疫亞群携狭。接著，作者對來自427名腫瘤患者患者在泛癌水平（圖c,d）和各個(gè)腫瘤類型內(nèi)（包括7個(gè)實(shí)體腫瘤：前列腺癌回俐、肺癌逛腿、黑色素瘤、胰腺癌仅颇、乳腺癌单默、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤）進(jìn)行注釋和整合。為了評估注釋NK細(xì)胞在組織和腫瘤數(shù)據(jù)集中的組織駐留狀態(tài)忘瓦，作者利用文獻(xiàn)中組織駐留特征以及作者自己的圖譜衍生出了組織駐留（atlas-TR）NK細(xì)胞的特征（圖e）搁廓。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比CD56dim NK細(xì)胞耕皮，CD56bright NK細(xì)胞在正常組織和腫瘤中總體上對組織駐留征評分較高（圖e）境蜕。最后，作者使用遷移學(xué)習(xí)（scArches44）凌停，將CD56bright和CD56dim注釋的TiNK細(xì)胞映射到參考圖譜（PB-NK汽摹，TrNK），生成最終模型（M3）--泛癌NK圖譜（圖f）苦锨。PB、組織和腫瘤中的CD56bright和CD56dim亞群聚集在一起（圖g,h）。

不同組織和腫瘤中NK細(xì)胞亞群頻率的變化

對健康組織和腫瘤注釋的免疫亞群進(jìn)行泛癌比較（圖b,d）顯示舟舒，健康組織的血漿細(xì)胞和初始B細(xì)胞比例增加拉庶，而腫瘤組織的CD56dim NK細(xì)胞、單核細(xì)胞秃励、樹突狀細(xì)胞氏仗、NK T細(xì)胞、效應(yīng)記憶/效應(yīng)T輔助細(xì)胞夺鲜、效應(yīng)記憶/再表達(dá)CD45RA的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和駐留記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例減少（圖a）皆尔。在乳腺癌中，總免疫細(xì)胞中CD56bright NK細(xì)胞比例增加币励。而在黑色素瘤中慷蠕，CD56dim NK細(xì)胞比例增加，但在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中比例減少（圖a-c）食呻。作者進(jìn)一步使用第一部分構(gòu)建好的亞群訓(xùn)練模型（M1）對NK細(xì)胞進(jìn)行亞群水平注釋（圖d,e）流炕。大多數(shù)腫瘤類型（圖d,e）中健康組織與腫瘤之間存在CD56bright比例的偏斜，通過流式細(xì)胞術(shù)在非小細(xì)胞肺癌隊(duì)列中得到同樣的驗(yàn)證（圖f）仅胞。在腫瘤浸潤NK細(xì)胞（TiNKs）中每辟，中期CD56dim群體普遍減少（圖d,e）。對非小細(xì)胞肺癌隊(duì)列CD56dim群體的蛋白質(zhì)水平注釋還發(fā)現(xiàn)干旧，與健康血液對照相比渠欺，早期和中期CD56dim亞群減少，晚期CD56dim亞群略有增加（圖g）椎眯。

NK細(xì)胞六種功能上不同的細(xì)胞狀態(tài)

