影響因子：11.7

研究概述：CD8+ T細(xì)胞在腫瘤中涵蓋了從干性吨拗、記憶满哪、效應(yīng)到功能衰竭等的一系列功能狀態(tài)，這些狀態(tài)都是由CD8+ T細(xì)胞內(nèi)在調(diào)控和腫瘤微環(huán)境（TME）共同塑造的劝篷。所以翩瓜，利用腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞（TILs）的效應(yīng)階段是許多癌癥治療方法的目標(biāo)。其中携龟，一個(gè)主要策略是阻斷主要在功能障礙的CD8+ TILs上高表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)受體兔跌，目前主要是CTLA4和PD1。盡管免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）在黑色素瘤峡蟋、肺癌和腎癌等癌癥中取得了成功坟桅，但只有12%的患者能夠響應(yīng)所有ICB。而TME是ICB響應(yīng)的關(guān)鍵決定因素蕊蝗，但其如何影響T細(xì)胞功能仍不完全清楚仅乓。這主要是因?yàn)門ME在不同的癌癥類型之間和內(nèi)部變化很大，具有不同程度的血管化蓬戚、免疫浸潤以及癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞類型的存在夸楣。這些因素會(huì)影響影響T細(xì)胞的抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)信號以及氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)子漩。因此豫喧，更好地理解多種腫瘤類型和不同TME中的CD8+ T細(xì)胞狀態(tài)，對于開發(fā)廣泛有效的治療方法至關(guān)重要幢泼。本篇研究在此紧显，作者開發(fā)了一種能夠跨細(xì)胞、患者和數(shù)據(jù)集識別的降維方法缕棵，并將其應(yīng)用于來自132例腫瘤樣本的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)孵班。作者發(fā)現(xiàn)了一種泛癌的T細(xì)胞功能障礙狀態(tài)（包括免疫檢查點(diǎn)CTLA4涉兽、PDCD1和HAVCR2，以及趨化因子受體CXCR6）篙程，其表達(dá)水平可以預(yù)測黑色素瘤隊(duì)列中ICB治療失敗枷畏。進(jìn)一步研究CXCR6的調(diào)控發(fā)現(xiàn)：它由AP-1誘導(dǎo)，并被TCF1抑制虱饿。CXCR6的敲降可促進(jìn)PD1+TIM3+ CD8+ TILs的凋亡拥诡，降低了Tox、Bcl2和CD28的表達(dá)郭厌，最終削弱了腫瘤生長控制。具體結(jié)果如下：

研究結(jié)果：

GDMF: 一種通用矩陣分解框架雕蔽，能夠跨細(xì)胞折柠、患者和數(shù)據(jù)集識別的降維方法

作者開發(fā)了一種通用矩陣分解框架（GMDF）用于大規(guī)模多樣數(shù)據(jù)集的無監(jiān)督分析。給定一組單細(xì)胞數(shù)據(jù)批狐，GMDF通過將細(xì)胞特征分解為“共享”和“特定場景”的基因扇售，識別跨條件的細(xì)胞狀態(tài)。GMDF可以在降維任務(wù)的制定和實(shí)施中結(jié)合協(xié)變量和“特定場景”嚣艇〕斜“場景”由用戶根據(jù)具體的數(shù)據(jù)集和研究問題定義，可以表示特定的癌癥類型食零、性別困乒、治療、隊(duì)列等贰谣。GMDF根據(jù)數(shù)據(jù)集內(nèi)的變異識別表達(dá)程序娜搂，如果這種數(shù)據(jù)集內(nèi)的變異在多個(gè)數(shù)據(jù)集中反復(fù)觀察到，那么它將被定義為“共享”吱抚。如果這種數(shù)據(jù)集內(nèi)的變異僅在特定“上下文”的數(shù)據(jù)集中觀察到百宇，則它將被識別為“特定場景”。通過關(guān)注“共享”而不是“特定場景”特定的程序秘豹，可以識別即使在具有不同癌腫的研究中也會(huì)重復(fù)出現(xiàn)的生物學(xué)上有意義的變異（圖A）携御。

