Nat Biotech | 單細胞測序鑒定小分子藥物應答機理

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撰文：huacishu

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1贾富、TraCe-seq平臺能夠通過追蹤暴露于不同EGFR靶向治療后有反應和持續(xù)存在的細胞，并進行差異基因分析和時間軌跡比較一喘。伶授。

2嬉探、研究揭示了EGFR抑制劑反應的一個令人興奮且以前未被認可的組成部分：由抑制劑結(jié)合的EGFR引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的誘導對于實現(xiàn)完全療效至關(guān)重要。

3、作者認為深入了解抑制劑結(jié)合EGFR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的生化機制有助于將來開發(fā)靶向EGFR和其他膜相關(guān)蛋白的小分子藥物行您。

近日來自Genentech Inc.的高級研究員Xin Ye博士團隊在國際知名期刊Nat Biotechnol在線發(fā)表題為“Identifying transcriptional programs underlying cancer drug response with TraCe-seq”的研究論文。針對致癌驅(qū)動基因突變的靶向治療為癌癥患者提供了顯著的臨床治療效果剪廉，并為精確醫(yī)學帶來了巨大的希望娃循。然而，并非所有攜帶這種突變的個體都有相同的抗癌反應斗蒋。盡管直接抑制致癌因子（可能是小分子激酶抑制劑成功的最好例證）仍然是精確治療的一個組成部分捌斧，但新的治療模式也在探索中。近年來吹泡，一種新的作用機制（MOA）骤星，即靶向蛋白質(zhì)降解，比傳統(tǒng)的基于占有率的靶向抑制越來越受到人們的關(guān)注爆哑。異源雙功能靶向蛋白質(zhì)降解劑洞难，即能夠同時將E3泛素連接酶招募到目標并通過泛素介導的蛋白質(zhì)水解誘導靶向降解的分子，已經(jīng)獲得了研究者的極大的興趣揭朝，并且已經(jīng)證明在特定情況下優(yōu)于單獨的酶抑制队贱。然而，目前尚不清楚雙作用抑制劑-降解劑是否具有普遍優(yōu)勢潭袱。

目前描述藥物反應和耐藥性的范例在很大程度上依賴于長期藥物暴露后的最終評估柱嫌。雖然這一過程可以有效地識別耐藥機制，但它發(fā)現(xiàn)先前存在的特征和早期適應性變化的能力有限屯换，這些特征和變化使特定亞群得以持續(xù)存在编丘。作者推斷，一個同時追蹤腫瘤細胞起源并比較腫瘤細胞對不同療法的即時反應的系統(tǒng)可以大大加速藥物反應或者耐藥性研究彤悔。這樣一個系統(tǒng)可以直接比較不同療法的療效和MOA嘉抓，從而加速未來療法的發(fā)展。為此晕窑，作者開發(fā)了TraCe-seq抑片，通過同時測量接受抗癌治療的異質(zhì)人群中的克隆適合度及其轉(zhuǎn)錄軌跡，快速捕捉治療反應的起源和早期適應性過程（圖1a）杨赤。該方法能夠在亞群和單細胞分辨率下對不同治療方式進行直接和全面的比較敞斋。為了建立TraCe-seq截汪，構(gòu)建了一個3′scRNA-seq兼容的慢病毒條形碼庫，每個條形碼由30 nt區(qū)域組成植捎。成功轉(zhuǎn)導后衙解，慢病毒載體將穩(wěn)定整合到基因組中，導致選擇標記鸥跟、嘌呤霉素抗性和增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的組成性表達丢郊，以及嵌入3′-未翻譯區(qū)域的條形碼（圖1b）。雖然靶向EGFR的小分子策略集中于抑制其酶活性医咨，但與酶抑制相比枫匾，EGFR降解的潛在結(jié)果知之甚少。為此拟淮，作者開發(fā)了GNE-104干茉，一種由EGFR抑制劑厄洛替尼連接到von Hippel–Lindau（VHL）結(jié)合部分（CRL2–VHL E3連接酶復合物的底物結(jié)合成分）組成的異源雙功能降解劑。GNE-104誘導EGFR的顯著劑量和VHL依賴性降解很泊，并有效抑制磷酸化EGFR水平（圖1c）角虫。同時還制備了一種非降解物對照品GNE-069（圖1c），該對照品不能與VHL結(jié)合并降解EGFR委造，同時保留了與GNE-104體外激酶抑制試驗中觀察到的效力和選擇性相當?shù)奶匦源炼臁Ｈ缓螅诿總€條件下接種200000個細胞昏兆，并用厄洛替尼枫虏、GNE-104或GNE-069處理它們。在第4天收集細胞爬虱，并用10x scRNA seq分析隶债，以確定每個克隆的相對適合度，并捕獲處理誘導的轉(zhuǎn)錄變化（圖1d）跑筝。為了證實TraCe-seq方法能夠準確測量基線時的相對克隆大小死讹，在DMSO中擴增了20000個條形碼細胞7天，并通過對基因組DNA進行飽和條形碼分析對這些細胞進行了分析曲梗。事實上赞警，scRNA-seq測定的克隆豐度與基因組DNA分析高度相關(guān)。治療前虏两，在基線檢查時恢復了551個條形碼（圖1e）愧旦。與觀察到的GNE-104生長抑制活性降低相一致，GNE-104處理在減少微量序列條形碼的絕對數(shù)量和多樣性方面效果較差（圖1e）碘举。此外忘瓦，盡管在所有治療條件下都觀察到類似的MAPK通路抑制（圖1f）搁廓，但厄洛替尼和GNE-069誘導的細胞周期阻滯（G0）遠遠大于GNE-104（圖1g）引颈，這表明GNE-104治療允許更多細胞持續(xù)存在MAPK通路抑制耕皮。在多個EGFR突變的肺癌細胞系中證實了GNE-104的抗生長作用降低。這種療效的喪失并非由于活性VHL配體的存在蝙场，因為10倍高濃度的游離VHL配體不會影響對厄洛替尼或GNE-069的反應凌停。