作者實(shí)施了一種無偏方法（Milo47）通過識別6,932個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞鄰域來確定泛癌NK細(xì)胞圖譜中的細(xì)胞狀態(tài)挠将。這6,932個(gè)鄰域被分為6個(gè)不同的鄰域組，并測試了TiNK細(xì)胞和參考NK細(xì)胞（Ref-NK細(xì)胞）之間的差異豐富度（圖a）盅视。鄰域組1和2由在TiNK細(xì)胞中顯著豐富的鄰域組成捐名，而組6包括在Ref-NK細(xì)胞中豐富的鄰域（圖b）。接下來闹击，作者使用注釋模型（M1）可視化每個(gè)組內(nèi)NK細(xì)胞亞群的分布镶蹋。組1和2富集了CD56bright細(xì)胞，而組3-6主要由CD56dim NK細(xì)胞亞群組成（圖c）赏半。先前識別的PB-NK細(xì)胞分化的主導(dǎo)TF調(diào)控子確認(rèn)組1和2為兩個(gè)CD56bright狀態(tài)贺归，而組3-6為四個(gè)CD56dim NK細(xì)胞狀態(tài)（圖d）。接著断箫，作者依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)特異性GRNs拂酣、DEGs、基因集富集分析和特征評分注釋了以下的NK細(xì)胞狀態(tài)信息：應(yīng)激CD56bright（組1）仲义、典型CD56bright（組2）婶熬、效應(yīng)CD56dim（組3）剑勾、適應(yīng)性CD56dim（組4）、活化CD56dim（組5）和典型CD56dim（組6）（圖e–n）赵颅。比較應(yīng)激與典型CD56bright狀態(tài)（組1對組2）發(fā)現(xiàn)：ATF3調(diào)控子（細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)）虽另、MAFF調(diào)控子（缺氧誘導(dǎo)）和眾多熱休克蛋白表達(dá)增加（圖e,g）。應(yīng)激CD56bright細(xì)胞狀態(tài)在免疫抑制通路（轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ信號饺谬、缺氧捂刺、活性氧ROS）中得分較高，并表現(xiàn)出糖酵解募寨、膽固醇穩(wěn)態(tài)族展、脂肪酸代謝激活增加（圖g,j–l）。此外拔鹰，低NK細(xì)胞細(xì)胞毒性評分表明應(yīng)激CD56bright這一細(xì)胞狀態(tài)功能降低仪缸，該狀態(tài)在所有七種腫瘤類型中普遍表達(dá)較高（圖m,o）。與TME中CD56bright細(xì)胞浸潤增加一致格郁，典型CD56bright細(xì)胞狀態(tài)在與健康組織相比的五種腫瘤類型中也表現(xiàn)出豐富度增加腹殿，兩個(gè)CD56bright組均表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)分子（如XCL1、XCL2和IFNG）表達(dá)增加（圖n–o）例书。在所有腫瘤類型中锣尉，CD56dim狀態(tài)中的效應(yīng)狀態(tài)最常見，富集了頂端連接决采、肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架相關(guān)基因以及效應(yīng)分子（圖h）自沧。該狀態(tài)在表型上富集了中期和晚期CD56dim NK細(xì)胞亞群，在NK細(xì)胞毒性和氧化磷酸化中得分較高树瞭，重要的是拇厢，在免疫抑制中得分較低（圖i,k–m）∩古纾活化CD56dim狀態(tài)的特點(diǎn)是缺氧增加孝偎、營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)鞍咨险{(diào)和mTORC1–Myc軸上調(diào)（圖i,k）。最后凉敲，典型CD56dim狀態(tài)表現(xiàn)出低應(yīng)激評分和高細(xì)胞毒性評分衣盾，并與IFN、腫瘤壞死因子TNF和JAK/STAT信號相關(guān)（圖i–j,m）爷抓。

TME中特定狀態(tài)的信號傳導(dǎo)與功能的聯(lián)系

為了闡明TME對識別出的六種功能狀態(tài)的NK細(xì)胞的影響势决，作者使用CellChat推斷細(xì)胞間通訊。組1和組2 NK細(xì)胞狀態(tài)在四條主要通訊路徑中在所有腫瘤類型中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的輸入信號（圖a）蓝撇。在非小細(xì)胞肺癌中果复，高表達(dá)的CD44、CXCR4和CD74在組1和組2 NK細(xì)胞上渤昌，大多來自成纖維細(xì)胞虽抄、內(nèi)皮細(xì)胞走搁、腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的信號（COLLAGEN、MIF迈窟、LAMININ）匯聚在這些細(xì)胞上朱盐，促進(jìn)了輸入信號的增強(qiáng)（圖b,c）。此外菠隆，組1和組2 NK細(xì)胞主要通過主要組織相容性復(fù)合物I（MHC-I）（HLA-E/KLRC1）通路接收抑制性輸入，這歸因于這些細(xì)胞狀態(tài)中KLRC1的高表達(dá)（圖a,d）狂秘。因此骇径，組1和組2細(xì)胞狀態(tài)更易接受通過上調(diào)的CD44、CXCR4者春、CD74和KLRC1所介導(dǎo)的TME誘導(dǎo)的免疫抑制信號破衔。為了理解NK細(xì)胞如何通過免疫調(diào)節(jié)作用影響TME，作者將分析重點(diǎn)放在主要由NK細(xì)胞進(jìn)行的輸出信號傳導(dǎo)上钱烟。作者確定了三條信號路徑（CC趨化因子配體（CCL）晰筛、蛋白酶激活抑制劑（PARs）、IFN-II）拴袭，通過這些路徑读第，NK細(xì)胞主要與樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞拥刻、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行通訊（圖e,f）怜瞒。效應(yīng)NK細(xì)胞狀態(tài)（組3）在轉(zhuǎn)錄水平上高表達(dá)的顆粒酶A可誘導(dǎo)TME中表達(dá)F2R的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）的凋亡（圖g）。與健康血液對照相比般哼，非小細(xì)胞肺癌患者的中央腫瘤樣本中的CD56dim NK細(xì)胞顆粒酶A的表達(dá)頻率和強(qiáng)度均減少吴汪，提示NK細(xì)胞在腫瘤內(nèi)釋放顆粒酶A（圖h,i）。通過HLA-E軸的抑制信號顯著抑制CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞的脫顆粒和顆粒酶B釋放蒸眠，通過與預(yù)先用IFN-γ刺激以上調(diào)HLA-E表達(dá)的A549靶細(xì)胞共培養(yǎng)證明這一點(diǎn)（圖j,k）漾橙。使用抗NKG2A抗體阻斷NKG2A–HLA-E軸，顯著恢復(fù)了功能楞卡，包括脫顆粒和顆粒酶B釋放（圖j,k）霜运。