為了繪制不同癌癥類型中的CD8+ T細(xì)胞狀態(tài)圖譜，作者匯總了來自九個(gè)數(shù)據(jù)集的泛癌scRNA-seq數(shù)據(jù)（來自132名黑色素瘤既绕、肉瘤啄刹、胰腺癌、肝癌凄贩、結(jié)腸癌鸵膏、肺癌和乳腺癌患者的33,161個(gè)CD8+ TILs）。作者將GMDF應(yīng)用于這個(gè)泛癌CD8+ T細(xì)胞數(shù)據(jù)中怎炊，識別每個(gè)隊(duì)列中反復(fù)觀察到的“共享”基因模塊谭企。作者將GMDF識別出的六個(gè)模塊注釋為初始/記憶廓译、激活/干擾素反應(yīng)、AP1/應(yīng)激反應(yīng)债查、細(xì)胞周期非区、線粒體代謝和慢性激活（圖B）。為了進(jìn)一步研究功能障礙和激活的關(guān)聯(lián)性盹廷，作者基于其整體表達(dá)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的“激活評分”征绸。隨著細(xì)胞表現(xiàn)出更高的激活評分，它們與慢性激活的評分?jǐn)?shù)值也越來越高俄占，并表現(xiàn)出更多的細(xì)胞間變異（圖1C-D管怠，T細(xì)胞被注釋為初始/記憶--低激活評分、效應(yīng)--高激活以及功能障礙）缸榄。在這里渤弛，慢性激活評分是基于與T細(xì)胞功能障礙相關(guān)的基因，包括免疫檢查點(diǎn)（HAVCR2甚带、TIGIT她肯、PDCD1、CTLA4鹰贵、LAG3和ENTPD1）晴氨、效應(yīng)基因（GZMB、IFNG和FASLG）以及轉(zhuǎn)錄因子TOX等72個(gè)基因碉输∽亚埃總的來說，慢性激活評分可以將細(xì)胞分為三種狀態(tài)：效應(yīng)敷钾，功能障礙和幼稚/記憶聚假。

“慢性激活”基因集在預(yù)測免疫治療療效的應(yīng)用

為了測試“慢性激活”基因集在泛癌的臨床價(jià)值，作者評估了黑色素瘤患者ICB治療前后CD8+ TILs的單細(xì)胞數(shù)據(jù)表達(dá)水平（圖A）闰非。與響應(yīng)者相比膘格，未響應(yīng)患者的“慢性激活”表達(dá)更高（圖A）。并且财松，“慢性激活”評分無論是在單細(xì)胞（ROC曲線下面積AUC = 0.72）還是樣本（AUC = 0.86）水平上瘪贱，都可以很好地預(yù)測黑色素瘤患者臨床ICB的應(yīng)答情況（圖B）。具體而言辆毡，在四名具有ICB應(yīng)答和ICB非應(yīng)答病灶的患者中菜秦，“慢性激活”評分顯示出ICB非應(yīng)答病灶的細(xì)胞中顯著更高的表達(dá)（圖C）。

CXCR6是泛癌“慢性激活”中功能障礙高排名基因

作者在GMDF處理過程中發(fā)現(xiàn)舶掖，在“慢性激活”基因中球昨，CXCR6排在前五位。同時(shí)CXCR6也是唯一一個(gè)在所有癌癥中一致標(biāo)記功能障礙T細(xì)胞的基因眨攘。既往文獻(xiàn)報(bào)道：CXCR6與改善的免疫反應(yīng)以及效應(yīng)和記憶T細(xì)胞的募集和遷移有關(guān)主慰。最近的研究表明嚣州，CXCR6在多種癌癥類型和慢性病毒感染中的功能障礙T細(xì)胞中表達(dá)。此外共螺，CXCR6介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞與腫瘤內(nèi)樹突狀細(xì)胞之間的相互作用在小鼠黑色素瘤模型中對于持續(xù)的腫瘤控制非常重要该肴。鑒于這些研究表明CXCR6對抗腫瘤免疫的重要性，作者將在下面的研究深入研究CXCR6藐不。作者發(fā)現(xiàn)匀哄，CXCR6主要在T細(xì)胞中表達(dá)，而其配體CXCL16主要在三種腫瘤類型（肉瘤雏蛮、肺癌和黑色素瘤）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)的髓樣細(xì)胞表達(dá)（圖A）涎嚼。并且，在所有數(shù)據(jù)集中挑秉，CXCL16在巨噬細(xì)胞中與‘’抗原加工和呈遞特征‘’共表達(dá)（圖B）法梯。這些發(fā)現(xiàn)，結(jié)合之前報(bào)道的小鼠模型數(shù)據(jù)顯示衷模，CD8+ T細(xì)胞CXCR6的表達(dá)與樹突狀細(xì)胞的CXCL16相互作用鹊汛，CXCR6- CXCL16可能介導(dǎo)小鼠和人類腫瘤中T細(xì)胞的慢性活化蒲赂。

