題目：Single-cell Transcriptomic Landscape of Human Blood Cells
期刊：National Science Review (IF:17.275)
發(fā)表年份：24 August 2020

摘要

背景：目前缺乏一個關(guān)于全血系統(tǒng)的單細(xì)胞層面轉(zhuǎn)錄組參考系腿宰。
方法：1.使用Single-Cell Tagged Reverse Transcription RNA Sequencing (STRT-seq) strategy，分析21個健康獻(xiàn)血者的32種免疫細(xì)胞類型，得到了總共7551個人血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)編碼基因和lncRNAs 構(gòu)建的人血單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜（atlas of blood cells 炫掐，ABC）具有高度一致性。
2.使用SCENIC構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)义辕，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被激活双妨。
3.分析每個特定細(xì)胞群(HSPCs、B細(xì)胞蔓腐、NK細(xì)胞矩乐、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞)的分化軌跡和特征散罕，發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞與免疫信號通路密切相關(guān)分歇。
意義：提供了單細(xì)胞分辨率的人血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，從而為探索生理和病理造血提供了全面的參考欧漱。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及質(zhì)控

樣本：21個健康成人的骨髓和外周血的單核細(xì)胞
細(xì)胞： 流式分選了32種血細(xì)胞职抡，過濾后得到了7551個細(xì)胞進(jìn)行下游分析。

Scheme of the experimental design

細(xì)胞過濾標(biāo)準(zhǔn)： 1.保留至少有1000個蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的細(xì)胞误甚，總共有7551個細(xì)胞符合要求缚甩。2.保留至少有500個 lncRNA 表達(dá)的細(xì)胞，總共有7192個細(xì)胞符合要求窑邦。
大致的單細(xì)胞下游分析流程：SCTransform → IntegrateData→RunPCA→ FindCluster→ FindVariableFeatures→RunUMAP →FindNeighbors and FindClusters →SCENIC →HOMER → bedtools →Monocle3 →scran

結(jié)果

1.人類血液細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組參考系

首先蹄胰，整體而言，HSPC和單核細(xì)胞表達(dá)的基因數(shù)量最多奕翔，而NK細(xì)胞裕寨、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄相對靜止(圖1B)。值得注意的是派继，與HCA數(shù)據(jù)庫相比宾袜，他們的數(shù)據(jù)能夠檢測到更多的基因和轉(zhuǎn)錄因子用于深入分析(P<2.2e-16,圖1C)，并且在檢測低豐度基因方面尤其具有優(yōu)勢驾窟。
他們接著整合了所有造血細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜庆猫，然后通過UMAP進(jìn)行降維和可視化。發(fā)現(xiàn)從HSPC開始绅络，向淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞月培、NK細(xì)胞和T細(xì)胞)、髓系細(xì)胞(單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)和紅細(xì)胞分支恩急，揭示了造血分化的總體軌跡杉畜。與B細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞相比衷恭，他們發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞此叠、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞缺乏從祖細(xì)胞到分化細(xì)胞的連續(xù)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移，這表明這些細(xì)胞在成熟過程中可能獲得基因表達(dá)的”戲劇性“變化随珠，或者存在已知的表面標(biāo)記沒有捕捉到的過渡群體(圖1D)灭袁。
最后，他們觀察到AVP在HSCs和MPPs中特異表達(dá)窗看。CD79B茸歧、GZMH和CCR7分別在B細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞中高特異性和高表達(dá)显沈，SPI1和GATA1分別在中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞和紅細(xì)胞中高表達(dá)(圖1E)软瞎，驗(yàn)證了每種細(xì)胞中與造血相關(guān)的已知標(biāo)記基因。通過對20多個健康獻(xiàn)血者的多個典型造血群體的深度測序，他們的人類血細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜為人類生理性和病理性造血研究提供了有價(jià)值的轉(zhuǎn)錄組參考铜涉。