為了進一步了解PC9細胞在克隆水平上對這些處理的差異反應，作者試圖將處理過的群體與起始群體相比表現(xiàn)過度或不足的微量序列條形碼進行分類售滤。與未處理群體相比罚拟，在處理群體中過度表達的TraCe-seq條形碼被分為三類抗性克隆（圖2a）完箩，而根據(jù)對激酶抑制劑和降解物的反應赐俗，治療后代表性不足的條形碼被分為三類敏感克隆。特別是弊知，與激酶抑制劑處理相比阻逮，GNE-104處理導致一組獨特的微量序列條形碼過度表達；這些條形碼被歸類為抗降解劑（圖2a）秩彤。我們通過比較激酶抑制劑抗性克隆和激酶抑制劑敏感克隆之間的基線基因表達叔扼，進行無偏差異基因表達分析，尋找可能導致激酶抑制劑（厄洛替尼和GNE-069）抗性的先前存在的轉(zhuǎn)錄特征漫雷。與之前的報道一致瓜富，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療前，VIM和AXL在激酶抑制劑耐藥細胞中顯著上調(diào)（圖2b）降盹，證實TraCe seq成功捕獲了預期的耐藥亞群和相關(guān)分子標記与柑。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)降解物抗性克隆僅顯示AXL表達升高澎现，但未顯示VIM上調(diào)仅胞，這表明它們確實在轉(zhuǎn)錄上不同于激酶抑制劑抗性克隆（圖2b）剑辫。為了揭示什么轉(zhuǎn)錄程序可以使細胞在降解劑處理下存活干旧，又進行了無偏差基因集表達分析，比較了降解劑抗性克隆和敏感克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性中的蛋白質(zhì)加工被發(fā)現(xiàn)是降解抗性克隆和降解敏感克隆之間最顯著和最豐富的途徑（圖2c）妹蔽，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工基因表達較低的細胞可能受到GNE-104的保護椎眯。為了進一步探索與激酶抑制劑或降解物治療抗性相關(guān)的適應性轉(zhuǎn)錄程序，通過偽時間系統(tǒng)性排列治療細胞胳岂，以無監(jiān)督方式跟蹤細胞狀態(tài)演變编整，進行了軌跡推斷分析。該分析確定了具有不同過程的四條路徑（圖2d-f）乳丰。激酶抑制劑敏感克隆與激酶抑制劑抗性克隆的分布表明路徑b和c與激酶抑制劑抗性相關(guān)掌测，而路徑d代表敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIM表達沿著路徑b和c升高产园，代表對EGFR抑制的普遍抵抗（圖2f）汞斧，而MAPK路徑活性得分受到最強烈的抑制夜郁，G0/靜止細胞狀態(tài)沿著路徑d升高，與敏感性一致粘勒。與激酶抑制劑抗性克隆的分布相反竞端，降解物抗性克隆在路徑a上最為普遍（圖2e）。值得注意的是庙睡，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑中的蛋白質(zhì)加工相關(guān)的基因沿著路徑a下調(diào)（圖2f）事富，這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工基因的表達降低與EGFR降解劑處理下這些細胞的治療適應和存活相關(guān)。事實上乘陪，與這些降解物抗性克隆中的GNE-104治療相比统台，ER途徑中的蛋白質(zhì)加工是厄洛替尼治療誘導的最豐富和最重要的途徑（圖2g）。

