作者，Evil Genius
周末了聘殖，我們復習一下，高分文章的方法補充行瑞，文章在
(1)WES數(shù)據(jù)分析,如下
1奸腺、BWA-mem比對（GRCh38）
2、使用samtools將輸出的SAM文件轉(zhuǎn)換為BAM文件
3血久、使用Picard （v.2.6.26）排序工具對BAM文件進行排序和標記重復項洋机，并使用以下參數(shù)：CREATE_INDEX=true, SORT_ORDER=coordinate, VALIDATION_STRINGENCY=STRICT，并將所有其他設置為默認值洋魂；和參數(shù)REMOVE_ duplduplicate =true的markduplicate
4、使用samtools （v.1.14）索引對最終的BAM文件進行索引。
5副砍、體細胞突變使用Somaticwrapper管道從WES數(shù)據(jù)中調(diào)用衔肢，其中包括四個不同的調(diào)用程序：Strelka (v.2.9.10), MUTECT (v.1.1.7), VarScan (v.2.3.8)和Pindel (v.0.2.5)。文章保留了MUTECT （v.1.1.7）豁翎、VarScan （v.2.3.8）和Strelka （v.2.9.10）中任意兩個調(diào)用的外顯子單核苷酸變體（SNV）角骤，以及VarScan （v.2.3.8）、Strelka （v.2.9.10）和Pindel （v.0.2.5）中任意兩個調(diào)用者調(diào)用的插入和缺失（indel）心剥。
6邦尊、通過腫瘤中最小的VAF為0.05和正常樣本中最大的VAF為0.02來過濾SNV和indels。過濾了在同一腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)的indel的10bp內(nèi)的任何SNV优烧。
7蝉揍、使用Somaticwrapper使用COCOON （https://github.com/ding-lab/COCOONS）將相鄰的SNV組合成雙核苷酸多態(tài)性。
（2）突變映射到snRNA-seq和ST數(shù)據(jù)
分析方法：scVarScan畦娄。該工具可以通過跟蹤snRNA-seq和snRNA序列中的細胞和分子條形碼信息來識別每個細胞中支持參考等位基因和覆蓋變異位點的變異等位基因的reads又沾。工具的鏈接在https://github.com/ding-lab/10Xmapping，下面是用法
step 1: extracting reads contains the reference allele and variant allele of a somatic variant
perl 10Xmapping.pl --mapq --bam --maf --out
mapq: the mapping quality; Default 0
bam: the scRNA-seq bam path
maf: the maf file containing a list of somatic variants
out: the output file
step 2: get the corresponding table between ref allele, var allele and 10X barcode
perl parse_scrna_bc.pl $fin $fout
fin: the input file from step 1's output
fout: the output file
step 3: output number of reads supporting reference and variant alleles and VAF
perl rc.pl $fin $fout
fin: the input file from step 1's output
fout: the output file
（3）空間突變VAF統(tǒng)計檢驗
1熙卡、每個在ST上所有spot上覆蓋大于30個reads的突變,計算所有腫瘤區(qū)域spot和所有非腫瘤區(qū)域spot的VAF杖刷，即所有spot上的變異reads數(shù)除以所有spot上的總reads數(shù)。
2驳癌、使用非腫瘤斑點的VAF作為背景進行二項檢驗.
3滑燃、使用p.adjust（）函數(shù)對兩組測試進行多次測試校正。
（4）使用WES call CNV.
分析方法：GATK颓鲜、Bedtools表窘。
（5）空間轉(zhuǎn)錄組分析CNV
分析方法： InferCNV 。在樣本水平上運行intercnv（scRNA和snRNA）灾杰，并且僅使用使用原始計數(shù)矩陣的后質(zhì)量控制過濾數(shù)據(jù)蚊丐。所有非惡性細胞作為參考，注釋為“非腫瘤”艳吠，所有惡性細胞都有相同的注釋“腫瘤”麦备，參數(shù)如下：analysis_mode=“subclusters”，--cluster_by_groups=T昭娩，--noisise =T凛篙，--HMM=T。對于Visium ST數(shù)據(jù)栏渺，以200個ESTIMATE純度分數(shù)最低的注釋為“非惡性”的spot作為參考呛梆，“惡性”spot以其微區(qū)ID作為注釋，參數(shù)為：window_length=151, analysis_mode=“sample”磕诊，--cluster_by_groups=T填物，--noisise =T纹腌，--HMM=T。CalicoST (https:// github.com/raphael-group/CalicoST) 63在Visium ST數(shù)據(jù)上運行滞磺，具有相同的輸入注釋（微區(qū)ID）升薯。來自同一區(qū)域的所有spot被視為最小的分析單位。然后使用默認參數(shù)運行CalicoST击困，并手動檢查結(jié)果涎劈。
關于CalicoST，參考文章在從空間解析轉(zhuǎn)錄組學推斷等位基因特異性拷貝數(shù)畸變和腫瘤系統(tǒng)圖譜
（6）拷貝數(shù)相似度評分
改進的Jaccard相似性評分阅茶，CNV譜被定義為一組基因組窗口蛛枚，其注釋拷貝數(shù)為中性(0)、擴增(1)或缺失（?1）脸哀。然后比較兩個CNV譜蹦浦，并打破重疊的基因組窗口，使兩個譜具有相同的窗口集企蹭，將CNV相似度評分（Sim）定義為
（7）單細胞的細胞類型注釋白筹，搜集一下marker。
（8）單細胞空間聯(lián)合分析
使用默認參數(shù)和doublet_mode = ' multi '的RCTD對每個點的細胞類型組成進行反卷積谅摄。每次運行的參考是從匹配snRNA-seq或Multiome樣本的Seurat對象中手動注釋的細胞類型徒河。
（9）腫瘤邊界空間細胞-細胞相互作用
使用COMMOT和CellChat數(shù)據(jù)庫評估ST樣品中基于空間的細胞-細胞相互作用（CCI），距離閾值為1000μm送漠。比較樣本上所有腫瘤邊界spot（包括腫瘤邊界層和TME邊界層）和所有非邊界spot（Wilcoxon秩和檢驗）的每個相互作用的配體和受體信號的中位數(shù)顽照。信號差大于0.1且FDR小于0.05的相互作用被認為是顯著的邊界富集。
（10）鄰域分析闽寡，距離分析（Xenium代兵、CODEX、Visium）爷狈。
（11）空間區(qū)域注釋（morph）