Fig.1 Transcriptome reference of human blood cells

2.造血分化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了解析造血分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(調(diào)節(jié)子)，使用SIENIC計(jì)算了所有轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控活性分?jǐn)?shù)(RAS)遂唧，然后構(gòu)建了人類血細(xì)胞的調(diào)控圖譜芙代。結(jié)果顯示，由調(diào)節(jié)子揭示的造血分化軌跡與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)結(jié)果總體一致(圖2A)盖彭。
接著纹烹，通過無監(jiān)督的聚類將造血細(xì)胞分成20個調(diào)控簇，稱為C1到C20召边，每個調(diào)控簇都顯示出高度特異的調(diào)節(jié)子集基因的激活(圖2B)铺呵。在主要由HSPC細(xì)胞組成的C1/C2簇細(xì)胞中，HOX基因被激活隧熙。TCF4片挂、EBF1和LEF1在代表B細(xì)胞的C3~C7簇中活性較高，漿細(xì)胞中PRDM1和XBP1活性較高贞盯，而NK/T細(xì)胞中GATA3和Tbx21活性較高音念。CEBP和SPI1在中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞系中顯示出高活性，而GATA1和KLF1在紅系中被激活(圖2C)躏敢。值得注意的是闷愤，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞共享大多數(shù)髓系特有的調(diào)節(jié)子基因，而淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)子則有著明顯的細(xì)胞類型特異性件余，在B淋巴細(xì)胞成熟過程中調(diào)節(jié)子的變化證明了這一特點(diǎn)(圖2C)讥脐。

Fig 2.Transcription factor regulatory networks underlie hematopoiesis

3.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的非編碼RNA圖譜

LncRNAs在造血細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。然而啼器，在單細(xì)胞水平下lncRNAs在造血細(xì)胞中的表達(dá)譜尚未見報(bào)道旬渠。因此，他們基于lncRNA表達(dá)水平端壳，構(gòu)建一個包含7192個血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜坟漱。根據(jù)NONCODE數(shù)據(jù)庫的基因組注釋，32種免疫表型細(xì)胞平均可以檢測到1700多個LncRNAs更哄。與蛋白質(zhì)編碼基因一致芋齿，HSPC和單核細(xì)胞表達(dá)的lncRNAs數(shù)量最多，而NK細(xì)胞成翩、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)的lncRNAs數(shù)量最低(圖3A)觅捆。而且僅用lncRNAs構(gòu)建的造血分化軌跡與蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的分化軌跡高度一致(圖3B)。
為了進(jìn)一步剖析轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性麻敌，他們計(jì)算了蛋白編碼基因和lncRNA在任何兩種免疫表型細(xì)胞類型之間差異表達(dá)的基因（DEG）栅炒。DEG數(shù)量表明lncRNAs和蛋白質(zhì)編碼基因之間有很高的一致性(圖3C)。這些結(jié)果表明，lncRNAs的動態(tài)變化能夠描述整個造血系統(tǒng)的層次結(jié)構(gòu)赢赊。
接下來乙漓，他們確定了每種免疫表型細(xì)胞類型的標(biāo)志性蛋白編碼基因和lncRNAs，發(fā)現(xiàn)lncRNA signature 傾向于與其相鄰的蛋白編碼基因相關(guān)聯(lián)释移，以獲得更多分化的細(xì)胞類型叭披，而不是祖細(xì)胞(圖3D)。此外玩讳，lncRNA signatures顯示出更高的PhastCons保守分?jǐn)?shù)和更高的細(xì)胞特異性(圖3E-F)涩蜘。特別是，與造血特征的基因(AVP熏纯、CD79B同诫、GZMH、CCR7樟澜、SPI1和GATA1)相鄰的lncRNA(NONHSAG031143.2误窖、NONHSAG073805.1、NONHSAG069091.1秩贰、NONHSAG108638.1贩猎、NONHSAG008235.2和NONHSAG103763.2)分別在HSPC、B細(xì)胞萍膛、NK細(xì)胞吭服、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞和紅細(xì)胞中高表達(dá)(圖3G)蝗罗。這些發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞水平上鑒定出了造血細(xì)胞中特異表達(dá)的lncRNAs艇棕，它們傾向于與其相鄰的蛋白編碼基因共表達(dá)，以獲得更多的細(xì)胞分化類型串塑。