接下來作者在B16/MC38動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)CXCR6表達(dá)水平會(huì)隨著CD8+T細(xì)胞的功能狀態(tài)和腫瘤進(jìn)展不斷變化阱冶，終末期的CD8+T細(xì)胞中CXCR6表達(dá)水平最高（圖C）。在CD8+ TILs中滥嘴，表達(dá)CXCR6的細(xì)胞水平從PD1-TIM3-（初始細(xì)胞）到PD1+TIM3-（干細(xì)胞樣PD1+TCF1+TIM3-和效應(yīng)樣PD1+TCF1-TIM3-）再到PD1+TIM3+（終末功能障礙）細(xì)胞逐漸增加（圖C）木蹬。并且，CXCR6+ TILs表達(dá)更多與效應(yīng)功能相關(guān)的CX3CR1若皱、Ki-67以及多種共抑制受體（PD1镊叁、TIM3、LAG3走触、TIGIT和CD39）和Tox等相關(guān)（圖D）晦譬。動(dòng)物模型提示，CXCR6配體CXCL16在三個(gè)腫瘤模型中的髓樣細(xì)胞中表達(dá)互广，MHCII高表達(dá)的巨噬細(xì)胞中表達(dá)最高敛腌，其次是MHCII低表達(dá)的巨噬細(xì)胞和DC亞群（圖E）。最后惫皱，作者進(jìn)一步在動(dòng)物模型探究腫瘤進(jìn)展過程中CXCR6的表達(dá)變化像樊。作者比較了在腫瘤早期和晚期階段B16Ova腫瘤中的CD8+ TILs。但隨著腫瘤進(jìn)展旅敷，PD1+TIM3-和PD1+TIM3+細(xì)胞中的CXCR6表達(dá)逐漸增加（圖F）生棍。因此，隨著腫瘤進(jìn)展媳谁，CD8+ T細(xì)胞在轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)狀態(tài)并最終達(dá)到終末功能障礙T細(xì)胞狀態(tài)時(shí)涂滴，逐漸獲得了CXCR6的表達(dá)友酱。

ICB可上調(diào)CXCR6, 并且受到TCF1抑制

上文提及，從效應(yīng)到功能障礙CD8+ TILs的CXCR6表達(dá)梯度增加氢妈。為了在受控環(huán)境下進(jìn)一步測試這一點(diǎn)粹污，作者在兩種不同的腫瘤模型（Mc38Ovahi和B16Ova）和兩種不同的ICB療法（抗PD1和抗PD-L1 + 抗TIM3）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在免疫原性強(qiáng)的Mc38Ovahi模型中首量，ICB治療后PD1+TIM3-和PD1+TIM3+ CD8+ TIL群體中表達(dá)CXCR6的細(xì)胞比例增加（圖A）壮吩。在免疫原性較弱的B16Ova模型中，ICB治療后PD1+TIM3-亞群中表達(dá)CXCR6的細(xì)胞比例增加加缘，但在PD1+TIM3+亞群中CXCR6表達(dá)差異不大（圖B）鸭叙。此外作者還發(fā)現(xiàn)，ICB治療后PD1+TIM3-細(xì)胞中包含TCF1+干細(xì)胞樣和TCF1-效應(yīng)樣細(xì)胞拣宏，有趣的是沈贝，在這個(gè)群體中，TCF1和CXCR6表達(dá)是互斥的勋乾。因此宋下，這個(gè)群體中CXCR6表達(dá)增加可能反映了ICB治療后向TCF1-效應(yīng)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。鑒于上文提及的ICB治療后CD8+ TILs中CXCR6增加以及CXCR6與TCF1的負(fù)相關(guān)辑莫，作者為了測試這一點(diǎn)学歧，從野生型WT小鼠或攜帶條件性刪除Tcf7（編碼TCF1的基因）的成熟CD8+ T細(xì)胞（Tcf7 cKO）中分離的CD8+ TILs進(jìn)行不同時(shí)間段的RNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各吨，CXCR6是WT和Tcf7 cKO細(xì)胞之間差異表達(dá)的前5個(gè)基因之一枝笨，無論在激活前還是隨后的時(shí)間點(diǎn)，表達(dá)差異逐漸減少（圖C）揭蜒。此外横浑，對WT和Tcf7 cKO小鼠的B16Ova腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞分析顯示，Tcf7 cKO細(xì)胞中CXCR6表達(dá)顯著增加屉更，特別是在PD1-TIM3-和PD1+TIM3- CD8+ TILs中（圖D）徙融。作者在蛋白水平上也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖E）。