細(xì)胞狀態(tài)比例預(yù)測患者結(jié)局

作者將黑色素瘤SKCM、肺癌NSCLC和膠質(zhì)瘤GBM的空間RNA測序組織切片進(jìn)行解卷積臀晃，以識別這些數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞類型（圖a）觉渴。SKCM、NSCLC和GBM的主要免疫亞群組成分析在腫瘤類型之間存在很大差異徽惋，但在測序技術(shù)（scRNA-seq與空間-seq）之間高度一致（圖b）案淋。因?yàn)镹K細(xì)胞比例在SKCM最高（圖b），作者進(jìn)一步將注釋的NK細(xì)胞細(xì)分為CD56bright和CD56dim亞群（圖c）及細(xì)分細(xì)胞狀態(tài)（圖d）险绘。效應(yīng)（組3）和典型（組6）CD56dim狀態(tài)在與NK細(xì)胞毒性相關(guān)的基因中得分較高（圖e）踢京。類似地誉碴，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因及免疫抑制相關(guān)基因（ROS，缺氧）在應(yīng)激CD56bright（組1）狀態(tài)中得分最高（圖f,g）瓣距。鑒于在血液黔帕、組織和實(shí)體腫瘤中的scRNA-seq和空間-seq數(shù)據(jù)集中識別出的六種功能狀態(tài)的NK細(xì)胞，作者繼續(xù)測試這些細(xì)胞狀態(tài)的臨床相關(guān)性蹈丸，使用包含生存數(shù)據(jù)的TCGA數(shù)據(jù)成黄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高的效應(yīng)CD56dim：應(yīng)激CD56bright NK狀態(tài)特征比率預(yù)測了SARC和SKCM患者的更好生存率（圖h）。

研究總結(jié)：

本文研究了腫瘤浸潤自然殺傷（NK）細(xì)胞的泛癌特征及其在腫瘤微環(huán)境中的功能逻杖。研究通過生成健康人血液和組織來源的NK細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜奋岁，分析了腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的擾動(dòng)。通過將39個(gè)數(shù)據(jù)集中的腫瘤浸潤NK細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組整合到參考圖譜中荸百，發(fā)現(xiàn)了六種功能上不同的NK細(xì)胞狀態(tài)闻伶，包括易受腫瘤微環(huán)境免疫抑制的功能障礙CD56bright狀態(tài)和抵抗腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞毒性CD56dim狀態(tài)。文章揭示了NK細(xì)胞在不同分化階段的特定基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)够话，并通過遷移學(xué)習(xí)生成了一個(gè)泛癌NK細(xì)胞圖譜蓝翰，顯示了組織駐留和腫瘤浸潤NK細(xì)胞的特征。研究表明女嘲，不同腫瘤類型中NK細(xì)胞亞群頻率的變化與患者預(yù)后密切相關(guān)畜份，效應(yīng)CD56dim狀態(tài)的高比例與黑色素瘤和骨肉瘤患者的生存改善有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用及其作為治療靶點(diǎn)提供了新的見解澡为。