Fig.3 Reconstruction of hematopoietic hierarchy by using lncRNAs

3. 造血細(xì)胞亞群的精細(xì)圖譜

接下來精確剖析了每個特定細(xì)胞亞群(HSPC沼琉、B細(xì)胞、NK細(xì)胞桩匪、T細(xì)胞打瘪、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞)的分化軌跡和特征傻昙」肷В考慮到CD71+紅細(xì)胞的免疫作用在以往的研究中已有報(bào)道，因此作者們首先關(guān)注了紅系細(xì)胞群妆档。首先將來自不同捐贈者的細(xì)胞整合在一起僻爽，然后用UMAP降維和可視化。他們發(fā)現(xiàn)贾惦，在紅系譜系中胸梆，Ery/Gra1和Ery/Gra2顯示了與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞(MD)特征相關(guān)的高表達(dá)基因(圖4A)敦捧。
Ery/Gra1和Ery/Gra2中特異表達(dá)基因的GO富集分析主要富集在中性粒細(xì)胞相關(guān)、吞噬和炎癥反應(yīng)以及抗原處理和提呈通路碰镜，這暗示了這兩個紅細(xì)胞亞群可能有先天性和獲得性免疫功能(圖4B)兢卵。偽時間分析表明，Ery/Gra2簇有著獨(dú)特的免疫相關(guān)基因表達(dá)绪颖，例如VCAN和S100A9基因(圖4C-D)秽荤。此外，他們發(fā)現(xiàn)CD74+有核紅細(xì)胞主要表達(dá)在Ery/Gra1和Ery/Gra2簇(圖4D)菠发。隨后王滤，他們還描述了HSPC贺嫂、B細(xì)胞滓鸠、NK細(xì)胞、T細(xì)胞第喳、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的分化軌跡和功能多樣性糜俗。正如預(yù)想的一樣，HSPC的分化軌跡包含了淋巴系曲饱、髓系和紅系/巨核系在內(nèi)的祖細(xì)胞的分支(圖4e)悠抹。偽時間分析反映了B和NK細(xì)胞群體的分化軌跡(圖4F-G)。對于T細(xì)胞群扩淀，CD4T和CD8T細(xì)胞可各分為三類楔敌，分別包括初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞驻谆。CD4初始T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞緊密相靠卵凑，但CD8記憶T細(xì)胞和卻與效應(yīng)T細(xì)胞緊密相連(圖4H-I)，接著是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞亞群的分化軌跡(圖4J-K)胜臊。最后勺卢，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)基因在HSPC分化過程中被激活，而在血細(xì)胞成熟過程中則失活(圖4L)象对。綜上所述黑忱，他們詳述了每個細(xì)胞壓群的分化軌跡圖譜，并觀察了有核紅細(xì)胞的免疫激活情況勒魔。
綜上所述甫煞，他們詳述了每個細(xì)胞群體的分化圖譜，并觀察了有核紅細(xì)胞的免疫激活現(xiàn)象冠绢。

Fig.4 Immune activation of CD74+ nucleated erythrocytes and elaborate atlas for other hematopoietic cell populations

Atlas

總結(jié)

1.該研究借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組深度測序技術(shù)埃跷，覆蓋了從造血干細(xì)胞到祖細(xì)胞再到各譜系成熟血細(xì)胞在內(nèi)的32種類型的血細(xì)胞蕊玷，繪制了人全血細(xì)胞的精細(xì)分子圖譜。
2.揭示了全新的與造血分化相關(guān)的lncRNAs和轉(zhuǎn)錄因子弥雹，并對主要血細(xì)胞群體進(jìn)行精細(xì)分群和定義垃帅，首次提出CD74陽性的有核紅細(xì)胞可能具有免疫調(diào)節(jié)功能。
3.在線數(shù)據(jù)庫有助于我們在單細(xì)胞水平上找到某特定基因在32種血細(xì)胞的表達(dá)水平變化剪勿，以及可以利用自己的數(shù)據(jù)繪制發(fā)育分化軌跡圖譜贸诚。
總的來說，該研究圖譜全面地整合了血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息和免疫表型信息厕吉，為后續(xù)血液生理學(xué)和病理學(xué)研究提供了重要的血細(xì)胞注釋依據(jù)和參考價(jià)值酱固。