這些結(jié)果表明Tcf7/TCF1在PD1-TIM3-和PD1+TIM3- CD8+ T細(xì)胞中抑制了CXCR6的表達(dá)瑰谜；一旦TIM3表達(dá)欺冀，TCF1水平變得微不足道，這與TCF1作為轉(zhuǎn)錄抑制子的作用一致似舵。最后脚猾，為了測試TCF1對CXCR6轉(zhuǎn)錄的抑制，作者在預(yù)測的TCF1結(jié)合位點(diǎn)周圍的1kb基因組區(qū)域中鑒定了候選轉(zhuǎn)錄因子砚哗。作者發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子中有15個(gè)在B16F10腫瘤中的CD8+ TILs中表達(dá)龙助，包括AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族的三個(gè)成員，c-Fos、c-Jun和JunD提鸟。因此军援，作者測試了AP-1轉(zhuǎn)錄因子是否可以誘導(dǎo)CXCR6表達(dá)以及這種誘導(dǎo)是否可以被TCF1抑制。通過熒光素酶結(jié)果顯示c-Fos称勋、c-Jun和JunD誘導(dǎo)了CXCR6轉(zhuǎn)錄胸哥，但在加入TCF1后，轉(zhuǎn)錄被抑制到對照水平（圖G-I）赡鲜。因此空厌，TCF1抑制了AP-1誘導(dǎo)的CXCR6表達(dá)。

維持腫瘤控制需要CXCR6

接下來作者為了研究CXCR6表達(dá)對抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞功能的影響银酬，作者利用CRISPR-Cas9在成熟的CD8+ T細(xì)胞中刪除CXCR6嘲更，并將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到攜帶表達(dá)Ova腫瘤的小鼠體內(nèi)（圖5A）。這種方法可使刪除T細(xì)胞基因時(shí)揩瞪，繞過了在發(fā)育過程中刪除基因時(shí)可能出現(xiàn)的任何補(bǔ)償機(jī)制赋朦。作者發(fā)現(xiàn)與CRISPR對照T細(xì)胞相比，在B16Ova和Mc38Ovahi模型中CRISPR CXCR6 KO T細(xì)胞未能控制腫瘤生長（圖B-C）李破，并且功能分析顯示它們在增殖（Ki-67）宠哄、促炎細(xì)胞因子生產(chǎn)（IFNg和TNF-a）或細(xì)胞毒能力（GranzymeB+CD107a+）方面也沒有差異（圖D）。然而嗤攻，與CRISPR對照細(xì)胞相比毛嫉，PD1+TIM3+ CRISPR CXCR6 KO細(xì)胞中Tox表達(dá)減少（圖E），而Tox已知會(huì)影響CD8+ TILs的生存屯曹。PD1+TIM3+ OTI細(xì)胞中表達(dá)CX3CR1的CRISPR CXCR6 KO細(xì)胞較少狱庇，且CX3CR1表達(dá)水平也趨于較低（圖F）惊畏。由于CX3CR1表達(dá)與其他免疫細(xì)胞中促生存蛋白Bcl2的表達(dá)有關(guān)恶耽，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PD1+TIM3+ CXCR6 KO OTI細(xì)胞中Bcl2表達(dá)細(xì)胞的比例和Bcl2表達(dá)水平顯著低于WT OTI細(xì)胞（圖H）颜启。在PD1+TIM3+ CXCR6 KO OTI細(xì)胞中比WT OTI細(xì)胞中有更多的凋亡細(xì)胞（Annexin V+偷俭，7AAD+）（圖I）。綜合這些數(shù)據(jù)缰盏，可以得出結(jié)論：CXCR6-CXCL16相互作用可能通過調(diào)節(jié)PD1+TIM3+細(xì)胞的生存涌萤，可能是通過改變CX3CR1和Bcl2的表達(dá)，使CXCR6 KO細(xì)胞更易凋亡口猜，因此在介導(dǎo)腫瘤清除方面效果較差负溪。