激酶抑制劑與降解劑治療的明顯區(qū)別在于EGFR蛋白的持續(xù)存在啡邑。盡管EGFR敲除單獨導致EGFR蛋白大量丟失以及MAPK通路強烈抑制饺谬，但siRNA處理對PC9和HCC4006細胞的殺傷效果要差得多（圖3a）。此外谣拣，經(jīng)siEGFR處理的細胞對激酶抑制劑厄洛替尼和奧西米替尼的處理具有相反的作用（圖3a）募寨。這些結(jié)果進一步表明，EGFR蛋白水平的降低可能會阻礙EGFR激酶抑制劑的細胞功效森缠。為了進一步驗證這一假設(shè)拔鹰，基于與VHL結(jié)合配體連接的變構(gòu)EGFR配體EAI-045生成了EGFR降解劑GNE-641。根據(jù)分子模型和最近的一份研究贵涵，預計EAI-045將與奧西米替尼共同結(jié)合到EGFR L858R上列肢。與模型預測一致，EGFR在與osimertinib和GNE-641共處理的細胞中被有效降解（圖3b）宾茂。盡管GNE-641具有降解EGFR的能力瓷马，但其自身表現(xiàn)出非常溫和的抗生長活性。然而跨晴，GNE-641與奧西米替尼的聯(lián)合治療促進了NCI-H1975和NCI-H3255細胞的存活（圖3c）欧聘。綜上所述，這些結(jié)果表明端盆，EGFR蛋白本身在介導EGFR激酶抑制劑的完整細胞功效方面起著至關(guān)重要的作用怀骤。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)定的破壞，如蛋白質(zhì)錯誤折疊會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激焕妙。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應力超過某一閾值時蒋伦，它通過ISR PERK–ATF4–CHOP axis34發(fā)出有效的生產(chǎn)信號。假設(shè)持續(xù)存在激酶抑制劑結(jié)合的EGFR蛋白可能導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游的前體信號級聯(lián)激活焚鹊，因此有助于細胞毒性痕届。相反，EGFR降解物主動去除抑制劑結(jié)合的EGFR蛋白，從而最小化抑制劑結(jié)合的EGFR引起的應激（圖3d）研叫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)erlotinib和osimertinib顯著誘導PC9势决、HCC4006和HCC4006內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游關(guān)鍵產(chǎn)物ISR基因的表達（圖3e，f）蓝撇。此外，在通過siEGFR（圖3e）或變構(gòu)降解劑治療（圖3f）消耗EGFR蛋白產(chǎn)物后陈莽，這種誘導作用減弱渤昌。

為了進一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在EGFR激酶抑制劑療效中的作用，作者提出了以下問題：（1）阻斷ATF4–CHOP信號的誘導是否會導致對EGFR激酶抑制劑的耐藥性走搁？（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的藥理學誘導是否彌補了EGFR降解劑失去的功效独柑？為了特異性地阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游產(chǎn)生基因的過度激活，在添加EGFR激酶抑制劑之前私植，用ISR抑制劑ISRIB連續(xù)處理細胞24小時忌栅。ISRIB治療確實減弱了EGFR激酶抑制劑誘導的ATF4、DDIT3和PPP1R15A的激活（圖4b）曲稼，并降低了PC9和NCI-H1975細胞的細胞殺傷（圖4a索绪，c）。相反贫悄，在極低無毒濃度下添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑衣霉素或thapsigargin可顯著誘導產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激基因的表達瑞驱，并增強PC9細胞中降解物GNE-104的細胞毒性活性（圖4d）。當與厄洛替尼或奧西美替尼聯(lián)合應用時窄坦，PERK激活劑CCT020312進一步促進厄洛替尼和奧西美替尼誘導ISR基因表達唤反，并增強細胞死亡誘導，導致EGFR抑制劑治療后殘余細胞幾乎完全消除（圖4e–g）鸭津。這些結(jié)果強調(diào)了一種以前未被認可的提高抗EGFR治療反應的途徑彤侍，可能具有臨床意義。

總之逆趋，TraCe-seq平臺能夠通過追蹤暴露于不同EGFR靶向治療后有反應和持續(xù)存在的細胞盏阶，并進行差異基因分析和時間軌跡比較。這揭示了EGFR抑制劑反應的一個令人興奮且以前未被認可的組成部分：由抑制劑結(jié)合的EGFR引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的誘導對于實現(xiàn)完全療效至關(guān)重要闻书。深入了解抑制劑結(jié)合EGFR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的生化機制有助于將來開發(fā)靶向EGFR和其他膜相關(guān)蛋白的小分子藥物般哼。此外，作者預計TraCe-seq方法將通過揭示預測對不同分子模式或治療組合的反應和耐藥性的未知特征來指導未來治療的發(fā)展惠窄。

教授介紹

Xin Ye博士來自Genentech Inc.的高級研究員蒸眠，為血管生物學和合成抗癌免疫領(lǐng)域的研究和早期開發(fā)工作提供科學和戰(zhàn)略指導。研究領(lǐng)域包括許多人類疾病中的血管功能和功能障礙杆融，包括腫瘤學楞卡、眼科學和炎癥，以及癌癥中血管內(nèi)皮和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。還擔任Genentech研發(fā)部門的委員會成員蒋腮。在Genentech研究部內(nèi)外的血管生物學領(lǐng)域提供戰(zhàn)略指導淘捡。監(jiān)督多個進行的基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)研究。以通訊作者在相關(guān)雜志上發(fā)表論文多篇池摧。

參考文獻

hang, M.T., Shanahan, F., Nguyen, T.T.T. et al. Identifying transcriptionalprograms underlying cancer drug response with TraCe-seq. Nat Biotechnol (2021).https://doi.org/10.1038/s41587-021-01005-3