CXCR6 KO細(xì)胞中缺乏CD28共刺激

為了進(jìn)一步確定CXCR6信號如何影響T細(xì)胞，作者對WT和CXCR6 KO OTI細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序济炎。結(jié)果顯示川抡，WT與CXCR6 KO OTI細(xì)胞中富集的前三個(gè)通路是白細(xì)胞激活、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)和CD28家族的共刺激（圖A-B）须尚，而在CXCR6 KO OTI細(xì)胞中富集的通路是RNA代謝崖堤、核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成和組裝（圖C）侍咱。基因集富集分析同樣顯示密幔，WT與CXCR6 KO OTI細(xì)胞中“CD28通路共刺激”通路相關(guān)性很高（圖D）楔脯。CD28信號不僅對有效的T細(xì)胞共刺激和T細(xì)胞生存至關(guān)重要，它對ICB響應(yīng)也至關(guān)重要胯甩。因此昧廷，作者評估了在腫瘤轉(zhuǎn)移到宿主后的早期（第3天）和晚期（第8天）時(shí)間點(diǎn)WT和CXCR6 KO OTI細(xì)胞中的CD28表達(dá)（圖E）。轉(zhuǎn)移后早期偎箫，WT和CXCR6 KO OTI細(xì)胞在腫瘤組織中的頻率相似麸粮，但后來所有小鼠都顯示出更高頻率的WT細(xì)胞（圖F），前面提及的CXCR6 KO細(xì)胞凋亡增加一致镜廉。值得注意的是弄诲，這些生存差異在共轉(zhuǎn)移環(huán)境中更容易觀察到，這可能反映了CXCR6 KO細(xì)胞在同一TME中與WT細(xì)胞競爭有限的生長和生存信號的能力降低娇唯。CXCR6 KO OTI細(xì)胞中CD28+細(xì)胞的頻率在早期和晚期時(shí)間點(diǎn)都較低（圖G）齐遵，這與RNA測序數(shù)據(jù)一致（圖A）。因?yàn)镃D28共刺激直接與促生存蛋白Bcl-xL相關(guān)塔插，所以可以看到CXCR6 KO OTI細(xì)胞中Bcl-xL表達(dá)細(xì)胞的頻率和Bcl-xL表達(dá)水平較低（圖H）梗摇。最后，CXCR6 KO OTI細(xì)胞中CX3CR1表達(dá)較低（圖I）想许，證實(shí)了之前的結(jié)果伶授。總而言之流纹，這些數(shù)據(jù)表明CD28調(diào)節(jié)可能是CXCR6有助于維持抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)制之一糜烹。

研究總結(jié)：

本文研究了CXCR6在CD8+ T細(xì)胞中的表達(dá)及其在抗腫瘤免疫中的作用。研究表明漱凝，CXCR6主要在T細(xì)胞中表達(dá)疮蹦，其配體CXCL16主要由髓樣細(xì)胞表達(dá)。通過分析不同腫瘤類型和小鼠模型的數(shù)據(jù)茸炒，發(fā)現(xiàn)CXCR6表達(dá)隨著T細(xì)胞從效應(yīng)狀態(tài)向功能障礙狀態(tài)轉(zhuǎn)變而增加愕乎。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，在接受ICB治療的黑色素瘤患者和小鼠模型中壁公，CXCR6表達(dá)顯著增加感论，表明CXCR6可能在ICB響應(yīng)中發(fā)揮作用。為了研究CXCR6在抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞功能中的作用紊册，作者利用CRISPR-Cas9技術(shù)在OTI CD8+ T細(xì)胞中敲除CXCR6比肄，并將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到攜帶Ova腫瘤的小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，與對照組相比薪前，CXCR6 KO細(xì)胞未能有效控制腫瘤生長润努，盡管它們在增殖、促炎細(xì)胞因子生產(chǎn)和細(xì)胞毒性方面沒有顯著差異示括。然而铺浇，CXCR6 KO細(xì)胞中Tox表達(dá)減少，PD1+TIM3+細(xì)胞中凋亡增加垛膝，表明CXCR6可能通過影響細(xì)胞生存信號來調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)鳍侣。RNA測序分析揭示了WT和CXCR6 KO細(xì)胞之間的顯著差異，特別是CD28家族的共刺激路徑上吼拥。CD28信號對于T細(xì)胞的有效共刺激和生存至關(guān)重要倚聚。作者實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CXCR6 KO細(xì)胞在腫瘤組織中的生存能力較差凿可，且CD28和Bcl-xL表達(dá)水平較低惑折。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD28調(diào)節(jié)可能是CXCR6在維持抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制枯跑〔沂唬總的來說，本文的結(jié)果支持了：CXCR6-CXCL16相互作用通過調(diào)節(jié)PD1+TIM3+細(xì)胞的生存敛助，可能通過改變CX3CR1和Bcl2的表達(dá)粗卜，使CXCR6缺失細(xì)胞更易凋亡，因而在介導(dǎo)腫瘤清除方面效果較差纳击。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究CXCR6在抗腫瘤免疫中的作用及其作為潛在治療靶點(diǎn)提供了重要依據(jù)续扔。